百合(Lilium spp.)是单子叶植物亚纲百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)所有种类的总称^[1]。百合是世界著名的球根观赏花卉, 其花姿优美, 花色多样, 寓意美好, 可用于切花、盆花及地栽园林布景, 具有很高的观赏价值。此外, 百合还具有较高的食用和药用价值。

百合的花粉量大, 油性大, 易污染花瓣, 影响百合的观赏价值, 人工摘除花药费时又费力, 浪费人力资源。此外, 百合花粉散播在空气中易引起人们的过敏反应, 所以培育无花粉污染的百合品种是目前的研究热点。Grassotti等^[2]通过将无花粉杂种和可育株杂交, 选育出无花粉和少花粉的植株。Yamagishi^[3]通过杂交获得无花粉F₁代, 并首次建立了一套无花粉性状的遗传模式, 该研究证明百合无花粉基因是由细胞器基因组编码的, 因此可通过分离相应的基因, 来指导育种及解决花粉污染的问题。赵祥云^[4]通过辐射育种得到了雄性不育突变体植株。陆长旬等^[5]用⁶⁰Co射线辐照亚洲百合‘Pollyana’的鳞茎, 在当代植株中发现了败育花粉。

百合在杂交过程中存在杂交不亲和性, 一是受精前障碍, 花粉不能在柱头萌发或者萌发后花粉管异常, 未能到达子房与胚珠完成受精作用; 二是受精后障碍, 可完成受精作用, 但是胚胎在后期发育中畸形或者不发育, 无法形成可育的种子^[6-9]。本试验选取4份母本材料和11份父本材料, 进行常规杂交, 选育无花粉污染的百合新种质, 并以‘小小的吻’杂交组合为重点, 对影响其杂交亲和性的原因进行细胞学探究, 以期为选育观赏价值高、无花粉污染的百合新品种提供理论和技术依据。

根据王蓝青等^[10]前期的花粉量研究与后期的相关生殖特性调查研究结果, 从南京农业大学百合资源圃中选择4份母本材料:无花粉品种‘小小的吻’和‘平凡生活’, 不散粉品种‘简单华尔兹’以及花粉呈团聚状品种‘耶罗琳’, 11份父本材料:亚洲百合‘棒棒糖’‘白精灵’‘小飞碟’, 东方百合‘红线’‘西伯利亚’‘索邦’, LA百合‘莫泽尔’‘正直’, 野生百合川百合、宜昌百合、岷江百合。

于晴天上午10:00左右取百合盛花期(一般为百合花盛开的第1天)花粉, 利用张艺萍等^[11]的液体培养基法测定父本花粉萌发率。

每天下午将第2天要开放的母本百合花进行去雄处理并套袋; 然后在第2天晴朗的上午10:00左右, 选择当天开放的父本百合, 用镊子直接取其花药涂于套袋的母本柱头上; 授粉完成后用锡箔纸包裹柱头, 挂牌, 并记录杂交父、母本与杂交时间, 每个杂交组合至少杂交60朵花。

将4份母本材料与父本进行常规杂交, 记录授粉花朵数和取样(用于花粉管荧光显微试验与石蜡切片试验)后留存的花朵数。授粉70 d后, 即百合杂交蒴果变黄时, 记录蒴果膨大情况。收获蒴果后, 统计蒴果数并计算蒴果膨大率。统计杂交组合种子数和有胚种子数, 计算有胚率, 并在此基础上计算杂交亲和指数^[9]。蒴果膨大率=膨大蒴果数/授粉花数×100%, 有胚率=有胚种子数/种子数×100%, 杂交亲和指数=蒴果膨大率×有胚率×100%。

在各杂交组合中, 分别取授粉后4、24、48、72、96、120和168 h的花柱与子房各3个, 用FAA固定液固定。采用庞兰^[7]的方法, 观察花粉管生长状况, 用莱卡荧光正置显微镜观察, 并拍照记录。

在常规杂交授粉后, 每个杂交组合选取同一朵花, 用相机拍摄记录子房授粉时以及授粉2、4和7周后的状态。

分别取各组合授粉后7、10、15、20、25、30、40、50和60 d的子房各3个, 用FAA固定液固定。采用李小英等^[8]的方法, 进行石蜡切片、苯胺蓝染色、莱卡显微镜观察并拍照。

由表 1可见:11份父本单花花粉含量为42.90~161.2万粒, 其中亚洲百合‘小飞碟’最低, 宜昌百合最高, 且所有花粉均呈颗粒粉状。母本亚洲百合‘小小的吻’和‘平凡生活’无花粉, ‘简单华尔兹’不散粉, OT百合‘耶罗琳’花粉呈团聚状, 单花花粉含量为75.00万粒。花粉萌发时间与萌发率在不同百合中存在较大差异。在常温条件下, 部分野生种的花粉2 h就开始萌发, 大部分栽培品种的花粉则在3 h开始萌发, 所测百合资源花粉萌发率均在6 h左右趋于稳定。在11份父本百合材料中, 亚洲百合、东方百合系列和野生百合的花粉活力较高, 大部分花粉萌发率超过50%, 其中花粉萌发率最高的是东方百合‘索邦’, 为95.30%;最低的是LA百合‘莫泽尔’, 花粉萌发率仅为6.79%, 部分百合品种的花粉萌发情况见图 1。因此, 亚洲百合、东方百合系列和野生百合更适合作为杂交父本。

	图 1 部分百合花粉萌发情况 Fig. 1 The pollen germination of partial lilies A.简单华尔兹; B.耶罗琳; C.白精灵; D.岷江百合; E.莫泽尔; F.索邦。Pt:花粉管; Pg:花粉粒。 A. Soft Waltz; B. Yelloween; C. White Pixels; D. Lilium regale; E. Moselle; F. Sorbonne. Pt:Pollen tube; Pg:Pollen grain.
图选项

由表 2可见:以‘小小的吻’‘平凡生活’和‘简单华尔兹’3个亚洲百合作母本, 与LA百合‘正直’杂交, 其蒴果膨大率达到100%;与亚洲百合‘白精灵’‘小飞碟’‘棒棒糖’杂交, 均收获膨大蒴果; 与东方百合、OT百合杂交后, 子房在后期发育过程中萎蔫, 未观察到膨大蒴果。其中‘小小的吻’与野生百合川百合杂交, 蒴果膨大率为100%, 其他野生百合与3个母本杂交均未出现蒴果膨大。以花粉成团不易散粉的OT百合‘耶罗琳’为母本, 与其他系列百合杂交时, 只收获到半膨大的蒴果。蒴果膨大表明杂交组合可能存在亲和性。

统计有胚种子数时发现, 蒴果膨大的杂交组合后代种子有胚率并不一定高, 最高的是‘小小的吻’ב小飞碟’杂交组合, 为11.29%;有胚率最低的组合为‘平凡生活’ב棒棒糖’, 仅为1.47%, 说明这些组合的杂交亲和性均不高。而‘耶罗琳’为母本的杂交组合未收获到有胚种子, 说明‘耶罗琳’在与其他百合杂交时存在生殖障碍, 不适合作为母本。

通过比较杂交亲和指数发现, 以‘小小的吻’为母本的杂交组合亲和性较高, 10个杂交组合平均杂交亲和指数为3.61%, 其中最高的组合为‘小小的吻’ב小飞碟’, 可达11.29%。以无花粉品种‘平凡的生活’为母本的9个杂交组合平均杂交亲和指数为0.90%, 其中杂交亲和指数最高的是‘平凡生活’ב正直’, 为4.57%。以不散粉品种‘简单华尔兹’为母本的8个杂交组合的平均杂交亲和指数为0.57%。相比较来看, 亚洲百合‘小小的吻’最适合作为选育无花粉污染百合的母本。

同一母本, 在比较父本花粉活力与杂交亲和指数的关系时, 发现杂交亲和指数与父本的花粉活力大小没有相关性。以‘小小的吻’为母本的杂交组合中, 杂交亲和指数最高的组合(‘小小的吻’ב小飞碟’)、杂交亲和指数较高的组合(‘小小的吻’ב正直’)以及杂交亲和指数最低的组合(‘小小的吻’ב白精灵’), 其父本花粉活力分别为53.11%、9.6%和24.78%。

以亚洲百合系列为母本, 比较不同杂种系百合作父本与杂交亲和指数的关系时, 发现在所有具亲和性的杂交组合中, 其父本除LA百合‘正直’与川百合外, 均为亚洲百合, 说明亚洲百合与亚洲百合之间杂交有亲和性, 而亚洲百合与东方百合、OT百合杂交无亲和性。表明百合杂交亲和性与父本花粉活力无关, 主要与父母本亲缘关系有关, 来自同一杂种系列的父母本杂交亲和性高。

以‘小小的吻’为母本的杂交组合授粉取样后, 用荧光显微镜观察其花粉管生长情况。由表 3所见:在10个杂交组合中, 其中有5个组合的花粉管成功进入子房并与胚珠结合, 说明这些组合不存在受精前障碍, 杂交可能亲和; 另外5个杂交组合的花粉管则未能到达子房, 初步判定这5个组合存在受精前障碍。

对具有亲和性的‘小小的吻’ב小飞碟’杂交组合的观察显示:授粉4 h时即有花粉萌发(图 2-A); 授粉24 h时花柱中已有大量胼胝质生成(图 2-B); 授粉48 h时花粉粒大量萌发(图 2-C); 授粉72 h时花粉管到达子房(图 2-D)。初步判定该组合杂交亲和。

图 2 百合不同杂交组合花粉管生长的荧光观察 Fig. 2 Fluorescence observation of lily pollen tube growth in different hybrid combinations A—D.‘小小的吻’ב小飞碟’(A.授粉4 h时花粉在柱头萌发; B.授粉24 h花粉管曲折生长, 生成大量胼胝质; C.授粉后48 h, 花粉管成束生长, 并到达胚珠; D.授粉后72 h, 花粉管与胚珠结合); E—H.‘小小的吻’ב莫泽尔’(E.授粉4 h, 花粉在柱头萌发; F.授粉48 h, 花粉管曲折生长, 并有胼胝质生成; G.授粉96 h, 花粉管弯曲缠绕, 最长仅到达花柱的1/7处; H.授粉168 h, 花粉管亮度高, 停止生长, 最长停留在花柱1/6处)。标尺为200 μm。Pt:花粉管; Pg:花粉粒; Ov:胚珠。 A-D.'Little Kiss'×'Tiny Padhye'(A. 4 h after pollination, pollen germinated in stigma; B. 24 h after pollination, the pollen tube grows tortuously, forming large amount of callose; C. 48 h after pollination, there are a large amount of pollen tubes growing; D. 72 h after pollination, the pollen tube binds to the ovule); E-H.'Little Kiss'×'Moselle'(E. 4 h after pollination, pollen germinated in stigma; F. 48 h after pollination, pollen tube grows twisty, with callose forming; G. 96 h after pollination, the pollen tube is bent and wound, the longest reaching only 1/7 of the style; H. 168 h after pollination, the pollen tube shows high brightness, stops growing, and longest stays at 1/6 of the style). Bar=200 μm. Pt:Pollen tube; Pg:Pollen grain; Ov:Ovule.

图选项

对不亲和的‘小小的吻’ב莫泽尔’杂交组合的观察显示:在授粉4 h时有花粉在柱头萌发, 但数量较少(图 2-E); 授粉48 h时花粉管数量增多, 花粉管曲折生长, 并有胼胝质生成(图 2-F); 授粉96 h时花粉管弯曲缠绕生长, 最长仅到达花柱的1/7处(图 2-G); 授粉168 h时花粉管亮度高, 并已经停止伸长, 开始向内回长, 最长停留在花柱1/6处(图 2-H), 花粉管未到达子房, 说明‘小小的吻’与LA百合‘莫泽尔’杂交不亲和。

以‘小小的吻’为母本的10个杂交组合中, 有5个杂交组合后期子房出现膨大, 另5个子房随着时间逐渐萎蔫。

对百合杂交组合子房发育的形态学观察(图 3)发现, ‘小小的吻’ב小飞碟’杂交组合授粉后, 子房随发育时间逐渐发育膨大。与刚授粉时的子房相比, 授粉2周后的子房膨大的程度较小; 授粉4周后, 子房明显发育膨大, 直径达到1 cm左右; 授粉7周后, 子房已经完全膨大, 直径达到2~3 cm, 此时子房发育基本成熟。

	图 3 百合不同杂交组合的子房形态发育过程 Fig. 3 The morphogenetic development of lily ovary in different hybrid combinations A—D:‘小小的吻’ב小飞碟’‘Little Kiss’בTiny Padhye’; E—H:‘小小的吻’ב莫泽尔’‘Little Kiss’בMoselle’. A、E:授粉时At pollinating; B、F:授粉后2周Two weeks after pollination; C、G:授粉后4周Four weeks after pollination; D、H:授粉后7周Seven weeks after pollination.
图选项

而‘小小的吻’ב莫泽尔’杂交组合授粉后的子房则随着时间的延长逐渐萎蔫。授粉后2周的子房与刚授粉时的子房相比, 大小没有太大的差别; 而授粉后4周子房开始干瘪; 授粉7周后子房已经明显萎蔫枯死。这些与前面花粉管荧光显微观察结果相符合, 进一步说明花粉管未到达子房的组合杂交不亲和。

观察有胚率最高的杂交组合‘小小的吻’ב小飞碟’的授粉后子房的石蜡切片, 结果(图 4)显示, 既可观察到正常的胚胎发育过程, 也能观察到异常的胚胎发育过程。在正常胚胎发育的过程, 授粉7、10和15 d时, 部分胚囊已经完成了双受精作用, 但合子仍处于休眠状态, 未见明显的发育变化, 子房中仅能看到合子胚, 未能见到杂交组合胚胎早期发育的过程; 从授粉20 d开始可观察到早期梨形胚, 形状类似于棒形, 胚乳围绕在胚周围; 授粉25 d, 早期梨形胚前端细胞分裂增多, 前端膨大, 形状偏向梨形; 授粉30 d, 胚形偏向于盾形, 胚乳细胞开始填充胚囊; 授粉40 d, 胚由盾形胚往成熟胚转变, 胚向胚乳深处滑动; 授粉50 d, 胚已发育成成熟胚, 胚柄解体, 胚被胚乳包围。

图 4 ‘小小的吻’ב小飞碟’杂交后代胚胎发育观察 Fig. 4 Observation of embryonic development of hybrid offspring from'Little Kiss'×'Tiny Padhye' A.授粉7 d的子房, 可见合子胚; B.授粉10 d的子房, 合子胚; C.授粉15 d的子房, 合子胚; D.授粉20 d的子房, 可见梨形胚; E.授粉25 d的子房, 梨形胚前端微膨大; F.授粉30 d的子房, 可见盾形胚; G.授粉40 d的种子, 可见包裹于胚乳中的盾形胚; H.授粉50 d的种子, 可见成熟胚。I.授粉20 d的子房, 空胚囊, 未见胚及胚乳的痕迹; J.授粉30 d的子房, 可见胚乳及空胚囊; K.授粉50 d的种子, 可见少量胚乳, 没有胚; L.授粉60 d的种子, 没有胚与胚乳的空胚囊。Em:胚; End:胚乳; Es:胚囊; Sus:胚柄。 A. Ovary pollinated for 7 days, with zygotic embryo visible; B. Ovary pollinated for 10 d, with zygotic embryo; C. Ovary pollinated for 15 d, and zygotic embryo; D. The ovary after 20 d pollination can be seen with pear shaped embryo; E. Ovary after pollination of 25 d, the front of pear-shaped embryo was slightly expanded; F. Ovary after 30 d pollination, shield embryo can be seen; G. The seed after 40 d pollination, and the shield embryo can be seen wrapped in the endosperm; H. The mature embryos can be seen in seeds that are pollinated for 50 d; I. Empty embryo sac, no trace of embryo and endosperm was found in the ovary of pollinated 20 d; J. Ovary after 30 d pollination, with endosperm and empty embryo sac; K. Seeds that are pollinated for 50 d have a small amount of endosperm and no embryo; L. The seeds after 60 d pollination, empty embryo sac without embryo and endosperm. Em:Embryo; End:Endosperm; Es:Embryo sac; Sus:Suspensor.

图选项

在异常的胚胎发育过程中, 授粉20和30 d的切片中, 未观察到胚的存在, 只观察到空胚囊; 授粉50 d的种子中, 能观察到胚乳的存在, 但未观察到胚的存在; 而在授粉60 d的种子中, 则未观察到胚与胚乳的存在, 仅观察到空胚囊。

百合在国内外鲜切花市场上占有重要的地位, 经济价值显著^[12]。但当前市面上观赏性强的百合品种大部分都是有花粉品种, 除了重瓣百合外, 花瓣数正常的无花粉百合品种几乎没有。目前已有的无花粉百合及不易散粉百合品种均需从国外进口, 国内尚无自主培育的品种, 因此培育无花粉污染百合新种质是一项很重要的育种任务。

现阶段选育无花粉污染种质资源最常用的方法还是常规杂交育种。利用筛选出的无花粉污染品种与具有优良性状的观赏品种进行常规杂交, 是选育出具有优良性状的无污染百合品种的有效途径。吴建设等^[13]以引进的无花粉观赏向日葵品种与观赏向日葵杂交, 选育出F₁代无花粉的观赏型向日葵新品种‘闽葵3号’; Grassotti等^[2]曾通过将无花粉百合杂种和可育株杂交, 选育出了无花粉和少花粉的百合植株, 其杂交结果显示用常规杂交育种选育无污染百合具有较大的可行性。但是我们通过计算杂交亲和指数发现, 不同的无花粉百合作母本, 它们之间的杂交亲和性存在差异。其中以亚洲百合‘小小的吻’作母本时杂交亲和性最高, 获得的有胚种子数最多。而亚洲百合‘简单华尔兹’或‘平凡生活’作母本时, 杂交亲和性均不高。同样, 作为父本的不同百合材料在花粉活力、观赏特性、生殖特性等方面也各不相同。目前市面上很多百合品种的花粉不具有可育性, 本试验中挑选的父本, 花粉活力最高的品种为‘索邦’, 花粉萌发率为95.30%;最低的品种为‘正直’, 花粉萌发率为9.6%。因此在育种过程中, 选择合适的父母本至关重要。

通过对‘小小的吻’作母本的杂交组合进行荧光显微观察发现, 目前影响无花粉污染百合杂交亲和性的因素主要是受精前障碍, 即花粉管不能到达子房, 精细胞无法与卵细胞结合完成受精作用。以‘小小的吻’作母本的10个杂交组合中, 5个组合的子房膨大, 收获到有胚种子; 另5个组合授粉后, 子房逐渐萎蔫, 子房萎蔫的原因均为受精前障碍。花粉管进入柱头后, 花粉管先端发生胼胝质沉积, 停止生长; 或花粉管发生缠绕、分叉、先端膨大、变小等异常现象导致生长缓慢, 未能进入子房。目前对于如何克服百合杂交的受精前障碍问题前人已有很多的研究, 使用最多的是切割花柱法^[14-16], 但由于不同百合花粉萌发的花粉管长度不一, 所以切割花柱的长度无法确定, 且该方法坐果率低, 因此在此基础上, 又发展了嫁接花柱的方法^[17-18]。

另外5组不存在受精前障碍的杂交组合均收获到有胚种子, 说明都具有一定的亲和性, 但种子有胚率均不高, 说明后期胚胎发育存在异常情况。对有胚率最高的组合进行石蜡切片观察, 发现胚胎发育过程中既存在胚胎正常发育情况, 也存在胚胎发育异常情况。

百合胚胎发育主要经过合子胚、梨形胚、盾形胚、成熟胚4个阶段, 百合胚发育所需的营养初期主要是通过胚柄从珠心和珠被中吸收, 当胚体内部开始分化, 胚柄解体, 胚后期的进一步发育所需的营养则主要是由胚乳细胞提供^[8]。百合为双受精植物, 卵细胞受精发育形成胚, 极核受精发育成胚乳。观察胚胎异常发育情况时, 发现大部分切片只能观察到空胚囊, 胚囊中不存在胚乳与胚, 说明未完成双受精作用; 少数切片中仅能观察到胚乳, 说明仅存在极核受精; 未观察到只产生胚而未产生胚乳的卵受精情况, 说明在‘小小的吻’作母本的杂交组合中, 主要存在的问题是双受精比率较低。对于受精后障碍的克服, 目前研究的也较多, 主要有胚培养、胚珠培养和子房培养, 其中胚培养最有效, 即通过剥离胚胎进行离体培养获得杂种个体^[19-20]。

目前国内无花粉污染百合的选育工作任重道远, 除了选育无花粉百合外, 也可以考虑选育花粉油性大、易成团、不易散粉的百合品种, 但目前相关育种进展相对迟缓。我们的试验结果显示所选择的父本与母本‘耶罗琳’杂交均无亲和性。后期工作除了筛选父母本, 也需要深入研究不同类型百合柱头的可授性等相关因素, 并结合选择不同的授粉方法与杂交方式来提高杂交亲和性, 也可以考虑采用分子育种和诱变育种等手段, 从而达到选育优异百合种质资源的目的。