南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (5): 827-834   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201902005
0

文章信息

娄志英, 王云鹏, 袁启明, 张露露, 顾沁, 王暄, 伍辉军, 高学文
LOU Zhiying, WANG Yunpeng, YUAN Qiming, ZHANG Lulu, GU Qin, WANG Xuan, WU Huijun, GAO Xuewen
生防假单胞菌Pf-5对秀丽隐杆线虫的毒性及其作用机制
Toxicity and nematicidal mechanism of Pseudomonas protegens Pf-5 against Caenorhabditis elegans
南京农业大学学报, 2019, 42(5): 827-834
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(5): 827-834.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201902005

文章历史

收稿日期: 2019-02-18
生防假单胞菌Pf-5对秀丽隐杆线虫的毒性及其作用机制
娄志英1 , 王云鹏2 , 袁启明1 , 张露露1 , 顾沁1 , 王暄1 , 伍辉军1 , 高学文1     
1. 南京农业大学植物保护学院/农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室, 江苏 南京 210095;
2. 江苏省益生制剂重点建设实验室/淮阴工学院, 江苏 淮安 223003
摘要[目的]本文旨在研究生防假单胞菌(Pseudomonas protegens)Pf-5菌株的杀线虫活性,以及鉴定其产生的主要杀线虫活性物质。[方法]采用基于sacB基因的蔗糖致死无标记突变体系,构建Pf-5菌株的相关突变体;以模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为作用对象,利用绿色荧光蛋白基因对菌株进行标记,研究菌株对秀丽隐杆线虫的致死效果;利用扫描和透射电镜研究Pf-5菌株杀线虫物质的作用机制。[结果]Pf-5菌株对秀丽隐杆线虫具有很强的致死活性,用不同浓度的Pf-5菌液处理线虫,48 h对秀丽隐杆线虫的致死中浓度(LC50)为4.92×107 CFU·mL-1,96 h LC50为3.58×106 CFU·mL-1;处理48 h时,野生型Pf-5菌株对秀丽隐杆线虫的致死率达到73.57%,而突变体Pf-5ΔfitD的致死活性显著下降,只有25.04%;Pf-5菌株fitD基因的Delivery结构域和CROPS结构域缺失突变体对线虫的致死活性也显著下降,表明FitD蛋白是Pf-5菌株的主要杀线虫物质。扫描电镜结果表明,Pf-5菌株及其突变体都不会破坏线虫的体壁;透射电镜的结果则表明,Pf-5菌株导致线虫肠道绒毛变薄和脱落,而突变体Pf-5ΔfitD则没有此效果。[结论]生防假单胞菌Pf-5菌株中杀线虫物质为FitD蛋白,初步表明其作用位点在肠道部位。
关键词生防假单胞菌Pf-5   fitD基因   杀虫毒素   秀丽隐杆线虫   
Toxicity and nematicidal mechanism of Pseudomonas protegens Pf-5 against Caenorhabditis elegans
LOU Zhiying1, WANG Yunpeng2, YUAN Qiming1, ZHANG Lulu1, GU Qin1, WANG Xuan1, WU Huijun1 , GAO Xuewen1    
1. College of Plant Protection/Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Jiangsu Provincial Key Construction Laboratory of Probiotics Preparation/Huaiyin Institute of Technology, Huai'an 223003, China
Abstract: [Objectives] This paper aimed to study the nematicidal activity of the Pseudomonas protegens Pf-5, and to identify the major nematicidal compounds produced by this strain. [Methods] The unmarked deletion mutants of Pf-5 were constructed based on sucrose-induced(sacB gene)lethalality. The model nematodes Caenorhabditis elegans was used as the target. The strains were labeled with green fluorescent protein gene to study the lethal effect of the strain on this nematode. The possible action site of Pf-5 strain was observed by using scanning and transmission electron microscopy. [Results] The Pf-5 strain had strong lethal activity against C.elegans. The LC50 of Pf-5 against C.elegans at 48 h and 96 h, was respectively 4.92×107 CFU·mL-1 and 3.58×106 CFU·mL-1. When treated C.elegans with Pf-5 for 48 h, the lethal rate was 73.57%, but when fitD gene was knocked out, the lethal activity of Pf-5ΔfitD was significantly reduced, only 25.04% compared to the wide type. When Delivery domain and CROPS domain of fitD gene were respectively deleted, the lethal activity of mutants also significantly decreased. This indicated that the FitD protein was the major nematicidal substance produced by Pf-5 strain. Scanning electron microscopy showed that Pf-5 strain and its mutant did not destroy the body wall of nematode. But when observed using transmission electron microscopy, the results had showed that the intestinal villi of nematode became thinner, and even fell off, but the mutant Pf-5ΔfitD didn't have such effect. [Conclusions] The nematicidal substance in the P. protegens Pf-5 strain is the FitD protein, and its site of action is the intestinal tract.
Keywords: Pseudomonas protegens Pf-5    fitD gene    insecticidal toxin    Caenorhabditis elegans   

植物寄生线虫是一类世界性分布的重要植物病原物, 造成的经济损失每年高达1 570亿美元[1]。其中, 根结线虫(Meloidogyne spp.)侵染植物后, 会造成植物根部形成由巨细胞组成的根结, 严重时导致植物生长受到抑制, 萎蔫, 甚至枯萎死亡[2]。根结线虫病目前已经成为设施蔬菜连作最主要的障碍因素之一。大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)侵染大豆后, 在须根上形成大量的孢囊, 严重时导致地上部位明显矮化、不能结荚或结荚少, 该病害已成为危害大豆生产最严重的病害之一[3]。目前, 植物线虫病害的主要防治方法有化学防治、物理防治以及生物防治。化学杀线虫剂主要有熏蒸剂和非熏蒸剂2大类。熏蒸剂杀虫效果彻底, 防病增产效果显著, 但会经食物链在动物体内富集, 不利于环境的可持续发展[4]。非熏蒸剂一般是内吸性的, 会危害植物自身, 因此只能在播种前使用, 只起到预防作用[5]。物理防治主要采用暴晒、水淹、灌注热水和微波辐射等方法, 可在一定程度上抑制田间线虫病的发生率, 但是以上有些方法不仅难以彻底有效杀灭土壤深层线虫, 而且不便于中国传统田间操作[6]。植物线虫病害的生物防治主要是利用线虫天敌、微生物和植物产生的拮抗性代谢物等。线虫病害的生物防治, 具有对环境友好和可持续性等优点, 已成为杀线虫剂的重要研究方向之一。

已有报道表明, 许多生防细菌具有杀线虫活性。其中, 报道较多的是芽胞杆菌(Bacillus spp.)和假单胞菌属(Pseudomonas spp.)的生防菌。在生防芽胞杆菌方面, 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B1619对设施蔬菜根结线虫病具有较高防效[7]。解淀粉芽胞杆菌XZ-173对根结线虫有致死活性, 并且能抑制卵孵化, 还能够显著降低番茄根上的根结数和卵囊数, 促进番茄地下部根系和地上部植株的生长[8]。枯草芽胞杆菌(B.subtilis)OKB105菌株对爪哇根结线虫(M. javanica)具有较高的致死活性, 并且该活性物质来自嘌呤生物合成中的代谢产物[9]。在生防假单胞菌方面, 铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)能够显著抑制爪哇根结线虫的生长与繁殖, 减少根结线虫数量, 从而很大程度上降低根结指数[10-11]。该类菌产生的弹性蛋白酶和绿脓菌素在杀秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中起着重要作用[12]。假单胞菌MB03对秀丽隐杆线虫和南方根结线虫都具有很强的致死活性[13]。恶臭假单胞菌(P.putida)1A00316具有诱导番茄抗南方根结线虫的活性[14]

假单胞菌(P.protegens)Pf-5菌株, 先前命名为荧光假单胞菌(P.fluorescens)Pf-5。该菌株分离自棉花根际土壤, 对卵菌、真菌和细菌等引起的植物病害具有较好的防治效果, 是研究生防假单胞菌的模式菌株[15]。Pf-5菌株能产生2, 4-二乙酰基间苯三酚(2, 4-diacetylphloroglucinol, DAPG)、硝吡咯菌素、藤黄绿脓菌素(pyoluteorin, Plt)、根菌素(rhizoxin)和脂肽类物质(orfamide A)等抑菌活性物质, 这些物质在其防治植物病害中起着重要作用[15]。其中, DAPG还能诱导植物产生系统抗性(induced systemic resistance, ISR)[16]。前期我们发现Pf-5对南方根结线虫具有一定的致死活性。为了进一步对其抑制线虫的机制进行研究, 我们利用模式生物秀丽隐杆线虫开展后续研究工作。秀丽隐杆线虫具有遗传背景清楚, 结构简单, 繁殖效率高, 培养条件简单, 身体透明、便于观察等优点, 现已经广泛应用于药剂的高通量筛选。该模式线虫在研究生防菌的杀线虫机制中也有相应的研究报道, 如通过生防菌苏云金芽胞杆菌与秀丽隐杆线虫的互作体系, 发现该生防菌Cry6Aa毒素诱导的线虫细胞坏死需要天冬氨酸蛋白酶的参与[17]; 还鉴定到该生防菌金属蛋白酶Bmp1具有杀线虫活性[18]。本研究通过建立生防假单胞菌Pf-5菌株与秀丽隐杆线虫互作体系, 鉴定该菌株产生的杀线虫活性物质, 研究其作用机制, 旨在为开发新型环保线虫生防制剂提供理论支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料及供试菌株

P.protegens Pf-5由俄勒冈州立大学的Joyce E. Loper教授馈赠。秀丽隐杆线虫野生型N2由华中农业大学的鞠守勇博士提供。试验中所涉及的质粒保存在大肠杆菌Top10中。本研究所用的菌株和质粒见表 1。引物序列见表 2, 由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。试验中抗生素的使用浓度为:氨苄青霉素(Ap)100 μg · mL-1, 卡那霉素(Km)50 μg · mL-1。试验所用的酶购于TaKaRa公司; 细菌基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司; 质粒提取试剂盒、切胶回收试剂盒均购于捷倍思生物公司。

表 1 本研究所用菌株及质粒 Table 1 Bacterial strains and plasmid used in this study
菌株/质粒Strains/Plasmids 相关特性Characteristics 来源Source
Pseudomonas protegens
    Pf-5 Wild type Joyce E. Loper
    Pf-5ΔfitD ΔfitD mutant of Pf-5 This study
    Pf-5(gfp) This study
    Pf-5ΔfitD(gfp) This study
    Pf-5 fitDΔD Mutation the Delivery region of fitD gene in Pf-5 strain This study
    Pf-5 fitDΔDC Mutation the Delivery and CROPS region of fitD in Pf-5 strain This study
Escherichia coli
    Top10 For cloning the genes and constructing vectors Laboratory stock
    OP50 For culture the C.elegans Laboratory stock
Plasmids
    pK18mobsacB Vector, Apr This study
    pRK-2013 Vector, Km This study
表 2 本研究中所使用的引物 Table 2 The primers used in this study
引物Primer 引物序列Primer sequence(5′→3′)
fitD F1 GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTTCCGGTTCCGGCAAATC(BamHⅠ)
fitD F2 TGCCTGCAGGTCGACTCTAGATCAGTCCTTCATCTGCAGCGC(XbaⅠ)
fitD F3 AAGGACTGATCTAGAGTCGACATGAGCAAACCCATGAATTCG(XbaⅠ)
fitD F4 ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTGAGACCGCGATGCAGGT(HindⅢ)
fitD outF TGCGCCAGCTGGATCTGG
fitD outR TGGTTGGAGATGATCGAC
fitDΔD F1 CGCGGATCCAGAAGCTGTTCCTGGCCT(BamHⅠ)
fitDΔD F2 TGTTGCTTGCCGACAGTTTGCTCCACCTGGCGGCGTT
fitDΔD F3 AACGCCGCCAGGTGGAGCAAACTGTCGGCAAGCAACA
fitDΔD F4 CCCAAGCTTACACCGGCAGCGCACTCTT(HindⅢ)
fitDΔD outF CCTCAGTGAAGACTTCCG
fitDΔD outR CTTGCAGCGCGGACGAT
fitDΔDC F1 CGCGGATCCAGAAGCTGTTCCTGGCCT(BamHⅠ)
fitDΔDC F2 GGTCATCCTGAGGAGCATTGTGCTCCACCTGGCGGCGTT
fitDΔDC F3 AACGCCGCCAGGTGGAGCACAATGCTCCTCAGGATGACC
fitDΔDC F4 CCCAAGCTTTTGGATCTAACACCGGGAAA(HindⅢ)
fitDΔDC outF CCTCAGTGAAGACTTCCG
fitDΔDC outR CAGCAGTGGGACGACAA
注:酶切位点用下划线表示。
Note:Restriction sites in primers are underlined.
1.2 秀丽隐杆线虫培养和同期化

用大肠杆菌(E.coli)OP50培养秀丽隐杆线虫[19]。具体步骤如下。

1.2.1 含E.coli OP50平板的制作

E.coli OP50的活化平板中, 挑取单菌落接种到20 mL LB液体中, 37 ℃、140 r · min-1培养10 h左右。取100 μL培养液涂布于线虫生长培养基(nematode growth medium, NGM)(1.7 g · L-1琼脂粉, 2.5 g · L-1蛋白胨, 25 mmol · L-1 NaCl, 50 mmol · L-1 KH2PO4(pH6.0), 5 μg · mL-1胆固醇, 1 mmol · L-1 CaC12, 1 mmol · L-1 MgSO4)[20]上, 平板倒置于37 ℃恒温箱中培养10 h, 制成含菌平板。该含菌平板放在4 ℃可以保存7 d。

1.2.2 秀丽隐杆线虫的喂养及传代

从线虫培养平板中挑取1 cm×1 cm大小的培养块, 接种到含E.coli OP50的NGM固体培养基上, 20 ℃恒温培养箱中培养传代。

1.2.3 秀丽隐杆线虫同期化

秀丽隐杆线虫转接培养4 d后, 选取虫卵和孕期成虫分布密集, 但没有幼虫孵化或者孵化率极低的线虫培养板, 加入2 mL无菌水, 将平板倾斜放置, 收集板上的虫卵和孕期成虫至15 mL离心管中, 若残留在平板上卵和线虫比较多, 则用水再次冲洗并收集, 2 000 r · min-1离心1 min; 保留沉淀虫卵和成虫, 加入3 mL线虫裂解缓冲液(0.5 mol · L-1 NaOH, 50 mL · L-1 NaOCl), 放置8 min左右, 期间可以放到涡旋混匀器上加速线虫裂解, 直到线虫虫体破裂时, 向离心管中添加5 mL灭菌水, 2 000 r · min-1离心1 min, 离心管垂直放置10 min, 使虫卵完全沉降, 用移液枪轻轻吸除上清液, 再用5 mL灭菌水洗涤2次; 在沉淀中添加5 mL M9缓冲液(4.2 mmol · L-1 Na2HPO4, 2.2 mmol · L-1 KH2PO4, 8.55 mmol · L-1 NaCl, 0.9 mmol · L-1 MgSO4), 用移液枪轻柔吹打均匀, 3 000 r · min-1离心1 min; 用移液枪轻柔吸去上清液, 再次加入2 mL M9缓冲液继续洗涤2次, 最后加入1 mL M9缓冲液后, 将离心管放到20 ℃恒温培养箱中旋转培养16 h, 即可得到L1(1龄)幼虫。在无菌条件下将L1幼虫均匀接种到含E.coli OP50的NGM培养板中, 吹干多余水分, 20 ℃恒温培养箱放置44 h, L1幼虫成长为L4(4龄)线虫。

1.3 Pf-5菌株突变体的构建和验证

采用三亲交配的方法[21]构建Pf-5菌株突变体, 使用自杀载体pK18mobsacB。首先以Pf-5基因组为模板, 以引物fitD F1和fitD F2扩增得到大小为616 bp的交换左臂, 克隆到pK18mobsacB的BamHⅠ和XbaⅠ位点, 测序确定左边正确后, 得到载体pK18fitDL; 然后再用fitD F3和fitD F4引物扩增得到大小为1 184 bp的右臂, 克隆到pK18fitDL的XbaⅠ和HindⅢ位点, 测序确定右臂正确后, 获得载体pK18fitDLR。通过三亲交配的方法将重组质粒, 以单交换的方式插入到基因组中, 得到单交换子, 再利用蔗糖筛选得到无抗性的二次交换子。对这些转化子利用外围引物fitD outF和fitD outR进行验证, 通过电泳条带的变迁以及测序验证, 最终获得正确的Pf-5ΔfitD突变体。

Pf-5 fitDΔD和Pf-5 fitDΔDC突变体的构建和验证也采用类似的方法进行。不同的是突变载体中的交换左、右臂的融合采用重叠PCR进行, 获得的片段克隆到pK18mobsacB的BamHⅠ和HindⅢ位点。Pf-5菌株及其突变体的绿色荧光蛋白基因标记, 采用电转化进行遗传操作, 载体为pBBR-GFP。

1.4 Pf-5菌株及其突变体对秀丽隐杆线虫的毒力测定

使用96孔微量培养板, 每个生测孔中包括:170 μL M9缓冲液, 5 μL 8 mmol · L-1 5-氟-2′-脱氧尿苷(5-fluoro-2′-deoxyuridine, FUdR), 对照组加入D600为0.6的E.coli OP50 20 μL; 试验组中, 分别加入D600为0.6的Pf-5菌株或其突变体各20 μL。混合均匀后每个孔中有195 μL混合物, 最后加入5 μL L4幼虫(每孔约40头)。将生测板放入铺有湿润滤纸的培养皿中, 20 ℃培养, 分别在处理6、12、24、48和96 h, 在解剖显微镜下观察, 并统计死亡虫数; 采用铂金丝触碰线虫, 排除假死的线虫, 记录死亡数量, 以校正死亡率。死亡率=(死亡虫数/供试虫数)×100%;校正死亡率=(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100%。最后用SPSS Statistics 22软件进行回归分析, 计算致死中浓度(LC50)。

2 结果与分析 2.1 Pf-5菌株菌悬液对秀丽隐杆线虫的杀虫活性

用Pf-5菌株菌悬液喂食模式线虫秀丽隐杆线虫, 死亡的虫体身体僵直, 体内出现空泡, 延长处理时间, 虫体由内到外会慢慢消解; 而用大肠杆菌喂养的秀丽隐杆线虫, 虫体自然卷曲, 游动自如, 能在培养基中自由活动(图 1)。

图 1 Pf-5菌株菌悬液对秀丽隐杆线虫活力的影响(在体式镜下观察) Fig. 1 The effect of Pf-5 suspension on the activity of Caenorhabditis elegans(observed under stereomicroscopy)

用不同浓度的Pf-5菌株菌悬液喂食秀丽隐杆线虫, 在不同时间段观察线虫的死亡情况。结果表明:在同一浓度下, 随着时间的增加, 线虫死亡率逐渐升高; 在同一时间段, 菌悬液浓度越高线虫死亡率越高。48 h时, 浓度为105和106 CFU · mL-1菌液处理线虫的死亡率超过45%, 而高剂量菌液(107~108 CFU · mL-1)的死亡率则高达80%(图 2)。经统计分析表明:48 h时, Pf-5菌株对秀丽隐杆线虫的LC50为4.92×107 CFU · mL-1, 96 h的LC50为3.58×106 CFU · mL-1, 死亡率与浓度以及时间呈正相关性。

图 2 不同浓度的Pf-5菌株菌悬液对秀丽隐杆线虫的致死活性 Fig. 2 The lethal activity of different concentrations of Pf-5 suspension against to the C.elegans
2.2 Pf-5菌株中杀线虫活性物质的鉴定

据文献报道, 荧光假单胞菌(P.protegens)CHA0菌株fit基因簇中产生的FitD蛋白具有杀螟虫的活性[22], 而Pf-5菌株与该菌株背景相似。为了确定Pf-5菌株中的FitD在线虫活性中的作用, 我们构建了Pf-5ΔfitD突变体。活性检测表明:用同一浓度的菌悬液处理线虫, 24 h时, 野生型Pf-5菌株对秀丽隐杆线虫致死率达到51.26%, 而突变体Pf-5ΔfitD只有20.60%, 与野生型相比差异显著; 当处理时间为48 h时, 野生型Pf-5菌株对线虫的致死活性达到73.57%, 而突变体Pf-5ΔfitD的活性也只有25.04%, 与野生型相比差异显著(图 3)。这表明, FitD蛋白在Pf-5菌株的杀线虫活性中起着主要作用。

图 3 Pf-5菌株及其突变体对秀丽隐杆线虫的致死活性 Fig. 3 The lethal activity of Pf-5 strain and its mutant against to C.elegans 不同小写字母表示同一时间不同处理差异显著(P < 0.05)。下同。 Different lowercase letters indicate significant difference in treatment at the same time(P < 0.05).The same as follows.
2.3 突变fitD基因对Pf-5菌株在线虫体内定殖的影响

为了研究fitD基因是否影响Pf-5菌株进入线虫体内以及定殖能力, 我们利用绿色荧光蛋白编码基因对相关菌株进行了标记。荧光观察结果表明, 野生型Pf-5和突变体Pf-5ΔfitD都能成功进入线虫体内和肠道部位(图 4-A)。我们对每头线虫体内的含菌量进行检测。结果表明:每头线虫含野生型Pf-5和突变体Pf-5ΔfitD的量在数量级上没有明显差异(图 4-B), 说明fitD基因不影响Pf-5在线虫体内定殖。

图 4 Pf-5菌株及其突变体在秀丽隐杆线虫的定殖 Fig. 4 Colonization of Pf-5 strain and its mutants in C.elegans A.普通显微镜和荧光显微镜观察结果; B.虫体内细菌数量。 A. Observations by ordinary microscope and fluorescence microscope; B. The number of bacteria in the C.elegans.
2.4 FitD蛋白结构域对其杀线虫活性的作用

结构预测(图 5-A)表明, FitD蛋白含有4个典型的功能结构域。其中, 糖基转移酶结构域(glucosyltransferase domain, GTD)可能起到抑制宿主GTPase的活性; 自激活结构域(autoprotease domain, APD)在结合肌醇-6磷酸之后诱导蛋白发生自我剪切, 释放活性区域; Delivery结构域与ToxA具有相似性, 可能具有细胞膜的打孔功能, 从而杀死寄主, 是该蛋白杀线虫的核心区域; CROPS结构域可能负责与细胞膜上的受体结合, 但受体种类未知。为进一步研究FitD蛋白中关键结构域对其杀线虫活性的影响, 我们突变了Pf-5菌株fitD基因中编码的Delivery和CROPS结构域。活性测定表明:突变体Pf-5fitDΔD和Pf-5fitDΔDC与野生型Pf-5相比, 在12 h的杀线虫活性并没有显著差异; 但在24 h时, 2个结构域突变体杀线虫活性下降明显, 与野生型差异显著, 尤其是Delivery和CROPS双缺失突变体, 但Pf-5fitDΔD和Pf-5fitDΔDC之间差异不显著(图 5-B)。这说明Delivery和CROPS结构域对FitD蛋白的活性起着关键作用。

图 5 FitD结构预测(A)及Pf-5菌株及其FitD结构域缺失突变体对秀丽隐杆线虫的致死活性(B) Fig. 5 FitD structure predicts (A)and the lethal activity of Pf-5 strains and their FitD domain mutants against C.elegans(B) GTD:糖基转移酶结构域; APD:自激活结构域; Delivery:可能具有细胞膜的打孔功能; CROPS:结构域可能负责与细胞膜上的受体结合。 GTD is glucosyltransferase domain; APD is autoprotease domain; Delivery may have cell membrane perforation function; CROPS domain may be responsible for binding to receptors on the cell membrane.
2.5 Pf-5菌株对秀丽隐杆线虫体壁及其肠道的影响

为了研究Pf-5菌株中FitD蛋白的作用机制, 本研究分别利用扫描电镜和投射电镜对处理之后的线虫进行观察。扫描电镜观察结果(图 6-A)显示:在处理时间内, 野生型Pf-5菌株和突变体Pf-5ΔfitD在线虫外壁上均无破损或孔洞, 整个线虫的外表完整。这表明该菌株的作用位点不是线虫的外壁。透射电镜分析结果(图 6-B)显示:Pf-5菌株处理之后, 会导致线虫肠道绒毛变薄、甚至脱落; 而突变体Pf-5ΔfitD处理之后, 则没有出现这种现象。这表明Pf-5菌株产生的杀线虫FitD蛋白作用位点是肠道。

图 6 扫描电镜(A)和透射电镜(B)观察Pf-5菌株及其突变体Pf-5ΔfitD对秀丽隐杆线虫的影响 Fig. 6 Effects of strain Pf-5 and its mutant Pf-5ΔfitD on C.elegans observed by scanning electron microscopy(A)and transmission electron microscopy(B)
3 结论与讨论

生防假单胞菌是一种重要的根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR), 这类菌能利用植物根系分泌物生长繁殖, 产生一系列有益的生物活性物质。抑菌活性物质如硝吡咯菌素和脂肽类物质等, 在其防治植物病害中起着重要作用; 营养利用物质如嗜铁素能帮助其竞争铁元素, 从而具有抑制病原物的活性, 在防治烟草青枯病、甜瓜果斑病、甜瓜蔓枯病和小麦全蚀病等中起着重要作用。此外, 生防假单胞菌还具有诱导植物抗病性的活性。基于这些有益的生物学效应, 这类菌具有潜在的应用价值[23]。很多假单胞菌被开发成商品化的生防制剂, 如Pf-5、CHA0、M18等。本研究发现假单胞菌Pf-5菌株对秀丽隐杆线虫具有致死活性, 这不仅扩大假单胞菌Pf-5菌株的生防范围, 而且为作物线虫病害的绿色防治提供理论支持。

已有研究表明, 铜绿假单胞菌的一些菌株对根结线虫病具有较好的防治效果[10, 24], 但具体活性物质有待进一步研究。为了鉴定Pf-5菌株中杀线虫活性物质, 通过查阅相关文献发现与Pf-5菌株背景相似的CHA0菌株, 对重要鳞翅目昆虫害虫的幼虫, 如烟草夜蛾(Manduca sexta)和大蜡螟(Candida mellonella)的幼虫具有致死活性, 并且这种活性与其产生的FitD蛋白密切相关[22]。FitD蛋白是一种大小为3.27×105的大蛋白, 与发光杆菌产生的Mcf1毒素具有结构相似性。Mcf1毒素具有促进血细胞和中肠上皮细胞凋亡的活性。为了证明FitD蛋白在Pf-5菌株杀线虫活性中的作用, 我们构建了相应的突变体, 结果发现突变fitD基因后, 突变菌株的杀线虫活性显著下降, 这表明FitD蛋白是Pf-5菌株产生的主要杀线虫活性物质。

生物信息学分析和活性预测表明, FitD含有GTD、APD、Delivery和CROPS这4个结构域。其中, Delivery结构域可能具有细胞膜的打孔功能, 从而杀死寄主, 是该蛋白活性中心; CROPS结构域可能负责与细胞膜上的受体结合。当突变FitD的Delivery和CROPS结构域之后, 突变体对秀丽隐杆线虫的致死活性也显著下降。说明这2个区域对于其杀线虫活性起着至关重要的作用。FitD的Delivery区域与艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素TcdA和TcdB的穿孔区域具有结构相似性。当烟草天蛾(Manduca sexta)幼虫被喂食Tcd毒素之后, 前中肠上皮组织会出现空洞, 在肠腔中出现细胞碎片, 导致停止发育直至死亡[25]。这说明, 这类毒素的作用位点在肠道。本研究利用扫描和透射电镜观察的结果表明, 野生型Pf-5菌株会造成线虫肠道绒毛变薄、甚至脱落; 而fitD突变体则没有观察到这种现象, 这说明FitD蛋白的作用位点应该也位于肠道。然而, FitD蛋白与线虫体内的哪类蛋白互作尚待进一步研究。

参考文献(References)
[1]
Mazzola M, Cook R J, Thomashow L S, et al. Contribution of phenazine antibiotic biosynthesis to the ecological competence of fluorescent pseudomonads in soil habitats[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1992, 58(8): 2616-2624.
[2]
Bird A F. Orientation of the larvae of Meloidogyne javanica relative to roots[J]. Nematologica, 1962, 8(4): 275-287. DOI:10.1163/187529262X00062
[3]
冯志新. 植物线虫学[M]. 北京: 科学出版社, 2011: 135.
Feng Z X. Plant Nematode Science[M]. Beijing: Science Press, 2011: 135 (in Chinese).
[4]
Noling J W. Nematode management in carrots[J]. Entomology & Nematology, 2010, ENY-021.
[5]
Noling J W. Nematode management in tomatoes, peppers, and eggplant[J]. Entomology & Nematology, 2016, ENY-032.
[6]
许灵杰, 杜相革, 翟欣, 等. 烟草根结线虫病研究概况及其防治措施[J]. 黑龙江农业科学, 2013(12): 153-157,164.
Xu L J, Du X G, Zhai X, et al. Research situation and control measures of tobacco root knot nematode[J]. Heilongjiang Agricultural Sciences, 2013(12): 153-157,164 (in Chinese with English abstract). DOI:10.3969/j.issn.1002-2767.2013.12.046
[7]
蒋盼盼, 陈志谊, 甘颖, 等. 解淀粉芽孢杆菌B1619对设施蔬菜根结线虫病的防治效果[J]. 江苏农业科学, 2017, 45(12): 81-84.
Jiang P P, Chen Z Y, Gan Y, et al. Control effect of Bacillus amyloliquefaciens B1619 on root-knot nematode disease in facility vegetables[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2017, 45(12): 81-84 (in Chinese).
[8]
朱震, 陈芳, 肖同建, 等. 拮抗菌生物有机肥对番茄根结线虫的防治作用[J]. 应用生态学报, 2011, 22(4): 1033-1038.
Zhu Z, Chen F, Xiao T J, et al. Controlling effect of antagonist bioorganic fertilizer on tomato root-knot nematode[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2011, 22(4): 1033-1038 (in Chinese with English abstract).
[9]
Xia Y F, Xie S S, Ma X, et al. The purL gene of Bacillus subtilis is associated with nematicidal activity[J]. FEMS Microbiology Letters, 2011, 322(2): 99-107. DOI:10.1111/j.1574-6968.2011.02336.x
[10]
Siddiqui I A, Qureshi S A, Sultana V, et al. Biological control of root rot-root knot disease complex of tomato[J]. Plant & Soil, 2000, 227(1/2): 163-169.
[11]
Siddiqui I A, Shaukat S S. Rhizobacteria-mediated induction of systemic resistance(ISR)in tomato against Meloidogyne javanica[J]. Journal of Phytopathology, 2002, 150(8/9): 469-473. DOI:10.1046/j.1439-0434.2002.00784.x
[12]
范津.丁香假单胞菌MB03及铜绿假单胞菌中对线虫毒性蛋白筛选与鉴定[D].武汉: 华中农业大学, 2017.
Fan J. Screening and characterization of nematode-pathogenic from Pseudomonas syringae MB03 and Pseudomonas aeruginosa[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2017(in Chinese with English abstract).
[13]
梁红梅.铜绿假单胞菌ATCC27853对秀丽隐杆线虫的毒性研究[D].兰州: 兰州大学, 2015.
Liang H M. Study on Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 strain toxicity in Caenorhabditis elegans[D]. Lanzhou: Lanzhou University, 2015(in Chinese with English abstract).
[14]
唐佳频, 邵宗泽, 张智涛, 等. 南极土壤来源的恶臭假单胞菌1A00316抗南方根结线虫的机制[J]. 应用与环境生物学报, 2014, 20(6): 1046-1051.
Tang J P, Shao Z Z, Zhang Z T, et al. Mechanism of antagonistic bacteria Pseudomonas putida 1A00316 from the South Pole soil against Meloidogyne incognita[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2014, 20(6): 1046-1051 (in Chinese with English abstract).
[15]
Paulsen I T, Press C M, Ravel J, et al. Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf-5[J]. Nature Biotechnology, 2005, 23(7): 873-878. DOI:10.1038/nbt1110
[16]
Weller D M, Mavrodi D V, van Pelt J A, et al. Induced systemic resistance in Arabidopsis thaliana against Pseudomonas syringae pv. tomato by 2, 4-diacetylphloroglucinol-producing Pseudomonas fluorescens[J]. Phytopathology, 2012, 102(4): 403-412. DOI:10.1094/PHYTO-08-11-0222
[17]
Peng D H, Lin J, Huang Q, et al. A novel metalloproteinase virulence factor is involved in Bacillus thuringiensis, pathogenesis in nematodes and insects[J]. Environmental Microbiology, 2016, 18(3): 846-862. DOI:10.1111/1462-2920.13069
[18]
Zhang F J, Peng D H, Cheng C S, et al. Bacillus thuringiensis crystal protein Cry6Aa triggers Caenorhabditis elegans necrosis pathway mediated by aspartic protease(ASP-1)[J]. PLoS Pathogens, 2016, 12(1): e1005389. DOI:10.1371/journal.ppat.1005389
[19]
李有全, 关贵全, 彭欲率, 等. 秀丽隐杆线虫的培养与保存研究[J]. 中国兽医科学, 2011, 41(10): 1001-1004.
Li Y Q, Guan G Q, Peng Y L, et al. Study on the culture and preservation of Caenorhabditis elegans[J]. Chinese Veterinary Science, 2011, 41(10): 1001-1004 (in Chinese with English abstract).
[20]
Williams P L, Dusenbery D B. Using the nematode Caenorhabditis elegans to predict mammalian acute lethality to metallic salts[J]. Toxicology & Industrial Health, 1988, 4(4): 469-478.
[21]
王铁霖, 杨玉文, 关巍, 等. 西瓜嗜酸菌LuxR家族基因luxR4229的功能研究[J]. 植物病理学报, 2016, 46(2): 198-206.
Wang T L, Yang Y W, Guan W, et al. Functional analysis of luxR4229, a LuxR family gene, in Acidovorax citrulli[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2016, 46(2): 198-206 (in Chinese with English abstract).
[22]
Péchy-Tarr M, Bruck D J, Maurhofer M, et al. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plantassociated strains of Pseudomonas fluorescens[J]. Environ Microbiol, 2008, 10(9): 2368-2386. DOI:10.1111/j.1462-2920.2008.01662.x
[23]
李 䶮, 刘娜, 郑丽博. 荧光假单胞菌植物病害防治及研究进展[J]. 分子植物育种, 2018, 16(11): 3693-3697.
Li Y, Liu N, Zheng L B. Prevention and treatment of plant diseases of Pseudomonas fluorescens and research progress[J]. Molecular Plant Breeding, 2018, 16(11): 3693-3697 (in Chinese with English abstract).
[24]
Ali N I, Siddiqui I A, Shahid Shaukat S, et al. Nematicidal activity of some strains of Pseudomonas spp.[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2002, 34(8): 1051-1058. DOI:10.1016/s0038-0717(02)00029-9
[25]
Blackburn M, Golubeva E, Bowen D, et al. A novel insecticidal toxin from Photorhabdus luminescens, toxin complex a(Tca), and its histopathological effects on the midgut of Manduca sexta[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(8): 3036-3041.