文章信息
- 任文芳, 王沛, 常建伟, 张钰漩, 杨润强, 顾振新
- REN Wenfang, WANG Pei, CHANG Jianwei, ZHANG Yuxuan, YANG Runqiang, GU Zhenxin
- 苯丙氨酸和谷氨酸联合处理对大豆芽菜中5-甲基四氢叶酸富集的影响
- Effects of combined treatment of phenylalanine and glutamate on the accumulation of 5-methyltetrahydrofolate in soybean sprouts
- 南京农业大学学报, 2019, 42(4): 759-766
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(4): 759-766.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201810005
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文章历史
- 收稿日期: 2018-10-07
叶酸是指四氢叶酸及其衍生物, 为一种水溶性B族维生素, 由2-氨基-4-羟基蝶啶(蝶呤)、对氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸3部分组成[1], 在人体甲基化循环、核苷酸合成和氨基酸代谢中发挥重要作用。人体自身缺乏合成叶酸的能力, 只能从饮食中摄取, 为满足正常生命活动的需要, 成年人每天应补充400 μg, 孕妇每天应补充600 μg的叶酸[2]。人体摄入叶酸量不足时会引发巨幼红细胞贫血和胎儿神经管发育缺陷[3], 且低水平的叶酸摄入量与老年痴呆症、心血管疾病和多种癌症的发病密切相关, 而人类膳食中叶酸的缺乏状况在全球范围内普遍存在[4]。
植物食品中叶酸强化技术已取得一定进展, 如基因工程手段[5]、光照调控[6]、发芽调控等, 其中发芽调控是一种简便有效的方法。种子萌发后, 生命代谢活动开始, 内部发生一系列生理生化变化, 谷物及豆类籽粒在发芽期间对甲基的需求增加, 从而使叶酸合成加快[7]。研究表明, 发芽4 d后, 小麦苗中叶酸含量是籽粒的4倍, 黑麦苗是籽粒的6倍[7], 蚕豆苗比籽粒增加2.5倍[8]; 大豆萌发后, 叶酸含量也显著提高, 发芽4 d的大豆芽菜中叶酸含量是籽粒的2~3倍, 其中5-甲基四氢叶酸(5-CH3-THF)占比最高[9], 它在甲硫氨酸合成及甲基化循环中均发挥重要作用, 是细胞增殖和细胞生长的关键因素[10]。然而, 在种子发芽培养液中添加有利于富集叶酸物质的研究还鲜见报道。
苯丙氨酸由莽草酸途径而来的分支酸合成, 可诱导苯丙氨酸合成相关酶的反馈抑制[11], 从而使分支酸合成更多的pABA。谷氨酸是叶酸合成的底物之一, 可与二氢喋酸结合形成二氢叶酸, 或与单谷氨酸四氢叶酸结合形成多谷氨酰四氢叶酸[1]。本研究在大豆发芽过程中喷淋苯丙氨酸和谷氨酸, 探讨2种氨基酸对大豆芽菜中5-CH3-THF富集的影响机制, 旨在为外源氨基酸处理大豆芽菜富集5-CH3-THF提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料供试大豆籽粒为‘东农’, 置于-20 ℃保存备用。
L-5-甲基四氢叶酸钙(标准品)购自加拿大TRC公司; 淀粉酶(≥700 U·mg-1)、木瓜蛋白酶(≥800 U·mg-1)购自上海瑞永生物科技有限公司; 苯丙氨酸、谷氨酸购自生工生物工程(上海)股份有限公司; pABA购自麦克林生化科技有限公司; 大鼠血清(分析纯)购自源叶生物科技有限公司; Plant RNA Extraction Kit、RT-PCR Mater Mix Kit、SYBR Premix Ex TaqTM均购自TaKaRa公司。
1.2 试验设计 1.2.1 苯丙氨酸浓度筛选称取20 g籽粒饱满的大豆, 用体积分数为1.0%的次氯酸钠浸泡15 min, 于蒸馏水中漂洗至pH中性后, 30 ℃浸泡6 h; 将大豆置于30 ℃遮光的发芽机中用浓度为0、1、2、3、4和5 mmol·L-1苯丙氨酸溶液喷淋培养4 d。期间, 每1 h喷淋1次培养液, 每次喷淋2 min, 每隔1 d更换1次喷淋溶液。收集生长2和4 d的大豆芽菜, 用去离子水洗干净, 备用。
1.2.2 谷氨酸浓度筛选大豆籽粒处理同上, 谷氨酸溶液浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mmol·L-1。收集生长2和4 d的大豆芽菜, 用去离子水洗干净, 备用。
1.2.3 联合处理浓度筛选大豆籽粒处理同上, 在单因素试验基础上, 进行苯丙氨酸与谷氨酸联合处理的2因素3水平全排列试验, 发芽时间为4 d, 以去离子水处理为对照。
1.3 测定指标与方法随机选取30株大豆芽菜, 分别用直尺和分析天平测定其芽长和单株质量。
5-CH3-THF含量测定采用三酶处理法[9], 制得的样液经液相色谱梯度洗脱采用荧光检测仪在激发波长/发射波长为290 nm/360 nm下测定[12]。pABA含量参照Shohag[13]的方法测定。氨基酸组成及含量采用氨基酸自动分析仪测定。
1.4 叶酸合成相关基因表达取2和4 d芽菜各2株, 用双蒸水洗干净并用吸水纸吸干水分, 液氮速冻后, 按照RNA提取试剂盒说明书提取大豆芽菜的总RNA。根据NCBI上公布的cDNA序列, 采用Primer Premier 5.0软件设计引物如表 1所示。引物由金斯瑞生物科技(南京)有限公司合成。荧光定量PCR选用SYBR Premix Ex Taq试剂盒, 以大豆EF1b为内参, 并采用20 μL反应体系(SYBR Premix Ex Taq 10 μL, 上、下游引物各0.4 μL, RoX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL, cDNA 1 μL, RNase-free H2O 7.8 μL)。
基因Gene | 引物序列(5′→3′) Primer sequences |
GCH1 | GTTACAGACAAAAGGTGAACGACA/CAGGACTCGCAATAGGAAAACA |
HPPK-DHPS | ACAGTTGCTTCCTGGCATTCA/GGCATTACCCTATACATTCCTTCC |
DHFR | GCTCAACAAATGCCAAGGTG/CCCATAAACAGGTCCCAAGTC |
FPGS | CATGTGCCAGGTGGTTTTCT/TGTGCATCTTCACTACTTGGTTTG |
EF1b | CCACTGCTGAAGAAGATGATGATG/AAGGACAGAAGACTTGCCACTC |
试验设3次重复, 结果以x±SD表示。采用SPASS 19.0软件进行差异显著性分析。
2 结果与分析 2.1 苯丙氨酸和谷氨酸对大豆芽菜芽长、单株质量及5-CH3-THF含量的影响 2.1.1 芽长和单株质量由图 1可知:不同浓度苯丙氨酸和谷氨酸处理对同一发芽时间大豆芽长及单株质量影响均较小且无明显规律, 表明苯丙氨酸和谷氨酸对大豆芽菜生长影响均较小。
2.1.2 5-CH3-THF含量由表 2可知:大豆发芽后5-CH3-THF含量显著提高, 且对照、苯丙氨酸处理和谷氨酸处理下大豆芽菜中5-CH3-THF含量均随发芽时间的延长而增加。添加苯丙氨酸可显著促进大豆芽菜中5-CH3-THF的积累。发芽2 d时, 苯丙氨酸处理下5-CH3-THF含量比对照提高22%, 但不同浓度之间并无显著差异; 发芽4 d时, 5-CH3-THF含量随着苯丙氨酸浓度的增加呈先升后降的趋势, 在苯丙氨酸浓度为3 mmol·L-1时达到最大值(1 834 μg·100 g-1), 是对照的1.38倍。添加合适浓度的谷氨酸可显著促进大豆芽菜中5-CH3-THF的积累。发芽2 d时, 各个浓度谷氨酸处理5-CH3-THF含量显著高于对照, 但各浓度之间无显著性差异; 发芽4 d时, 当谷氨酸浓度高于0.5 mmol·L-1时, 5-CH3-THF含量比对照显著提高, 当谷氨酸浓度为1.5 mmol·L-1时其含量达到最大值, 为1 653 μg·100 g-1, 是对照的1.24倍。
处理Treatment | c/(mmol·L-1) | 5-CH3-THF含量/(μg·100 g-1) 5-CH3-THF content | ||
0 d | 2 d | 4 d | ||
0 | 539±20e | 930±45d | 1 326±103c | |
1 | 539±20e | 1 140±73c | 1 593±92b | |
苯丙氨酸 | 2 | 539±20e | 1 211±78c | 1 691±63ab |
Phenylalanine | 3 | 539±20e | 1 247±69c | 1 834±115a |
4 | 539±20e | 1 185±123c | 1 795±120a | |
5 | 539±20e | 1 215±26c | 1 589±8b | |
0 | 539±20e | 931±45e | 1 326±103c | |
0.5 | 539±20e | 1 164±30d | 1 409±79bc | |
谷氨酸 | 1.0 | 539±20e | 1 157±57d | 1 605±11a |
Glutamate | 1.5 | 539±20e | 1 092±75d | 1 653±97a |
2.0 | 539±20e | 1 131±19d | 1 625±100a | |
2.5 | 539±20e | 1 130±15d | 1 513±97ab |
由表 3可知:3 mmol·L-1苯丙氨酸与1.0 mmol·L-1谷氨酸联合处理下大豆芽菜5-CH3-THF含量达到最大值, 为2 062 μg·100 g-1, 显著高于谷氨酸单独处理时的最大值(1 653 μg·100 g-1)及苯丙氨酸单独处理时的最大值(1 834 μg·100 g-1), 表明两者联合处理对5-CH3-THF的富集具有叠加效应。
苯丙氨酸浓度/(mmol·L-1) Phenylalanine concentration |
谷氨酸浓度/(mmol·L-1) Glutamate concentration |
5-CH3-THF含量/(μg·100 g-1) 5-CH3-THF content |
2 | 0.5 | 1 536±76b |
2 | 1.0 | 1 935±76a |
2 | 1.5 | 1 562±43b |
3 | 0.5 | 1 882±62a |
3 | 1.0 | 2 062±43a |
3 | 1.5 | 1 899±69a |
4 | 0.5 | 2 020±111a |
4 | 1.0 | 1 517±99b |
4 | 1.5 | 2 044±150a |
以最少外源物质添加量及最大5-CH3-THF富集量为原则, 选择3 mmol·L-1苯丙氨酸、1.0 mmol·L-1谷氨酸、3 mmol·L-1苯丙氨酸+1.0 mmol·L-1谷氨酸溶液喷淋大豆芽菜, 研究其在发芽和生长过程中pABA含量、胚轴和子叶中5-CH3-THF含量、氨基酸组成变化及叶酸合成相关基因表达量的变化, 探讨3种处理对大豆芽菜富集叶酸的影响。
2.3.1 pABA含量如图 2所示:苯丙氨酸与谷氨酸及其联合处理下pABA含量均显著高于对照, 分别为对照的2.29、1.92、2.34倍。苯丙氨酸处理及苯丙氨酸与谷氨酸联合处理下pABA含量无显著差异, 但显著高于谷氨酸处理下的pABA含量, 表明苯丙氨酸相较于谷氨酸对pABA的促进作用更为显著。
2.3.2 5-CH3-THF含量由表 4可知:大豆发芽4 d时, 同一处理下胚轴鲜质量显著高于子叶, 为子叶的2倍, 但干质量则均低于子叶, 且不同处理间差异不显著。
处理 Treatment |
胚轴Hypocotyl | 子叶Cotyledon | |||||
100株芽菜鲜质量/g Fresh weight per 100 sprouts |
100株芽菜干质量/g Dry weight per 100 sprouts |
含水量/% Water content |
100株芽菜鲜质量/g Fresh weight per 100 sprouts |
100株芽菜干质量/g Dry weight per 100 sprouts |
含水量/% Water content |
||
CK | 47.63±1.46a | 2.32±0.13a | 95.14±0.15a | 19.83±0.59a | 3.90±0.02a | 80.34±0.47b | |
Phe | 48.33±1.43a | 2.49±0.07a | 94.85±0.02a | 20.67±0.60a | 3.96±0.35a | 80.86±1.57ab | |
Glu | 49.47±1.11a | 2.49±0.17a | 94.97±0.35a | 18.50±0.44a | 3.34±0.07b | 81.96±0.65a | |
Phe+Glu | 48.77±2.42a | 2.51±0.31a | 94.86±0.41a | 19.23±1.53a | 3.63±0.33ab | 81.15±0.22ab |
由图 3可知:大豆芽菜子叶中5-CH3-THF含量较多, 占55%以上, 但子叶干质量占整个大豆芽菜的60%以上, 故胚轴中5-CH3-THF的相对含量略低于子叶。苯丙氨酸与谷氨酸及其联合处理下胚轴与子叶中5-CH3-THF含量均显著高于对照, 胚轴中5-CH3-THF含量分别是对照的1.41、1.19和1.53倍, 子叶中5-CH3-THF含量分别是对照的1.34、1.22和1.51倍, 大豆芽菜中5-CH3-THF含量分别是对照的1.33、1.20和1.49倍。表明苯丙氨酸与谷氨酸对大豆芽菜中胚轴和子叶的叶酸含量富集均有显著作用。由于胚根为不可食部分, 本研究仅测定了胚轴和子叶部分的5-CH3-THF含量。
2.3.3 氨基酸组成及含量变化如表 5所示:添加苯丙氨酸与谷氨酸促进大豆芽菜多种游离氨基酸的形成, 并使得游离氨基酸总量上升。单独添加苯丙氨酸, 促进大豆芽菜游离苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸等氨基酸的形成, 单独添加谷氨酸则促进大豆芽菜各种游离氨基酸的形成, 二者联合添加同样促进各种游离氨基酸的形成, 最终游离氨基酸总量上升, 表明添加苯丙氨酸与谷氨酸能促进植物体内氨基酸代谢。
氨基酸种类 Kinds of amino acid |
游离氨基酸含量/(mg·g-1)Free amino acid content | 氨基酸含量/(mg·g-1)Amino acid content | |||||||
CK | Phe | Glu | Phe+Glu | CK | Phe | Glu | Phe+Glu | ||
天冬氨酸Asp | 2.36 | 2.58 | 3.08 | 2.50 | 134.51 | 140.00 | 145.63 | 140.11 | |
苏氨酸Thr | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 16.39 | 15.88 | 15.68 | 16.50 | |
色氨酸Ser | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 19.46 | 19.27 | 19.05 | 19.63 | |
谷氨酸Glu | 4.41 | 4.52 | 4.98 | 5.09 | 48.48 | 47.62 | 47.02 | 49.23 | |
甘氨酸Gly | 0.29 | 0.29 | 0.33 | 0.32 | 13.86 | 13.30 | 13.25 | 13.88 | |
丙氨酸Ala | 1.75 | 1.81 | 2.05 | 1.75 | 16.41 | 15.96 | 15.85 | 16.28 | |
半胱氨酸Cys | 0.67 | 0.67 | 0.71 | 0.73 | 4.38 | 4.22 | 4.13 | 4.42 | |
缬氨酸Val | 5.77 | 5.97 | 6.39 | 5.85 | 21.39 | 20.58 | 21.04 | 21.00 | |
甲硫氨酸Met | 0.28 | 0.33 | 0.34 | 0.35 | 4.14 | 4.04 | 3.99 | 3.86 | |
异亮氨酸Ile | 3.50 | 3.35 | 4.12 | 3.29 | 18.36 | 17.31 | 18.04 | 17.80 | |
亮氨酸Leu | 1.63 | 1.70 | 2.24 | 1.81 | 27.34 | 26.48 | 26.34 | 27.33 | |
酪氨酸Tyr | 0.46 | 0.60 | 1.09 | 0.72 | 12.38 | 12.21 | 12.44 | 12.66 | |
苯丙氨酸Phe | 5.33 | 19.79 | 7.29 | 18.09 | 22.25 | 36.12 | 23.08 | 35.03 | |
赖氨酸Lys | 2.19 | 2.70 | 4.51 | 3.11 | 23.91 | 23.14 | 24.85 | 24.63 | |
组氨酸His | 6.01 | 6.21 | 6.71 | 6.28 | 13.50 | 13.38 | 13.73 | 13.74 | |
精氨酸Arg | 10.96 | 12.78 | 18.19 | 13.33 | 29.66 | 30.77 | 35.20 | 31.84 | |
脯氨酸Pro | 0.78 | 0.95 | 1.49 | 0.91 | 15.48 | 15.04 | 15.43 | 15.45 | |
总量Total | 46.37 | 64.24 | 63.49 | 64.12 | 441.90 | 455.32 | 454.75 | 463.39 |
添加苯丙氨酸使大豆芽菜中苯丙氨酸含量高于对照, 但添加谷氨酸并未使谷氨酸含量提高, 可能是由于谷氨酸代谢较旺盛所致。当同时添加二者时, 苯丙氨酸和天冬氨酸含量增加。对氨基酸总量而言, 3种处理均高于对照, 而同时添加苯丙氨酸和谷氨酸高于单独添加氨基酸的处理, 表明添加氨基酸可促进植物体内氨基酸合成, 且增加量处于组成蛋白质的正常值范围, 对人体有益。
2.3.4 叶酸合成相关基因的表达量分析如图 4所示:添加苯丙氨酸与谷氨酸影响叶酸合成相关基因相对表达量。喷施苯丙氨酸与谷氨酸并未影响鸟苷三磷酸环化水解酶1基因(GCH1)的相对表达量, 可能是二者的加入并未影响叶酸合成中的蝶呤分支, 而只影响pABA合成和叶酸合成。苯丙氨酸处理的大豆芽菜中羟甲基二氢蝶呤焦磷酸化-二氢喋酸合成酶基因(HPPK-DHPS)的相对表达量为对照的4.12倍, 而苯丙氨酸和谷氨酸联合处理时为对照的4.91倍, 叶酸含量的变化与之对应。苯丙氨酸处理大豆芽菜二氢叶酸还原酶基因(DHFR)的相对表达量为对照的4.25倍, 而苯丙氨酸和谷氨酸联合处理为对照的5.58倍。谷氨酸处理多聚谷氨酸合成酶基因(FPGS)的相对表达量为对照的3.59倍, 而苯丙氨酸处理则对FPGS基因的表达无促进作用, 表明底物的增加促进了FPGS基因的表达。
3 讨论人体自身不能合成叶酸, 完全依靠外界供给。食物中叶酸多为聚谷氨酸形式, 吸收前必须在肠黏膜经α-L-谷胺酰转移酶水解成单谷氨酸形式, 后与叶酸结合蛋白结合, 穿过小肠黏膜并在其上皮细胞还原为四氢叶酸, 再经甲基化作用形成5-CH3-THF后进入肝脏及血液, 从而广泛分布于体内。对于细胞而言, 具有活性的5-CH3-THF是叶酸代谢的起始物[14], 进入细胞后可作为甲基供体, 参与体内多种生化代谢[15], 故叶酸转化为5-CH3-THF方可被人体吸收利用。然而, 合成5-CH3-THF所需的亚甲基四氢叶酸还原酶易因先天性缺乏而造成叶酸代谢障碍[16]。因此, 直接摄入5-CH3-THF对人体更有益。本试验中, 大豆发芽后, 5-CH3-THF含量由539 μg·100 g-1增加为1 160 μg·100 g-1, 每100 g干大豆芽菜中仅5-CH3-THF含量就达到每日推荐叶酸摄入量的2.90倍, 这有利于改善人体的叶酸代谢。
pABA是叶酸合成的重要中间代谢产物, 而它和苯丙氨酸均由莽草酸途径而来的分支酸合成[17]。添加苯丙氨酸可诱导苯丙氨酸合成相关酶的反馈抑制, 从而改变分支酸的代谢路径使之合成更多的pABA; 其次, 四氢叶酸是苯丙氨酸与酪氨酸代谢的辅酶[18], 该辅酶可决定苯丙氨酸转化成酪氨酸的代谢酶的活性[19], 故添加苯丙氨酸可能增加植物体对叶酸的需要。在本研究中, 喷施苯丙氨酸使大豆芽菜中5-CH3-THF含量显著增加。谷氨酸是叶酸合成的底物之一, 植物体在线粒体中合成二氢喋酸后, 二氢喋酸进一步在二氢叶酸合成酶催化下结合谷氨酸形成单谷氨酸二氢叶酸, 二氢叶酸还原酶在NADPH协助下将其还原为单谷氨酸四氢叶酸, 最后通过叶酰多谷氨酸合成酶的作用与谷氨酸结合形成多谷氨酰四氢叶酸[20]。在本研究中, 喷施谷氨酸同样使大豆芽菜中5-CH3-THF含量显著增加, 但效果不及苯丙氨酸, 可能是因为谷氨酸是叶酸合成的下游底物, 未起到关键性作用。
本研究中, 添加苯丙氨酸与谷氨酸促进大豆芽菜体内氨基酸的代谢, 不仅使大豆芽菜苯丙氨酸和谷氨酸含量增加, 其他氨基酸含量也增加。相关研究也有类似发现, 植物在高浓度氨基酸环境中生长时, 很可能会导致植物自身的氨基酸浓度升高[21]。本研究中, 甲硫氨酸、甘氨酸及组氨酸含量上升, 而甲硫氨酸、甘氨酸的生物合成及组氨酸的分解代谢需要叶酸作为辅酶参与[22], 同样可能促进叶酸合成。天冬氨酸普遍存在于生物合成中, 是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体, 在籽粒发芽过程中天冬氨酸的不断积累可供给大豆生长发育[23]。在本研究中, 喷施氨基酸使天冬氨酸含量明显上升, 这有助于大豆芽菜的生长。在生长旺盛的植物组织中, 叶酸含量较高, 因其活跃的代谢需要核苷酸不断合成, 而叶酸为核苷酸合成所必需。本研究中, 生长代谢更为旺盛的大豆胚轴中叶酸含量高于子叶。Jabrin等[24]的研究发现, 在分生组织根尖中叶酸含量是成熟根中的5倍, 同样表明生长代谢速度与叶酸含量的一致性。
叶酸合成涉及多个酶的参与, 如:鸟苷三磷酸环化水解酶1(GCH1)是叶酸合成中蝶啶分支的第1个酶, 亦是关键酶; 羟甲基二氢蝶呤焦磷酸化-二氢喋酸合成酶(HPPK-DHPS)催化6-羟甲基二氢喋呤与pABA结合形成二氢蝶酸, 二氢叶酸还原酶(DHFR)在NADPH的协助下催化二氢叶酸还原为四氢叶酸; 多聚谷氨酸合成酶(FPGS)催化四氢叶酸与谷氨酸结合形成叶酸多聚谷氨酸。提高编码叶酸合成相关酶基因的表达量可显著增强植物中叶酸的合成, 在Storozhenko等[25]的研究中过量表达蝶呤合成及pABA合成分支的相关基因使水稻中叶酸含量相比野生型提高100倍; 在Jabrin等[24]的研究中, 植物组织中高叶酸含量对应较高的HPPK-DHPS mRNA表达量及蛋白表达量。本研究测定了编码上述4种酶的相关基因的相对表达量, 发现苯丙氨酸和谷氨酸处理可提高大豆芽菜DHPS、DHFR、FPGS等基因的表达, 但对GCH1基因表达量则无显著作用。
植物籽粒发芽作为一种有效的叶酸富集方式, 目前已有一些研究, 但大多数研究仅在发芽条件方面, 培养液组分对叶酸含量影响的相关研究则较为缺乏。本研究结果表明苯丙氨酸与谷氨酸处理能富集大豆芽菜中5-CH3-THF含量, 为开发富含叶酸的食品提供了理论依据和技术支持。
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