南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (4): 697-705   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201811031
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文章信息

宫安东, 孔宪巍, 翟新可, 路亚南, 文淑婷, 张静柏
GONG Andong, KONG Xianwei, ZHAI Xinke, LU Yanan, WEN Shuting, ZHANG Jingbo
枯草芽胞杆菌WY8-7的溶磷、抑菌及促生长作用
Phosphate solubilizing, antagonistic and plant growth promoting activity of Bacillus subtilis WY8-7
南京农业大学学报, 2019, 42(4): 697-705
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(4): 697-705.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201811031

文章历史

收稿日期: 2018-11-26
枯草芽胞杆菌WY8-7的溶磷、抑菌及促生长作用
宫安东1 , 孔宪巍1 , 翟新可1 , 路亚南1 , 文淑婷1 , 张静柏2     
1. 信阳师范学院生命科学学院, 河南 信阳 464000;
2. 华中农业大学植物科学技术学院, 湖北 武汉 430070
摘要[目的]本文旨在筛选兼有溶磷和抑菌作用的微生物菌株,分析其在水体和土壤中的溶磷效果以及对植物生长的作用,同时分析其抑菌活性,鉴定其抑菌物质。[方法]采用稀释涂平板法,从茶园土壤中分离具有溶磷和抑菌作用的菌株WY8-7,通过形态学、生理生化和分子生物学分析,确定菌株WY8-7的分类地位;检测菌株WY8-7在土壤和培养液中对难溶性无机磷的降解作用;检测其对苗期玉米植株生长的影响;对峙培养法分析菌株WY8-7对不同病原真菌的抑菌作用;超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱鉴定抑菌功能物质。[结果]经鉴定,菌株WY8-7为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),在固体培养基、液体培养基和土壤中均可转化难溶性无机磷,提升可溶性磷含量;液体振荡培养20 d后,可溶性磷含量达512.77 mg·L-1,为对照的174倍;菌株WY8-7可提升土壤中可溶性磷含量,并促进苗期玉米的生长,与对照组相比,在叶长、叶宽、单叶叶面积、株高和鲜质量等指标均有显著增长(P < 0.05),增长率分别达17.68%、22.08%、42.62%、20.34%和20.59%;质谱分析表明,菌株WY8-7可产生伊枯草菌素A和丰原素A两类抑菌物质,对3种真菌具有高效广谱抑菌作用,对禾谷炭疽菌的抑菌率最高,达87.34%。[结论]分离自茶园的枯草芽胞杆菌WY8-7,在土壤和液体振荡培养中可高效转化难溶性无机磷为可溶性磷,促进苗期玉米植株生长,同时WY8-7还可产生伊枯草菌素A和丰原素A两种脂肽类物质,抑制多种病原真菌生长。WY8-7具有高效溶磷和抑菌作用,为新型微生物菌肥的研发提供重要材料。
关键词枯草芽胞杆菌   溶磷   抑菌活性   促生长   伊枯草菌素A   丰原素   
Phosphate solubilizing, antagonistic and plant growth promoting activity of Bacillus subtilis WY8-7
GONG Andong1, KONG Xianwei1, ZHAI Xinke1, LU Yanan1, WEN Shuting1, ZHANG Jingbo2    
1. College of Life and Science, Xinyang Normal University, Xinyang 464000, China;
2. College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
Abstract: [Objectives] The purpose of our study was screening microorganism with phosphate solubilizing (P-solubilizing) and antifungal activity, analyzing the P-solubilizing, antifungal and plant growth promoting effect, and identifying the primary antifungal compounds. [Methods] Strain WY8-7 with P-solubilizing and antifungal activity was isolated from tea rhizosphere soil through gradient dilution method. The isolated bacteria WY8-7 was identified through morphology, biochemistry and molecular methods. WY8-7 was inoculated to liquid medium and soil to analyze the P-solubilizing activity, and co-cultured with maize seedling to detect the plant growth promoting activity. Additionally, WY8-7 was co-cultured with different fungi to test the broad antifungal activity, and the effective compounds were identified through ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry(UPLC-Q/TOF-MS). [Results] Strain WY8-7 was identified to be Bacillus subtilis through morphology, biochemical character and molecular methods. It could dissolve phosphate in solid and liquid medium, as well as in soil conditions. In liquid medium, the concentration of dissolved phosphate was up to 512.77 mg·L-1, which was 174 times to the control treatment in 20 d. In soil, strain WY8-7 could increase the concentration of soluble phosphate, and promote the growth of maize seedlings in the aspect of leaf length, leaf width, single leaf area, plant height, fresh weight. The increased rate was 17.68%, 22.08%, 42.62%, 20.34% and 20.59% compared to the control treatment with significant differences(P < 0.05), respectively. Moreover, WY8-7 could also inhibit the growth of three different fungal pathogens in dual cultural tests by the production of two kinds of lipopeptides. WY8-7 showed better antifungal activity to Colletotrichum graminicola than other two strains, and the inhibitory rate was 87.34%. The lipopeptides were identified to be iturin A and fengycin A through UPLC-Q/TOF-MS methods. [Conclusions] Bacillus subtilis WY8-7 isolated from tea garden could dissolve phosphate into soluble in liquid medium and soil conditions, and promote the growth of maize seedling. Additionally, strain WY8-7 could produce iturin A and fengycin A with broad antifungal activity in dual cultural tests. Hence, strain WY8-7 with effective P-solubilizing and antifungal activity will provide important materials for the application of biofertilizer in future.
Keywords: Bacillus subtilis    P-solubilizing    antifungal activity    growth promoting    iturin A    fengycin   

磷肥是土壤肥力的重要组成成分, 是植物生长发育所必需的元素之一, 然而其在土壤中的持效期很短, 当季利用率仅为5%[1], 95%以上的磷被Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+等结合, 形成难溶性磷酸盐, 无法被植物吸收利用[2]。如何将土壤中存在的难溶性磷转化为植物可利用的可溶性磷肥, 是目前研究的重点。自然界中微生物种类繁多, 功能多样, 到目前为止, 已报道多种微生物具有较好的溶磷作用, 如放线菌[3]、青霉菌[4]、曲霉菌[5]、嗜麦芽寡养单胞菌[6]、葡糖醋杆菌[7]、沙雷氏菌[8]和芽胞杆菌[9]等, 可将难溶性磷转化为可溶性磷, 对土壤肥力的提升和农业的可持续发展具有重要意义。

溶磷微生物中以芽胞杆菌应用最为广泛, 芽胞杆菌在土壤中分布广, 种类多, 可产内生芽胞, 耐受性强, 且对人体和植物等无毒害作用, 是具有较好应用前景的生物材料。如已报道的枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等均具有高效的溶磷效果。黄伟等[10]筛选到2株球形赖氨酸芽胞杆菌YP17和P19, 具有较好的溶磷活性, 可促进田间巨桉幼苗的生长, 株高、直径、生物量、叶绿素含量等指标显著优于对照组。邢芳芳等[11]从玉米根际土壤中筛选到1株地衣芽胞杆菌PS-1, 能够转化难溶性Ca3(PO4)2, 于液体条件下培养6 d后, 溶磷量达到429.2 mg · L-1, 是对照组的45.95倍。除溶磷效果外, 部分已报道的芽胞杆菌还具有解钾生物活性。张爱民[12]分离到1株有溶磷、解钾作用的Paenibacillus kribbensis CX-7, 盆栽试验结果表明, 该菌株可促进苗期玉米的生长, 使植株增高12.6%, 叶面积增加20.4%。代志等[13]从土壤中筛选到的1株芽胞杆菌, 除具有溶磷、解钾作用外, 还具有杀线虫活性, 该菌株对有机磷的溶磷活性为0.82~3.66 mg · L-1, 解无机磷活性为40.90~61.80 mg · L-1, 解无机钾活性为6.72~8.74 mg · L-1, 同时还可抑制线虫, 校正死亡率在50%以上, 具有多功能生物活性。然而, 由于生态环境迥异, 不同地域筛选的芽胞杆菌应用效果差异显著, 多数菌株仅在特定环境条件下才能发挥高效作用, 难以满足不同地域土壤需求, 因此, 扩大不同生态条件下微生物的筛选范围, 更有利于高活性微生物的开发和应用。同时, 筛选的芽胞杆菌中多数仅具有单一溶磷活性, 个别菌株有复合的解钾或抑制线虫活性, 但针对溶磷芽胞杆菌在抑菌方面的作用尚未有研究报道, 在一定程度上制约了其广泛应用。多功能微生物菌株的应用可同时解决多种土壤难题, 能够为化学肥料和农药的减持以及土壤病、虫害的防控提供有效材料。

本研究从信阳毛尖茶百年龄茶树根际土壤中, 筛选到1株枯草芽胞杆菌WY8-7, 可降解固体培养基、水溶液和土壤中的难溶性无机磷, 增加可溶性磷含量, 并促进植物生长。同时, 该菌株具有较好的耐盐性和耐酸性, 还可产生具有广谱抑菌作用的伊枯草菌素A和丰原素A, 抑制多种病原真菌的生长。菌株WY8-7具有高效的生物活性, 为开发新型溶磷和抑菌双功能的微生物菌剂提供重要的生物材料。

1 材料与方法 1.1 供试材料与培养基

供试玉米品种为‘鲲玉’。供试真菌菌株黄曲霉菌(Aspergillus flavus)AF12、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)5035为华中农业大学麦类作物分子生物技术实验室提供, 禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)M2由中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室提供。

无机磷培养基:(NH4)2SO4 0.5 g, MgSO4 0.3 g, NaCl 0.3 g, Ca3(PO4)2 8.0 g, 葡萄糖10.0 g, 110 mg · mL-1 MnSO41 mL, 10 mg · mL-1 FeSO4 1 mL, 琼脂21 g, ddH2O定容至1 L, pH7.2。

NA培养基:牛肉膏3 g, 蛋白胨10 g, NaCl 5 g, 琼脂15 g, ddH2O定容至1 L, pH7.2。

NB培养液:牛肉膏3 g, 蛋白胨10 g, NaCl 5 g, ddH2O定容至1 L, pH7.2。

1.2 溶磷菌的分离与筛选

土壤样品采集于信阳市车云山茶厂百年龄茶树根际, 称取1 g土样置于2 mL离心管中, 加入1 mL无菌水, 混合均匀, 梯度稀释至10-6。取100 μL菌悬液, 涂布于无机磷固体培养基表层, 37 ℃培养72 h, 挑取溶磷圈大且澄清的单菌落, NA培养基进行划线纯化, 纯菌接种于NB培养液, 200 r · min-1振荡培养12 h后, 保存于-80 ℃冰箱中备用。

采用无机磷固体培养基培养法检测筛选菌株的溶磷效果。在培养基表面距中心位置1.5 cm处, 放置直径5 mm的灭菌滤纸片, 中心位置另一端对称处, 打孔器打孔(直径为5 mm), 向滤纸片上和孔洞中分别加入10 μL细菌菌悬液(D600=1.8), 以不接种菌悬液的处理为对照。37 ℃黑暗条件下培养3 d, 检测溶磷效果, 统计溶磷圈直径与菌落直径比(D/d), 计算溶磷率。

1.3 菌株WY8-7的生物学鉴定 1.3.1 形态学鉴定

将菌株WY8-7划线培养于NA培养基表面, 37 ℃培养24 h后, 观察菌落形态特征。

1.3.2 生理生化鉴定

挑取纯化的WY8-7单菌落, 接种至IF-A细菌培养液(美国Biolog公司)中, 混合均匀, 转接到Biolog Gen Ⅲ(美国Biolog公司)培养板中, 37 ℃培养12 h, 使用MicroStationTM System(美国Biolog公司)系统进行微生物生理生化分析。

1.3.3 分子生物学鉴定

WY8-7于NB培养基培养48 h后, 离心收集菌体, 采用Tris-HCl和EDTA提取基因组DNA, 苯酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为25 : 24 : 1)抽提DNA, 用超纯水溶解。采用特异性引物扩增基因组16S rRNA保守序列。引物为:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; 1492R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′, 扩增序列委托武汉天一辉远生物公司测序, 于GenBank数据库中进行同源比对分析, 并挑选已鉴定且同源性高的同属不同种菌株进行系统发育树分析[14]。MEGA软件进行多重序列同源性比对, Neighbor joining法构建系统发育树。

1.4 菌株WY8-7的溶磷效果验证 1.4.1 菌株WY8-7在液体培养条件下的溶磷作用

菌株WY8-7接种于NB培养液中, 37 ℃、200 r · min-1振荡培养24 h, 12 000 r · min-1离心10 min, 收集细菌菌体, 无菌水清洗2次, 并按6%(体积分数)接种量接种于40 mL无机磷培养液中, 以接种等量无菌水的处理为对照, 每个处理重复3次。37 ℃、200 r · min-1条件下, 培养0、3、6、12和20 d时分别取样, 采用AMS France连续流动分析仪测定水溶性磷含量[15]

1.4.2 菌株WY8-7在土壤环境条件下的溶磷作用

从茶园茶树根际取深度5~10 cm土壤, 室温下晾干后过孔径2.00 mm筛, 并分装于塑料灭菌袋中, 121 ℃灭菌20 min, 重复3次待用。灭菌土壤混匀, 分装成每份300 g, 置于塑料培养杯(开口直径9.4 cm, 高14.0 cm)中, 每杯加入60 mL无机磷液体培养液。试验设置:处理组每杯接种3 mL WY8-7菌液(D600=1.8), 对照组为接种等量体积的无菌水, 每个处理重复3次。室温下静置培养, 分别于0、3、6、12和20 d采集对应塑料杯中2.50 g土样, 采用Olsen法[16]对土样浸提并测定可溶性磷含量。

1.4.3 菌株WY8-7对盆栽玉米生长的影响

取茶树根际深度5~10 cm土壤, 室温晾干后过孔径2.00 mm筛, 灭菌3次后待用。土样混合均匀, 分装于花盆(开口直径19.2 cm, 高14.2 cm)中, 每盆装1.4 kg灭菌土, 每个花盆中加入0.28 L无机磷培养液。试验分2组:处理组(添加WY8-7菌悬液14 mL, D600值为1.8);对照组(添加等量的灭菌水)。玉米籽粒表面消毒(75%乙醇浸泡1 min, 无菌水冲洗2次, 用0.1%升汞浸泡3 min, 无菌水冲洗5~6次, 无菌水中浸泡20 min), 双层纱布催芽2 d, 选取发芽且长度一致的玉米幼苗, 每盆播种4株, 进行盆栽试验。种植27 d后观察幼苗长势, 并分别检测叶长、叶宽、单叶叶面积、叶片数、茎粗、株高、鲜质量、地上干质量、地下根部干质量等指标。

1.5 菌株WY8-7对不同病原真菌的广谱抑菌作用

在PDA培养平板中央, 分别接种黄曲霉菌、禾谷镰刀菌、禾谷炭疽菌菌丝块, 在距PDA平皿中心3 cm处, 接种活化的WY8-7菌株, 以中心仅接种真菌菌丝块的处理为对照, 28 ℃培养3 d, 测量真菌菌丝的直径, 计算抑菌率。抑菌率=(对照菌丝直径-处理菌丝直径)/对照菌丝直径×100%。

WY8-7接种于NB培养液中, 37 ℃、200 r · min-1振荡培养48 h, 12 000 r · min-1离心收集上清液, 并依次用溶化的PDA稀释2、4和6倍, 分别倒入培养皿中, 以不稀释的PDA培养板为对照, 中央接种新鲜的禾谷炭疽菌菌丝块, 28 ℃培养3 d, 观察不同稀释浓度下代谢物的抑菌效果。

1.6 菌株WY8-7的抑菌代谢物质鉴定 1.6.1 代谢物的提取与高效液相色谱检测

菌株WY8-7接种于NB培养液中, 37 ℃、200 r · min-1振荡培养48 h后, 12 000 r · min-1离心收集上清液, 用6 mol · L-1 HCl调节pH值至2.0, 4 ℃静置过夜。12 000 r · min-1离心, 弃上清液, 甲醇溶解沉淀, 过0.22 μm滤膜, 采用高效液相色谱(Primaide 1210 Hitachi, 日本)分析[17]。检测波长为214 nm, 流动相A为含0.1%(体积分数)乙酸的乙腈, 流动相B为含0.1%乙酸的水, 梯度洗脱法进行组分分析, 60 min内乙腈由10%渐变为100%。收集不同保留时间的出峰组分, 60 ℃浓缩样品, 甲醇溶解代谢物, 进行抑菌作用分析。

采用平皿对峙培养法分析WY8-7抑菌作用, 将禾谷镰刀菌接种到PDA平板中央, 在周围距中央3 cm处的4点打孔, 分别加入不同保留时间收集的组分, 并以甲醇为阴性对照, WY8-7总提取物为阳性对照, 接种后于28 ℃培养箱中培养4 d, 检测抑菌效果。

1.6.2 代谢物质的质谱检测

对峙培养中有抑菌作用的物质进行质谱定性分析。超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF-MS, Waters Corporation, 美国), 采用电喷雾(ESI)离子源, 干燥气流量800 L · h-1, 温度350 ℃; 雾化气为高纯氮气, 压力6.9×105 Pa; 碰撞气为高纯氩气, 碰撞能量为20~40 V, 正离子模式下采集数据, 扫描范围(m/z)为100~1 600;选取代谢物母离子, 碰撞诱导解离后, 进行二维质谱解析, 检测其碎片离子。

1.7 数据处理与分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计处理。3次重复取平均值, 采用单因素方差分析, 进行独立性t测验分析, 计算标准偏差(SD)和显著性差异。

2 结果与分析 2.1 溶磷微生物的筛选

采用难溶性磷酸钙平板筛选法, 从茶树根际土壤中筛选到具有高效溶磷作用的菌株WY8-7, 在平板打孔和滤纸片培养中均有较好的溶磷效果(图 1)。菌株WY8-7在无机磷固体培养基中培养3 d后, D/d为3.50, 表明菌株WY8-7具有较好的溶磷活性。

图 1 菌株WY8-7对难溶性无机磷的溶磷效果 Fig. 1 P-solubilizing activity of strain WY8-7 on inorganic phosphorus CK:空白的无机磷固体培养基; WY8-7:空白无机磷固体培养基接种WY8-7, 箭头标注位置为细菌菌落周边形成的溶磷圈。 CK:Solid medium containing inorganic phosphorus; WY8-7:Solid medium containing inorganic phosphorus inoculated with bacteria WY8-7, and white arrow point to the transparent zone formed by strain WY8-7.
2.2 生物学鉴定 2.2.1 形态学与生理生化鉴定

菌株WY8-7涂布于NA培养基培养24 h后, 菌落为乳白色, 边缘不规则, 表面粗糙, 不透明, 菌落干燥且表面呈褶皱状, 革兰氏染色阳性, 可形成芽胞。

菌株WY8-7可利用α-D-葡糖、D-山梨醇、D-半乳糖酸、D-甘露糖、L-苹果酸、D-海藻糖、肌醇、L-天冬氨酸、D-葡糖酸、D-纤维二糖、甘油和柠檬酸等碳源, 具有高耐盐性(80 mg · mL-1 NaCl), 耐酸性(pH5), 对氯化锂、乳酸钠、丁酸钠、溴酸钠、四唑蓝、四唑紫和亚碲酸钾等化学物质具有耐受性, 与BIOLOG MicroStationTM System微生物鉴定系统中存在的微生物进行比对, 发现菌株WY8-7生化反应结果与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)相似度最高, 因此, 初步将其归类为枯草芽胞杆菌。

2.2.2 分子生物学鉴定

菌株WY8-7的16S rRNA序列经GenBank数据库比对分析可知, 扩增序列与芽胞杆菌属相似度最高, 确定为芽胞杆菌属细菌。为进一步确定该菌株的分类地位, 挑选已鉴定且同源性高的同属不同种菌株, 进行系统发育树分析(图 2)。结果显示, WY8-7与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)亲缘关系最近, 同源性最高, 可聚于同一分支。结合表型观察、生理生化试验、系统发育树分析, 菌株WY8-7均与枯草芽胞杆菌具有相同特征, 故将其鉴定为枯草芽胞杆菌, 菌株的GenBank登录号为MK430907。

图 2 菌株WY8-7及其近缘种的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of strain WY8-7 and other homologous strains based on 16S rRNA sequences
2.3 菌株WY8-7的溶磷效果 2.3.1 菌株WY8-7在液体和土壤中的溶磷作用

液体培养结果(图 3-A)表明:对照组在整个培养期内, 可溶性磷含量未明显改变, 始终维持在较低水平; 菌株WY8-7具有较好的溶磷活性, 显著提升水溶液中的可溶性磷含量, 从培养3 d开始, 可溶性磷含量呈线性增长, 在20 d时, 可溶性磷含量为512.77 mg · L-1, 是对照组的174倍。菌株WY8-7在土壤环境中具有溶磷活性, 可溶解难溶性无机磷, 转变为可溶性磷(图 3-B); 培养3 d时, 可溶性磷含量达到2.24 mg · kg-1, 明显高于对照组中的磷含量(1.24 mg · kg-1); 培养6 d内, WY8-7添加组可溶性磷含量不断增加, 最高达2.54 mg · kg-1; 培养后期, 受微生物活性或土壤因素影响, 可溶性磷含量逐渐降低。

图 3 菌株WY8-7在液体(A)和土壤(B)环境中的溶磷效果 Fig. 3 P-solubilizing activity of the strain WY8-7 in water (A) and soil (B) conditions CK:对照组The control treatment; WY8-7:添加WY8-7菌悬液的处理组The treatment with strain WY8-7. *P < 0.05. The same as follows.
2.3.2 菌株WY8-7的盆栽试验

接种WY8-7处理后玉米植株长势较好, 单株和盆栽效果均明显优于对照组(图 4)。WY8-7处理组中, 玉米叶长、叶宽、单叶叶面积、叶片数、茎粗、株高、鲜质量、地上干质量、地下根部干质量等各项指标分别增加了17.68%、22.08%、42.62%、1.19%、18.97%、20.34%、20.59%、44.26%和29.03%, 其中以叶长、叶宽、单叶叶面积、株高、鲜质量增加显著(P < 0.05)(表 1)。这说明溶磷微生物WY8-7在土壤中具有较好的促生长作用。

图 4 WY8-7对玉米苗期生长的影响 Fig. 4 Effect of strain WY8-7 on the growth of maize seedling
表 1 菌株WY8-7对苗期玉米生长的影响 Table 1 Effect of strain WY8-7 on the growth of maize seedling
生长指标Growth index 对照组Control WY8-7
叶长/cm Leaf length 26.69±0.83 31.41±0.32*
叶宽/cm Leaf width 2.40±0.09 2.93±0.04*
单叶叶面积/cm2 Single leaf area 48.41±3.03 69.04±1.23*
单株叶片数Number of leaves per plant 8.40±0.16 8.50±0.22
茎粗/cm Stem thick 0.58±0.02 0.69±0.03
株高/cm Plant height 30.23±0.54 36.38±1.10*
单株鲜质量/g Fresh weigh per plant 5.73±0.02 6.91±0.18*
单株地上干质量/g Dry weight of the aboveground tissue per plant 1.22±0.03 1.76±0.06
单株地下根部干质量/g Dry weight of underground root per plant 0.31±0.02 0.40±0.01
注:单叶叶面积为自下而上第3片鲜叶。
Note:Single leaf area is the area of the third leaf from bottom to top.
2.4 菌株WY8-7对不同病原真菌的广谱抑菌作用

培养3~5 d后观察真菌生长状况。结果(图 5)显示, 菌株WY8-7具有较好的抑菌效果, PDA培养基内可抑制黄曲霉菌、禾谷镰刀菌和禾谷炭疽菌的生长, 对3种真菌的抑菌率分别为61.01%、68.72%和87.34%。

图 5 菌株WY8-7对多种病原真菌的抑制作用 Fig. 5 The inhibitory effect of strain WY8-7 against different fungal pathogen

进一步收集WY8-7的发酵无菌上清液, 并检测其对禾谷炭疽菌菌丝生长的抑制作用。结果(图 6)显示:培养3 d后, 对照组中禾谷炭疽菌菌丝生长茂盛, 产生大量新鲜的气生菌丝; WY8-7无菌上清液添加组中, 禾谷炭疽菌生长受到明显抑制, 气生菌丝稀疏, 上清液稀释4倍后, 其可完全抑制菌丝生长。这表明菌株WY8-7发酵上清液中含有抑菌活性物质。

图 6 菌株WY8-7发酵无菌上清液对禾谷炭疽菌的抑制作用 Fig. 6 The inhibitory effect of supernatant broth of WY8-7 against Colletotrichum graminicola 2×、4×和6×分别为WY8-7无菌上清液被PDA培养基稀释后的倍数; CK为未添加上清液的PDA培养基。 2×, 4× and 6× mean the dilution times of supernatant broth with PDA medium; CK means PDA medium without supernatant broth of WY8-7.
2.5 菌株WY8-7的抑菌代谢物质鉴定 2.5.1 WY8-7代谢物的提取与高效液相色谱检测

提取WY8-7发酵物进行高效液相色谱检测, 按照色谱峰保留时间, 检出物质可分成3大峰簇, 分别收集相关组分, 浓缩后进行抑菌分析。结果(图 7-B)显示:峰簇3收集物质具有明显抑菌作用, 可以抑制禾谷镰刀菌菌丝生长, 峰簇1和峰簇2收集物质无明显抑菌作用, 表明WY8-7代谢物中确实存在高活性抑菌物质, 其保留时间为30~40 min。

图 7 WY8-7代谢产物的HPLC收集(A)以及抑菌作用(B) Fig. 7 Fractions of strain WY8-7 collected from HPLC (A) and the inhibitory activity (B) analysis 1、2、3表示收集不同时间段HPLC组分, 4为总代谢提取物的抑菌作用。 1, 2 and 3 indicated that the fractions collected at 0-10, 10-20, 30-40 min through HPLC, and 4 was the antifungal acitivity of total extraction of WY8-7 broth.
2.5.2 WY8-7代谢物质的质谱检测

采用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱分析峰簇3中的代谢物质, 共检出2种物质, 经母离子比对分析, 初步确定为脂肽类物质, 与伊枯草菌素A和丰原素的理论分子质量相同。伊枯草菌素A检出2种同系物, 质荷比(m/z)分别为1 043.550 3和1 057.564 1, 推测长链脂肪酸的碳原子数为14和15;丰原素检测到2种物质, m/z分别是1 449.790 6(图 8-A)和1 463.804 7(图 8-B)[17]。二级质谱分析显示, 丰原素的2个同系物中均含有1 080和966这2种碎片离子, 确定2种物质均为丰原素A, 脂肪酸碳链中碳原子数分别为15和16[17]。因此, WY8-7中共检出2种抑菌物质, 分别为伊枯草菌素A和丰原素A, 且每种物质均有2种同系物(表 2)。

图 8 丰原素在m/z为1 449.790 6(A)与1 463.804 7(B)的碰撞诱导解离碎片图谱 Fig. 8 Collision induced dissociation spectrum of fengycin at m/z 1 449.790 6(A)and 1 463.804 7(B)
表 2 WY8-7产脂肽类代谢产物鉴定 Table 2 Identification of lipopeptide produced by strain WY8-7
名称Name 质荷比(m/z) Mass-charge ratio 归类Classification
伊枯草菌素A Iturin A 1 043.550 3[M+H]+
1 057.564 1[M+H]+
C14 iturin A
C15 iturin A
丰原素A Fengycin A 1 449.790 6[M+H]+
1 463.804 7[M+H]+
C15 fengycin A
C16 fengycin A
注:C14—C16:脂肪酸碳链的长度。C14-C16 mean the carbon length of fatty acid in each compound.
3 讨论

微生物溶磷是改善土壤磷肥状况的重要手段。到目前为止, 已报道多种微生物具有溶磷生物活性, 在液体振荡培养条件下, 可将难溶性无机磷转化为可溶性磷, 提升有效磷含量。如张云霞等[18]报道的枯草芽胞杆菌JT-1, 在振荡培养条件下的溶磷量达386.25 mg · L-1; 余贤美等[19]筛选到1株洋葱伯克霍尔德氏菌PSB3, 液体培养条件下其上清液中的含磷量最高达218.6 μg · mL-1; 戴沈艳等[20]获得的溶磷细菌液体培养后溶磷量达240.1 mg · L-1。本研究从百年树龄茶树根际土壤中, 筛选到枯草芽胞杆菌WY8-7, 液体培养20 d内, 溶磷量呈线性增高, 最高达512.77 mg · L-1, 为对照组的174倍, 显著高于现阶段报道的溶磷菌。另外, 菌株WY8-7在土壤中也具有一定的溶磷活性, 随处理时间延长, WY8-7处理组磷含量不断升高, 到第6天时磷含量达到最高(2.5432 mg · kg-1), 显著高于对照组。菌株WY8-7可促进苗期玉米生长, 对玉米叶宽、单叶叶面积、株高、地上干质量、地下根部干质量等促生长作用明显, 增长率高达20.34%~44.26%, 表明WY8-7可以改善土壤肥力状况, 促进植物吸收及生长。然而, 土壤试验后期, 磷含量呈缓慢下降趋势, 这与张云霞等[18]、王琰[21]研究结果相似, 可能是由于盆栽试验受环境条件的影响。随时间的延长, 土壤营养物质减少, 有害物质积累, 并且受外界微生物的干扰, 溶磷菌活性由强转弱, 且溶磷能力逐渐降低; 同时, 土壤中金属离子对磷的再次固定消耗, 导致培养后期可溶性磷含量变低。植物生长过程中影响因素众多, 除肥力因素外, 还受微生物、土壤和植物自身因素共同作用[22]。菌株WY8-7对植物生长的作用及溶磷微生物-土壤-植物三者之间的相互关系, 是后续研究的重点和难点。

溶磷微生物的应用以芽胞杆菌最为广泛, 但到目前为止, 筛选的芽胞杆菌多数仅具有单一溶磷活性, 除少数报道的复合解钾、抑制线虫作用外, 尚未有抑菌功能的报道。本研究中, 筛选的溶磷枯草芽胞杆菌WY8-7, 同时具有广谱抑菌作用, 可抑制黄曲霉菌、禾谷镰刀菌和禾谷炭疽菌的生长, 抑菌率最高达87.34%。WY8-7的抑菌生物活性扩大了其应用范围, 在促进土壤肥力改善的同时, 可抑制多种土传真菌病害的发生, 为新型抑菌生物菌肥的开发提供很好的试验材料。经UPLC-Q/TOF-MS进一步检测发现, WY8-7产生的抑菌物中含有2类抑菌物质, 分别为伊枯草菌素A和丰原素A, 且2种物质均含有2种同系物。伊枯草菌素和丰原素是芽胞杆菌中常见的脂肽类抑菌物质, 可导致真菌细胞膜穿孔, 细胞内容物外渗, 造成病原菌死亡, 是其抑菌的主要作用机制[17]。与此同时, 有研究表明, 脂肽类物质还具有多种生物功能, 能诱导寄主植物抗病反应, 提升植物对病原菌的抵抗作用[23-25], 并能促进西红柿、辣椒、烟草、拟南芥、黄瓜等植物的生长, 为良好的生物菌剂[26]。2种不同结构的脂肽类物质, 具有不同的生物活性和抑菌机制, 这在一定程度上扩大了菌株WY8-7的应用范围, 有利于多功能高效微生物菌剂的研发。

综上所述, 本研究筛选到1株兼具溶磷、抑菌和促生长作用的枯草芽胞杆菌WY8-7, 可转化水体和土壤中难溶性无机磷, 促进植物生长, 并产生伊枯草菌素A和丰原素A两类脂肽类物质, 抑制多种病原真菌生长, 具有较好的生物活性, 为新型抑菌生物肥料的研制提供重要材料。

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