南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (3): 543-550   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201809031
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赵楠, 刘强, 魏康丽, 潘磊庆, 屠康, 张伟
ZHAO Nan, LIU Qiang, WEI Kangli, PAN Leiqing, TU Kang, ZHANG Wei
基于近红外高光谱成像技术的鸡蛋污染过程中菌落总数可视化研究
Visualization of the total viable count of bacteria during the polluted process of eggs based on near infrared hyperspectral imaging technology
南京农业大学学报, 2019, 42(3): 543-550
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(3): 543-550.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201809031

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收稿日期: 2018-09-20
基于近红外高光谱成像技术的鸡蛋污染过程中菌落总数可视化研究
赵楠1 , 刘强1 , 魏康丽1 , 潘磊庆1 , 屠康1 , 张伟2     
1. 南京农业大学食品科学技术学院, 江苏 南京 210095;
2. 南京晓庄学院食品科学学院, 江苏 南京 211171
摘要[目的]为探讨鸡蛋污染过程中微生物总量无损预测的可行性,本文研究了一种基于近红外高光谱成像技术可视化鸡蛋中菌落总数的无损预测方法。[方法]将鸡蛋样本在接种大肠杆菌和铜绿假单胞菌的混合菌悬液后储存,采集并统计不同污染程度鸡蛋样本的原始高光谱信息和菌落总数信息;在完成最佳预处理方法筛选后,结合连续投影算法(SPA)分别建立了基于全波段和特征波段光谱信息下的偏最小二乘法(PLS)和支持向量机(SVM)菌落总数预测模型;优选出相对最佳预测模型后进一步实现对鸡蛋内部污染程度的可视化研究。[结果]二阶导数预处理效果相对最佳,其中交叉验证集相关系数RCV为0.88,交叉验证集均方根误差为0.82 lg(CFU·g-1);鸡蛋中菌落总数的相对最佳预测模型为基于特征波段下SVM模型,其中建模集相关系数RC为0.88,预测集相关系数RP为0.84,建模集和预测集均方根误差分别为0.86和0.97 lg(CFU·g-1);根据鸡蛋内部污染程度及光谱特性的差异,建立了鸡蛋内部污染程度伪彩色图像。[结论]近红外高光谱成像技术结合化学计量学及图像处理方法,可实现对鸡蛋内部菌落总数的无损预测及污染程度的可视化,该技术可以为鸡蛋的安全性在线检测提供参考。
关键词鸡蛋   近红外高光谱成像   菌落总数   模型   可视化   
Visualization of the total viable count of bacteria during the polluted process of eggs based on near infrared hyperspectral imaging technology
ZHAO Nan1, LIU Qiang1, WEI Kangli1, PAN Leiqing1, TU Kang1 , ZHANG Wei2    
1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. School of Food Science, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China
Abstract: [Objectives] To discuss the possibility of the non-destructive prediction of the total viable count of bacteria in the polluted eggs, this paper explored a non-destructive method that using near infrared hyperspectral imaging to predict and visualize the total viable count of bacteria in eggs. [Methods] Egg samples were inoculated with the mixture solution of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, then the original hyperspectral information and the total viable count of bacteria of eggs in different pollution levels during storage were collected. After selecting the best pretreatment method in this experiment, the predicting model by partial least squares (PLS) and support vector machine (SVM) model were developed based on full wavelengths and the feature wavelengths via the successive projections algorithm (SPA). Finally, the relative best prediction model of the viable count of bacteria was selected and the visualization study of the bacteria was realized in eggs. [Results] The second derivative method was the relative best pretreatment method, the correlation index of cross validation (RCV) was 0.88, and the root mean square error of cross validation was 0.82 lg (CFU·g-1). The relative best prediction model was the SVM model which was based on the feature wavelengths, the correlation index of calibration (RC) and prediction (RP) was 0.88 and 0.84, and the root mean square error of calibration and prediction was 0.86 and 0.97 lg (CFU·g-1), respectively. The visualized images of the polluted levels in eggs were built based on the difference of the pollution levels and spectral characteristics. [Conclusions] The near infrared hyperspectral imaging technology, and multivariate statistical and image processing methods can realize the prediction and visualization of the total viable count of bacteria in eggs, and this technology can also provide the foundation for on-line detection of the egg security.
Keywords: egg    near infrared hyperspectral imaging    total viable count of bacteria    model    visualization   

作为人体优质蛋白质的重要来源, 鸡蛋中含有丰富的维生素、脂肪酸和钙、铁、硒多种矿物质, 易被人体消化吸收, 对于提高人体免疫力、保护肝脏、预防癌症等方面具有积极意义[1]。但是, 鸡蛋在运输及储存过程中极易受微生物污染而发生腐败、变质, 但由于蛋壳的包裹, 鸡蛋内部污染情况无法直接观察得知, 因此鸡蛋内部安全问题受到大家高度重视。

对腐败鸡蛋液进行微生物分离和鉴定可以发现, 其腐败变质主要由细菌引起, 大肠杆菌和假单胞菌属可以视为鸡蛋腐败过程中的优势致病和致腐菌属[2]。铜绿假单胞菌属于假单胞菌属, 在侵染过程中会分解蛋内氨基酸等营养物质, 产生有毒、有害代谢产物从而使蛋清变绿, 加速鸡蛋的腐败、变质[3-4]。菌落总数的测定一般采用平板菌落计数法[5], 该方法虽然精度高, 但存在多种弊端, 难以满足在线大批量检测要求[6], 并且无法得到菌落数量的细致分布情况, 因此开发快速预测鸡蛋中菌落总数并对其进行可视化研究对维护蛋品安全及消费者权益有重要意义。

近红外高光谱成像技术作为一种将图像和光谱信息融合的新型快速无损检测技术, 可实现对所测样品的外观特性、内部组成成分和微观结构的检测[7-8]。目前近红外高光谱成像技术已广泛应用于肉品中微生物含量的预测及可视化研究[9-13], 其结果均表明样品在受到微生物侵染后会在光谱及图像上产生差异, 进而以特征光谱图像信息反映出来。但是由于受表面蛋壳影响, 关于鸡蛋内容物中菌落总数的研究还鲜有报道, 故本试验通过收集不同污染程度鸡蛋样本的高光谱信息和菌落信息, 结合多元统计分析及图像处理方法, 实现近红外高光谱技术对鸡蛋中菌落总数的定量预测, 进一步结合高光谱数据中空间信息进行伪彩色处理, 对鸡蛋内部污染程度进行可视化研究, 以期为鸡蛋内部的安全性研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试材料取自南京市六合养鸡场, 选取(60±5)g、形状(蛋形指数为1.25±0.15)相近、颜色均一(颜色参数值:L*为79±2, a*为5±2, b*为16±3)的新鲜‘海兰’粉壳鸡蛋样本250枚。

大肠杆菌(Escherichia coli)及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均购于广东省微生物菌种保藏中心, 购买后立即活化并于4 ℃条件下保存待用。

大肠杆菌液体培养基配方:胰蛋白胨10.00 g, 酵母浸膏5.00 g, 氯化钠10.00 g, 水1 000 mL, pH(7.4±0.1);铜绿假单胞菌液体培养基配方:蛋白胨10.00 g, 牛肉浸膏3.00 g, 氯化钠5.00 g, 水1 000 mL, pH(7.3± 0.1)。营养琼脂培养基:平板计数琼脂用于细菌总数的计算; 结晶紫中性红胆盐琼脂用于大肠杆菌计数。

1.2 仪器与设备

近红外高光谱图像检测系统:ImSpectorV 10E成像光谱仪(芬兰Specim公司), Raptor EM285CL摄像机(英国Raptor Photonics有限公司), IT 3900 150 W卤素光源(美国Illumination Technologies公司), IRCP0076视觉平台(中国台湾Isuzu公司), 配有图像采集软件的计算机(中国台湾五铃光学股份有限公司), 恒温恒湿箱(宁波海曙赛福实验仪器有限公司), 紫外超净台(苏州苏净安泰有限公司), 振荡培养箱(常州国华电器有限公司)。

1.3 试验方法

将大肠杆菌和铜绿假单胞菌转接至相应的液体培养基中, 于35 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养15和18 h后分别转接至新的相应的液体培养基中, 再分别振荡7和8 h后进行倍比稀释至104 CFU · mL-1后备用[3]

将鸡蛋分为污染组和对照组, 紫外灭菌10 min后, 采用刺穿接种的方式在污染组150枚鸡蛋蛋清中接入0.5 mL混合菌悬液, 对照组100枚鸡蛋蛋清中接入0.5 mL无菌生理盐水。为保证接种时不破坏蛋黄膜并将菌悬液或生理盐水注射至蛋清内部, 注射位置为鸡蛋赤道垂直向下2 cm处(图 1), 伤口直径0.56 mm, 深度2 cm。将2组鸡蛋储存于20 ℃、相对湿度为50%的恒温恒湿箱中, 每天取15枚污染组、10枚对照组鸡蛋进行高光谱信息的采集和菌落计数, 累计取10 d。

图 1 鸡蛋注射部位示意图(A)和高光谱成像系统结构示意图(B) Fig. 1 The injection place of the egg(A)and hyperspectral imaging system(B)

试验过程中所有的培养基、试验材料及试验所用设备均灭菌处理。

1.4 高光谱成像数据采集 1.4.1 高光谱图像获取

本试验采用图 1所示的近红外高光谱成像系统获取鸡蛋样本(水平放置)的反射图像及光谱信息。其波长范围为982~2 562 nm, 光谱分辨率为6.2 nm, 相机镜头和光源距拍摄物的距离分别为30.00 cm和20.50 cm。为减少光照阴影的产生将卤钨灯光源以45°角对准样本, 并将光源功率设定为200 W, 曝光时间设定为2 ms, 输送速度设定为13.78 mm · s-1以获得较高质量的鸡蛋图像。

1.4.2 高光谱图像校正

图像信息采集后对其进行黑白校正以消除噪声影响[14]。在样本图像采集相同的条件下, 扫描聚四氟乙烯白板(反射率为99%)得到全白的反射图像, 覆盖相机镜头得到全黑的反射图像, 然后通过公式得到校正后的图像。R=(R0-B)/(W-B)。式中:R为校正后信号强度; R0为原始信号强度; B为全黑的标定信号强度; W为全白的标定信号强度。

1.5 菌落总数的测定

将采集完高光谱信息的鸡蛋打开, 蛋清和蛋黄混合均匀后参照文献[5]进行菌落计数。

1.6 化学计量学分析 1.6.1 光谱预处理

编写自动提取感兴趣区域的代码, 利用MATLAB 7.1软件自动提取鸡蛋中心部位矩形区域10 000个像素点(100×100)的平均光谱作为鸡蛋样本的光谱值, 为消除试验过程中由环境或仪器所产生的噪声影响, 将提取的原始光谱进行预处理, 以交叉验证集相关系数(RCV)和交叉验证集均方根误差(RMSECV)为判断指标优选出最佳预处理方法[15]

1.6.2 特征波长的筛选

采用连续投影算法(SPA)对样本全波段光谱进行特征波段的提取。

1.6.3 模型的建立及评估

对原始全波段光谱进行特征波段筛选后, 根据偏最小二乘法(PLS)和支持向量机(SVM)算法, 分别构建基于全波段和特征波段光谱下的菌落总数预测模型。以建模及预测集相关系数RCRP、建模及预测均方根误差RMSECRMSEP用于模型性能评估。

1.6.4 菌落总数的可视化研究

提取鸡蛋图像上各点的光谱值后, 结合最佳预处理方法和菌落总数预测模型对图像中各点的菌落数量进行预测, 并通过中值滤波算法对鸡蛋图像表面进行平滑处理后, 用不同的颜色表示不同的菌落数量, 这样将图像进行伪彩色处理后便可获得由不同颜色组成的鸡蛋样本图像, 也称为鸡蛋的伪彩色图像。

2 结果与分析 2.1 鸡蛋污染过程中微生物生长情况分析

图 2可得:随储存时间的延长, 污染组鸡蛋中菌落总数整体呈上升趋势, 对照组先上升后趋于平稳。这是由于在储存过程中, 2组鸡蛋均存放于无菌的恒温恒湿箱中, 对照组在5 d时, 只有极少量蛋壳上的菌经气孔进入了鸡蛋内部, 在微生物数量及储存时间的限制下, 整体生长趋势平稳; 污染组鸡蛋样本初始菌落数为3.41 lg(CFU · g-1), 2 d时菌落总数出现小幅度下降, 这是由于蛋清中的溶菌酶和卵转铁蛋白等抗菌成分对外界病原微生物的抵抗作用所造成的[16]。在初始培养3 d内, 菌落数量增幅仅为0.1 lg(CFU · g-1); 10 d后增幅达到5.8 lg(CFU · g-1), 这是由于在接种的初始阶段, 菌种进入新的环境后存在一定适应阶段, 随后蛋液为微生物的生长提供充足的营养物质, 从而促使微生物出现快速生长繁殖的现象。试验终点时污染组菌落总数为9.33 lg(CFU · g-1), 而对照组菌落总数仅为0.84 lg(CFU · g-1), 远低于污染组。

图 2 蛋液中菌落总数的变化 Fig. 2 The change of the total viable count of bacteria in the liquid egg
2.2 污染鸡蛋样本的光谱分析

图 3可知:鸡蛋中微生物数量越多即污染程度越高, 而对应的平均光谱反射率越低, 其中在波峰1 340、1 596 nm和波谷1 493 nm处表现最为明显。在1 340、1 493和1 596 nm处分别对应C—H、N—H和O—H键的吸收峰, 宏观表现为脂类、蛋白质以及水分的吸收[11-12, 17]。随着微生物数量的增加, 蛋液中营养物质被分解, 使原有的结构遭到破坏, 同时在微生物生长过程中产生的次级代谢产物(如色素、毒素等)会进一步加剧对蛋液结构的破坏, 出现蛋清变稀变浑浊、蛋黄膜被破坏、散黄等现象, 最终导致蛋液对光的吸收能力变强, 反射能力变弱[18-19]

图 3 不同污染程度鸡蛋样本的平均光谱值 Fig. 3 The average spectral reflectance of samples in different pollution levels A.原始光谱值Original spectra; B.二阶导数光谱值Second derivative spectra.

二阶导数作为最常用的光谱预处理方法可以有效消除由背景带来的噪声, 提高光谱分辨率。图 3-B为将原始光谱进行二阶导数转换后的结果, 图中1 020、1 084、1 151和1 305 nm处表现出很明显的特征峰, 其中1 020和1 151 nm分别对应蛋白质和脂肪的吸收峰, 1 084和1 305 nm对应C—H的吸收峰[17]

2.3 污染鸡蛋样本光谱预处理 2.3.1 样本集的划分

根据K-S邻近算法, 采用Liu等[20]的方法对污染组150个鸡蛋样本以2 : 1的比例进行建模集和预测集的划分(建模集/预测集=100/50)。样本统计结果见表 1。样本建模集范围均涵盖了预测集范围, 表明样本的划分具有合理性。

表 1 建模集与预测集样本菌落数量的统计 Table 1 Statistical results of the total viable count of bacteria in samples calibration and prediction sets
样本集
Sample set
样本数
Number of sample
菌落总数/lg(CFU·g-1) The total viable count of bacteria
最大值Maximum 最小值Minimum 平均值Mean 标准差SD
建模集The calibration 100 9.35 2.00 4.21 1.82
预测集The prediction 50 8.38 2.32 4.10 1.67
2.3.2 预处理方法的选择

为消除背景噪声及特定物理因素的干扰, 提高光谱与菌落总数之间的相关性, 对原始光谱分别进行标准化、一阶导数、二阶导数、变量标准化算法和多元散射校正预处理后建立PLS模型, 以RCVRMSECV为判断指标优选出最佳预处理方法。

表 2可知:基于原始光谱建立的PLS模型中RCV为0.84, RMSECV为0.90 lg(CFU · g-1)。经光谱预处理后, 除标准化预处理外, 其他预处理方法下模型的RCV均有所上升(上升范围0.02~0.04), RMSECV均有所下降, 说明一阶导数、二阶导数、多元散射校正、变量标准化算法预处理方法均可在一定程度上去除原始光谱中的噪声信号, 提高模型的建模效果, 其中二阶导数预处理效果相对最好, RCV为0.88, RMSECV为0.82 lg(CFU · g-1)。

表 2 基于不同预处理方法下的建模结果 Table 2 Performance of PLS calibration models of samples via different pretreatment methods
预处理方法
The pretreatment methods
最佳主成分数
The best principal component numbers
RCV RMSECV/lg(CFU·g-1)
原始光谱Original spectra 8 0.84 0.90
自动标准化Autoscale 8 0.75 1.13
一阶导数The first derivative 8 0.86 0.85
二阶导数The second derivative 6 0.88 0.82
多元散射校正Multiplicative scatter correction 6 0.87 0.84
变量标准化算法Standard normalized variate 6 0.87 0.84
注: RCV:交叉验证集相关系数The correlation index of cross validation; RMSECV:交叉验证集均方根误差The root mean square error of cross validation.
2.4 基于全波段和特征波段的建模 2.4.1 SPA提取特征波长

根据SPA算法得出的RMSE值大小作为挑选特征变量数的依据, 挑选结果如图 4所示。当变量数为12时, RMSE最小为1.15 lg(CFU · g-1), 此后随变量数的增加, RMSE值不再减小, 因此经SPA算法共筛选出12个特征波段, 波长分别为995、1 277、1 334、1 355、1 392、1 421、1 464、1 509、1 589、1 619、2 143、2 545 nm。

图 4 样本光谱的SPA筛选图(A)和被选中的波段(B) Fig. 4 SPA screening of spectrum(A)and the wavelength bands selected in spectrum(B)
2.4.2 模型建立

以全波段和SPA筛选出的特征波段下的光谱值为自变量, 样本中菌落总数为因变量, 分别建立PLS和SVM模型。模型结果见表 3

表 3 样本中菌落总数预测模型 Table 3 The predictive model of the total viable count of bacteria in the egg samples
模型
Model
波段筛选
The choose ofwavelength
波段数
The number ofwavelength
建模集The calibration 预测集The prediction
RC RMSEC/lg(CFU·g-1) RP RMSEP/lg(CFU·g-1)
PLS 全波段Full wavelengths 256 0.91 0.75 0.85 0.89
SPA-PLS 特征波段Feature wavelengths 12 0.74 1.16 0.72 1.27
SVM 全波段Full wavelengths 256 0.84 0.96 0.81 1.05
SPA-SVM 特征波段Feature wavelengths 12 0.88 0.86 0.84 0.97

表 3可以看出:全波段-PLS模型的RC为0.91, RP为0.85, RMSECRMSEP分别为0.75和0.89 lg(CFU · g-1); SPA-PLS模型预测精度明显降低, RCRP下降为0.74和0.72, RMSECRMSEP上升为1.16和1.27 lg(CFU · g-1), 说明SPA算法在剔除原始高光谱中大量冗余信息的同时亦剔除小部分有效信息, 致使整体模型的预测精度轻微下降; 全波段-SVM模型中RC为0.84, RP为0.81, RMSECRMSEP分别为0.96和1.05 lg(CFU · g-1), 经SPA算法提取特征波段后, 模型的预测效果有所提高, 其中RP为0.84, RMSEP为0.97 lg(CFU · g-1), 略低于全波段-PLS模型预测能力, 但差异并不显著(P>0.05)。此外, SPA算法将原始256个波段降低为12个, 只保留了5%的原始信息, 极大程度提高了模型的运算速度, 因此综合分析可知SPA-SVM模型为相对较优的鸡蛋中菌落总数的预测模型。其预测效果如图 5

图 5 菌落总数SPA-SVM建模效果 Fig. 5 The SPA-SVM model of the total viable count of bacteria in the egg samples
2.5 鸡蛋污染程度可视化研究

图 6表示不同污染程度鸡蛋样本的伪彩色图像。随着微生物数量的增多, 颜色由蓝色逐渐变为黄色, 继而变红, 这样通过伪彩色处理预测后的鸡蛋灰度图像可直观地对鸡蛋内部污染程度进行预测。

图 6 不同污染程度下鸡蛋样本的伪彩色图片 Fig. 6 The pseudo color images of the eggs in different polluted levels 数值表示菌落总数。红色:菌落数量最多; 蓝色:菌落数量最少。 Data represent the total viable count of bacteria.Red:The largest number of colonies; Blue:The smallest number of colonies.
3 讨论

由于鸡蛋污染微生物来源广泛、污染情况复杂, 故国内外学者主要采用近红外[21]、电子鼻[22]和计算机视觉[23]等无损技术对鸡蛋内部宏观指标如哈夫单位、蛋黄指数和蛋清pH等的研究较多, 而关于鸡蛋内部菌落总数这一微观指标却鲜有报道, 同时由于传统微生物检测需要破壳取样, 很难满足在线大批量检测。因此, 本研究基于近红外高光谱技术对鸡蛋污染过程中菌落总数进行了无损预测。对鸡蛋接种大肠杆菌和铜绿假单胞菌后, 发现随着污染程度的增加, 样本光谱呈现下降趋势; 基于原始光谱进行了预处理方法筛选, 结果表明二阶导数效果相对最佳, 其中RCV为0.88, RMSECV为0.82 lg(CFU · g-1)。

试验过程中采用SPA进行特征波段筛选是由于原始全波段光谱数据量大、含有较多的冗余和共线信息, 会严重降低模型的预测精度和运算速度。而SPA是一种采用前向选择特征波段的算法, 该算法在初始条件下选择一个波长, 前向循环, 依次计算其他波长在此波长下的投影向量, 挑选投影值最大的向量对应的波长, 并与初始波长进行组合, 直至循环结束, 因此采用SPA提取的特征波段具有共线性小、冗余度低的性能, 可以代表样本整体的光谱信息[24]

本研究中, 对比全波段和特征波段下的PLS和SVM模型, 发现SPA-SVM模型的预测效果相对最优, 其中RC为0.88, RP为0.84, RMSECRMSEP分别为0.86和0.97 lg(CFU · g-1), 这是由于偏最小二乘法(PLS)作为新型的多元数据统计方法, 其目的在于寻找关联程度最大的自变量和因变量组合, 以便更好解释因变量的变异信息[15], 而支持向量机(SVM)以统计学习理论的VC维理论和结构风险最小原理为基础, 将向量映射到超平面中, 在此高维空间中对样本集进行分类或回归预测。因此相对于PLS来说, SVM算法不受空间维度影响, 建模向量关联程度小, 在解决小样本、非线性及高维模式识别中表现出较多的优势[25]

通过比较伪彩色图像, 发现部分区域的颜色出现竖线状。分析可能原因是:1)短波近红外波段对红外相机有较高的参数要求, 而目前的相机并不能满足相应的需求; 2)鸡蛋壳表面特有的凹凸不平纹理特征也会对伪彩色图像的呈现造成一定的影响。类似结果也出现在Suktanarak等[17]采用近红外高光谱可视化预测鸡蛋哈夫单位的研究中。

本研究采用近红外高光谱成像技术, 结合空间及近红外光谱信息优势, 初步实现了对鸡蛋中菌落总数的预测及污染程度的可视化, 具有预处理简单、快速和无损等优势, 填补了鸡蛋内部污染程度无损检测的空白, 为食品安全领域快速检测提供技术参考。但关于鸡蛋内部微生物的预测仍存在研究空间, 如鸡蛋品种、蛋壳的颜色及厚度、污染微生物的种类及浓度等是否会对模型的精度产生影响仍需要进一步研究。

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