南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (3): 421-429   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201805016
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刘嘉斐, 张璐, 孟永娇, 段莉莉, 罗雨薇, 李季, 陈劲枫
LIU Jiafei, ZHANG Lu, MENG Yongjiao, DUAN Lili, LUO Yuwei, LI Ji, CHEN Jinfeng
过表达钙调素类似蛋白基因CML25-like诱导黄瓜单性结实的研究
Study on cucumber parthenocarpy induced by over-expressing of calmodulin-like protein gene CML25-like
南京农业大学学报, 2019, 42(3): 421-429
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(3): 421-429.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201805016

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收稿日期: 2018-05-08
过表达钙调素类似蛋白基因CML25-like诱导黄瓜单性结实的研究
刘嘉斐 , 张璐 , 孟永娇 , 段莉莉 , 罗雨薇 , 李季 , 陈劲枫     
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/园艺学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]钙调素类似蛋白(calmodulin-like protein,CML)是一类含有EF-hand结构域的钙受体蛋白,与植物细胞的分裂及形态建成密切相关。本文基于前期克隆的一个黄瓜果实特异性表达基因CML25-like,研究其调控单性结实的机制。[方法]采用RT-qPCR方法研究CML25-like表达的时空特点;构建植物表达载体pLP100-35S-CML25-like,利用农杆菌介导子叶节法转化黄瓜自交系CCMC,并研究转基因植株的表达特点;观察转基因植株的表型,采用RT-qPCR方法检测其坐果期激素相关基因的表达变化。[结果]CML25-like在黄瓜幼叶和雌花中表达量最高,在雄花中表达量最低,而且CML25-like在果实发育过程中上调表达,在果实败育过程中下调表达;性状统计发现过表达CML25-like植株的单性结实率最高可达到98.25%,比对照CCMC提高了86%,而且单性结实果实与对照授粉果实的长度和横径均无明显差异。RT-qPCR检测结果显示,在转基因植株坐果期22个激素相关基因中有16个显著上调表达。[结论]CML25-like基因的活跃表达与果实发育密切相关,而且CML25-like能够诱导黄瓜单性结实,促进果实膨大,推测CML25-like通过上调弱单性结实黄瓜子房中激素相关基因表达而诱导单性结实。
关键词黄瓜   钙调素类似蛋白   单性结实   激素相关基因   
Study on cucumber parthenocarpy induced by over-expressing of calmodulin-like protein gene CML25-like
LIU Jiafei, ZHANG Lu, MENG Yongjiao, DUAN Lili, LUO Yuwei, LI Ji , CHEN Jinfeng    
State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] Calmodulin-like protein (CML), a class of Ca2+ binding proteins containing the EF-hand domain, are closely related to the division and morphogenesis of plant cells. Based on the cloned CML25-like gene which expressed specifically in the cucumber fruit, we studied its mechanism of regulating parthenocarpy. [Methods] RT-qPCR method was used to study the temporal and spatial characteristics of CML25-like expression. Plant expression vector pLP100-35S-CML25-like was constructed, the cucumber inbred line CCMC was transformed by Agrobacterium-mediated transformation method using cotyledon as explants, and the expression characteristics of the transgenic plants were studied. The phenotypes of transgenic plants were observed, and the expression changes of hormone-related genes in fruit-set period of transgenic plants were detected using RT-qPCR method. [Results] In transgenic plants, the expression level of CML25-like was the highest in young leaves and female flowers of cucumber, and the lowest in male flowers. Moreover, CML25-like was up-regulated expression during the fruit development, and down-regulated expression during the fruit abortion. Statistical results of traits showed that the parthenocarpy rate of transgenic plants of over-expressing CML25-like could reach to 98.25%, which increased 86% compared with control CCMC. And there were no significant differences in length and transverse diameter between the parthenocarpic fruits and control pollinated fruits. The results of RT-qPCR showed that 16 of the 22 hormone-related genes were significant up-regulated expression during the fruit setting of transgenic plants. [Conclusions] The active expression of CML25-like was closely related to fruit development, and CML25-like could induce parthenocarpy of cucumber and promote fruit enlargement. We inferred that CML25-like induced parthenocarpy by promoting the up-regulated expression of hormone-related genes in the ovaries of weakly parthenocarpic cucumber.
Keywords: cucumber    calmodulin-like protein    parthenocarpy    hormone-related genes   

黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科甜瓜属作物, 是世界十大蔬菜之一。据联合国粮食和农业组织(FAO)统计, 2016年全球黄瓜产量达到8 062×104t, 中国产量为6 194×104t, 占全球产量的76.7%, 而且设施栽培为其最主要的栽培模式。在黄瓜设施生产中, 坐花与坐果是产量形成的前提, 由于缺乏授粉媒介以及环境胁迫, 黄瓜植株会出现坐果率低、果实发育不正常、畸形果多等问题, 黄瓜产量和质量下降[1]。单性结实性可以很好解决这个问题, 是目前黄瓜新品种选育的热点之一。钙调素类似蛋白(calmodulin-like protein, CML)是一类含有EF-hand结构域的植物细胞特异性的钙受体蛋白。研究发现, CML与植物细胞的分裂及形态建成密切相关, 如拟南芥CML42功能缺失突变体表皮毛的分枝数目会显著增加[2]; CML还与植物生长发育过程中的光信号和激素信号介导相关, 如拟南芥CML39参与了光信号介导幼苗生长的过程[3]; 此外, CML也能够调控器官的形成与发育, 如拟南芥CML24功能敲除突变体开花延迟, 而功能获得性突变体则提前开花; 同时, 拟南芥CML24CML25基因可以调节花粉粒萌发和花粉管伸长[4-5], CML24基因的2个缺失突变体cml24-Tcml24-4的花粉萌发率较野生型低、花粉管伸长较野生型短, 而过量表达CML24基因可恢复正常表型。

钙调素(CaM)也是一类含有EF-hand结构域的钙受体蛋白, 与钙调素类似蛋白的结构相似, 在参与植物细胞分裂和形态建成、调控花粉萌发以及响应生物和非生物胁迫方面的作用与钙调素类似蛋白相似。研究表明, 钙调素蛋白可以调控果实发育, 例如在刺梨果实发育的中前期, CaM含量处于较高的水平, 而果实处于发育缓慢生长期时, CaM含量则处于低谷[6]。罗充等[7]研究发现梨果实CaM含量整体水平高, 在果实膨大期和成熟前含量低且稳定, 这可能是果实性状维持稳定的因素之一。在番茄果实的研究中, 还发现CaM含量与乙烯生成量成正比[8]。虽然CaM和CML是相近的钙离子受体蛋白家族, 但是目前并未有CML调控果实发育的相关研究报道。

前期研究中, Li等[9]借助RNA-Seq技术挖掘与黄瓜单性结实相关的基因, 发现在天然单性结实和激素诱导单性结实果实的发育过程中均大量特异表达钙调素类似蛋白基因CML25-like, 并成功克隆了该基因。在此基础上, 本研究采用转基因技术在低单性结实黄瓜CCMC中过表达CML25-like, 鉴定和分析转基因植株的表型并研究CML25-like的功能, 从而验证CML25-like能否诱导黄瓜单性结实, 为黄瓜育种研究提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

黄瓜转基因受体材料为高代自交系CCMC, 由南京农业大学葫芦科作物遗传与种质创新实验室保存, 为华北类型, 弱单性结实性, 遗传转化效率高。pMD19-CML25-like亚克隆质粒、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58和植物表达载体pLP100-35S由本实验室保存。pLP100-35S载体以pLP100植物表达载体为骨架载体改造而来。限制性内切酶Pst Ⅰ和XbaⅠ, T4 DNA连接酶, 琼脂糖凝胶回收试剂盒、反转录试剂盒和PCR试剂均购自大连宝生物工程有限公司。PCR引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.2 总RNA的提取及cDNA的合成

用总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取样品RNA, 利用10 g · L-1的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别对RNA的完整性、纯度和浓度进行检测, 再反转录得到cDNA模板, -20 ℃保存备用。

1.3 CML25-like的表达分析

选取长势旺盛、无病虫害的黄瓜CCMC, 分别取根、茎、幼叶、成熟叶及开花当天(0dpa, days post-anthesis)的雌花和雄花鲜样, 采摘开花前1 d(-1dpa)、开花当天(0dpa)、花后1 d(1dpa)、花后2 d(2dpa)、花后3 d(3dpa)和自交授粉后1、2、3 d的果实样品, 用液氮速冻, 每个样品重复3次。全部样品贮存于-80 ℃超低温冰箱, 待用。

根据CML25-like全长CDS序列设计qPCR引物CML25-like-F和CML25-like-R, 以黄瓜Actin(Csa6M484600.1)为内参(表 1), 以上述反转录的cDNA为模板。根据SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa)说明书操作, 反应体系为20 μL:cDNA模版1 μL, 上、下游引物各0.5 μL, 2×SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μL, ddH2O 8 μL。反应条件为95 ℃ 10 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40个循环。数据采用2-ΔΔCT法计算目标基因的相对表达量。

表 1 相关引物序列及用途 Table 1 Sequence and application of primers
引物Primer 引物对序列(5′→3′) Primer pairs sequence 用途Application
CML25-like-F/R CCGAGGAAGAGCTTCAGAAC/GGAATCAACGCCCTTAGTGT 荧光定量PCR Quantitative real-time PCR
Actin-F/R ACTGTGCTGTCCTCATTATTG/AGGGTGAAAGCAAGAA GAGC 内参基因Reference gene
M13-F/R CCCCGAAAAGTGCCACCTGACGT/TGAATCTTTGACTCCATGC 载体检测引物Vector detection primer
NPTⅡ-F/R CTGGGCACAACAGACAATC/TACCGTAAAGCACGAGGAA 转基因PCR鉴定PCR identification of transgenic plants
1.4 植物表达载体构建及转化

用限制性内切酶Xba Ⅰ和Pst Ⅰ分别双酶切植物表达载体pLP100-35S和含目的基因的pMD19-CML25-like, 回收pLP100-35S载体大片段和目标基因CML25-like, T4连接酶连接、转化, 获得表达载体pLP100-35S-CML25-like(图 1), 并进行PCR和测序鉴定。采用冻融法将重组质粒pLP100-35S-CML25-like转化到农杆菌C58中。

图 1 pLP100-35S-CML25-like过量表达载体构建示意图 Fig. 1 Construction of over-expression vector of pLP100-35S-CML25-like LB:T-DNA区左边界Left T-DNA border; NPT Ⅱ :选择标记基因Selection marker gene; 35S-P:35S启动子35S promoter; 35S-T:35S终止子35S terminator; GUS:报告基因Reporter gene; NOS-T:NOS终止子NOS terminator; RB:T-DNA区右边界Right T-DNA border.

以CCMC为受体材料, 利用农杆菌介导的子叶节法[10]进行黄瓜遗传转化, 获得的转化材料种植于南京农业大学江浦试验基地转基因植株专用温室中, 编号为OEL1—OELn(over-expression line 1-n)。

1.5 再生植株检测

以再生植株的基因组DNA为模板, 质粒pLP100-35S为阳性对照, CCMC为阴性对照, ddH2O为空白对照, 进行基因NPTⅡ的PCR检测, 引物见表 1。PCR程序:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 52 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃ 10 min。

1.6 T2代转基因植株中CML25-like基因的Real-time PCR分析

PCR检测条带较亮的植株自交纯化至T2代, 取T2代转基因植株和对照CCMC的新鲜叶片, 提取RNA并反转录成cDNA, 每个样品3次重复。以cDNA为模板, 根据SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)试剂盒说明书操作, 反应体系、反应条件和数据分析同1.3节。

1.7 T2和T3代转基因植株表型鉴定与数据分析

将表达量明显上升的转基因植株和对照CCMC种植于南京农业大学园艺学院江浦实验基地转基因植株专用温室观察表型。于盛花期选取相同长势的T3代转基因植株和对照CCMC开花前1 d的雌花用彩色花扎夹花, 防止雌花授粉。之后每天采用不同颜色的花扎夹花并挂牌标记, 同时记录每天的夹花数。所有单株夹花结束8~10 d后, 逐株调查单性结实坐果情况, 计算单性结实率(单性结实果实数/所夹雌花数×100%)。果实长度大于3.5 cm, 直径大于1 cm以上的瓜(正常子房平均长度为3.3 cm, 直径为0.68 cm)都记为单性结实瓜[11], 发黄萎蔫即为化瓜。夹花结束2周后, 对同一天夹花的单性结实果实进行果实横径和长度的测量。横径用游标卡尺测量, 果实长度用卷尺测量。

所得数据用Excel 2007软件进行处理, 用最小显著差异法(LSD法)进行显著性分析。每个数据样本(n)不小于5。

1.8 转基因植株坐果期间激素相关基因的表达分析

取T3代转基因植株和CCMC开花当天的果实样品, 用液氮速冻后贮存于-80 ℃冰箱中待用, 每个取样点设3个生物学重复(n=3)。总RNA提取、cDNA合成以及qPCR方法同1.2和1.3节。对各个样品的熔解曲线进行分析, 确定每个引物均为特异性扩增。采用Actin作为内参基因(表 2), 按照2-ΔΔCT法计算出基因的相对表达量。采用Excel 2007软件绘图。

表 2 激素相关基因的荧光定量PCR引物 Table 2 The primers of hormone-related genes designed for RT-qPCR
基因Gene 基因编号Gene ID 引物对序列Primer pairs sequences 基因描述Gene description
Actin Csa6M484600.1 ACTGTGCTGTCCTCATTATTG/AGGGTGAAAGCAAGAAGAGC 内参基因Reference gene
PYROX Csa2M379350.1 AGCCCTGTCGCAAATTAGAT/CAACTTGGCACATTGCTTCT 生长素相关基因Auxin-related gene
AUX1-1 Csa6M011040.1 GAAATAATGGACGCGATGTG/GGAGTGGGTGAGAAGTTGGT
AUX1-2 Csa5M201310.1 GTGAGGCTTCCGGTTGTTAT/TAACAAGAAGGGCACCAACA
TIR1-1 Csa7M393970.1 AGAGTGTTTCCATCCGAACC/TTGGGCAACCTTCAGATACA
TIR1-2 Csa3M597350.1 GTTTGGTGACATGGCACTTC/ACGTTCAGCCTAGGCATCTT
AUX/IAA-1 Csa6M497220.1 TCTTCTGCCCTCGAGAAGAT/TCCATGCAGATGATCCCTTA
AUX/IAA-2 Csa1M397130.2 GGCTCTTCTGGAAATGAGGA/CAAGCTTACGCAGATATGGC
SAUR-1 Csa3M866530.1 ACTGGTGGAGGGATCAATTC/GGCCGAATTAGCAACACTTT
SAUR-2 Csa6M137590.1 GCCGAATTACTCAACCATCC/GGACTCCTTTCTGTTCATACCC
GH3-1 Csa3M198490.1 AAGGAAGAGTGGGAGGGAAT/AGAAATCGAGGGTTGGAATG
GH3-2 Csa3M431430.1 CCAATTCCACCCTCTGTCTT/AGGACCAATGGACTTATCGG
CYP735A Csa5M166390.1 GCTGAAGGAGATGAATGGGT/ATTAAGCTTGCCATTGCCTT 细胞分裂素相关基因Cytokinin-related gene
CRE1-1 Csa4M280410.1 AGCCATGCTTTCTTCCTGAT/GTTAACGTTGCTGTGCCATC
CRE1-2 Csa6M420530.1 CGCCTTCAACGATTACTTCA/TGGCTTGAGAAATTCCCATT
AHP Csa6M067360.1 GCCATGTTCACCAGCTTAAA/GCAGACATCTTAGGCATCCA
B-ARR Csa4M614170.1 ACCCTCAATGACACAGCAAA/AGTTGGGAAATGGAGGACAG
GA-S1 Csa3M015360.1 AGGCCAAGGAAGAACAAGAA/ACTTAGGCCAAGCGTCTCAT 赤霉素相关基因Gibberellin-related gene
GA-S2 Csa6M111930.1 AAGTGGAGGAGATGTTTGGG/GATCGTCGTGAATCCTGATG
GA-S3 Csa3M043910.1 GCACCATAGCTCGAAGTGAA/TAGCCTCTTGTACCCTCCCA
BIRK1a Csa1M276450.1 CACGAGAGGCTCTTGGTGTA/AGGATCACATTGCTCATGGA 油菜素内酯相关基因Brassinolide-related gene
BIRK1b Csa3M854180.1 ATCTTGAGAGACGGCCAAGT/TGCACAACTCAACACTCGAA
BIRK1c Csa4M036610.1 ATGTGGTGAGAATGCTGGAA/CGAATCAACCATCCATTCTG

根据Li等[9]前期报道, 挑选22个比较关键的基因, 包括生长素相关基因:PYROX(pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase), AUX1-1AUX1-2(auxin transporter-like protein), TIR1-1TIR1-2 (transport inhibitor response 1), AUX/IAA-1AUX/IAA-2(auxin-responsive protein), SAUR-1SAUR-2GH3-1GH3-2(auxin-induced protein); 细胞分裂素相关基因:CYP735A(cytokinin trans-hydroxylase), CRE 1-1CRE1-2(glucan endo-1, 3-beta-glucosidase-like protein), AHP(Histidine-containing phosphotransfer protein), B-ARR(Myb family transcription factor); 赤霉素相关基因:GA-S1(kaurene oxidase)、GA-S2(DELLA)、GA-S3(gibberellin-insensitive dwarf 1);油菜素内酯相关基因:BIRK1aBIRK1bBIRK1c(brassinolide insentitive 1-associated receptor kinase 1)。通过同源比对以及在NCBI上搜索相关基因序列设计引物, 引物序列见表 2

2 结果与分析 2.1 黄瓜CML25-like表达的组织特异性

图 2可见:CML25-like在幼叶中表达量最高, 其次是雌花, 在雄花中表达量最低。由图 3可见:CML25-like在果实正常发育过程中呈上调表达趋势, 而在果实败育过程中呈下调表达趋势, 这与前期在欧洲温室型黄瓜‘8419’中的研究结果相一致[12], 说明无论在华北型还是欧洲温室型黄瓜材料中CML25-like的活跃表达均与果实发育密切相关。

图 2 CML25-like在黄瓜不同组织中的表达水平 Fig. 2 Expression level of CML25-like gene in different cucumber tissues *P < 0.05, * *P < 0.01(以根样品为对照Root samples as a control, n=3).
图 3 CML25-like在黄瓜果实发育早期的表达水平 Fig. 3 Expression level of CML25-like gene during early cucumber fruit development stages -1dpa、0dpa、1dpa、2dpa、3dpa分别表示开花前1 d、开花当天、花后1 d、花后2 d和花后3 d。
-1dpa, 0dpa, 1dpa, 2dpa and 3dpa indicate 1 day before anthesis, the day of anthesis, 1 day post anthesis, 2 days post anthesis and 3 days post anthesis, respcetively.
*P < 0.05, * *P < 0.01(以开花当天样品为对照Samples of the day of anthesis as a control, n=3).
2.2 黄瓜转基因植株的获得与分子鉴定

用过表达载体pLP100-35S-CML25-like转化农杆菌C58, 通过农杆菌介导的子叶节法转化CCMC, 并获得了多个再生植株。在卡那霉素(Kan)抗性筛选的基础上, 利用PCR方法进行分子检测。结果(图 4)显示, 有13个植株在750 bp左右出现目的条带, 其中OEL137、OEL144、OEL173、OEL177及OEL178的条带特别清晰。

图 4 再生植株NPTⅡ基因的PCR分析 Fig. 4 PCR analysis of NPTⅡ in regeneration plants M:DL1000 marker; P:阳性对照质粒pLP100-35S Positive control plasmid pLP100-35S;CK:阴性对照CCMC Negative control CCMC.数字为再生植株编号。The numbers are regenerated plant numbers.
2.3 T2代转基因植株的表达分析与表型观察

将PCR分子鉴定出的植株进行自交纯合, 收获的种子在含有Kan的MS培养基上进行抗性筛选。选取T2代植株OEL137、OEL144、OEL173、OEL177及OEL178进行表达量分析。结果(图 5)显示:与对照CCMC相比, 目的基因在这5个转基因植株中均过量表达, 且差异极显著(P < 0.01), 尤其是OEL137、OEL173和OEL178。

图 5 转基因植株CML25-like表达分析 Fig. 5 Expression level of CML25-like gene in transgenic lines * *P < 0.01(以CCMC为对照CCMC as a control).

对转基因植株进行田间观察, 发现过表达植株在幼苗期生长速度快于对照CCMC(图 6-A), 顶芽下第2片真叶面积大于对照CCMC; 生长初期转基因植株基部出现大量雄花花芽分化, 生长后期出现“花打顶”现象(图 6-B); 对开花前一天的雌花夹花发现, 转基因植株出现单性结实现象, 而对照CCMC大部分化瓜(图 6-C)。

图 6 过表达CML25-like的转基因植株表型观察 Fig. 6 Phenotype observation of transgenic plants induced by over-expressing of CML25-like A.过表达CML25-like植株与叶片发育; B.过表达CML25-like植株花芽大量分化(左)和“花打顶”(右)现象; C.过表达CML25-like植株单性结实。
A. The plant and leaves development was induced by over-expression of CML25-like gene; B. Over-expression of CML25-like gene could cause‘clusters of flowers’(left)and‘blunt with blossom’(right); C. Parthenocarpy was induced by over-expression of CML25-like gene.
TP:转基因植株Transgenic plant.
2.4 过表达CML25-like植株的单性结实情况

在对转基因植株的表型观察发现, 过表达CML25-like的植株中出现单性结实的现象。为了研究过表达CML25-like对果实发育的影响, 我们统计了T3代转基因植株OEL137、OEL144、OEL173、OEL177、OEL178和对照CCMC的单性结实率。如表 3所示:T3代转基因植株OEL137、OEL144、OEL173、OEL177、OEL178的单性结实率分别为98.25%、97.96%、89.81%、92.36%、97.14%, 而对照CCMC的单性结实率仅为12.16%, 转基因植株单性结实率最高比对照提高了86%。表明过表达CML25-like可提高黄瓜单性结实率, 促进果实形成。

表 3 转基因黄瓜和对照CCMC的单性结实情况 Table 3 The parthenocarpy status in transgenic cucumber and control CCMC
指标Index OEL137 OEL144 OEL173 OEL177 OEL178 CCMC
植株数量Number of individual 21 7 6 6 7 7
所夹雌花总数Total number of female flowers 94 38 45 39 40 35
单性结实总数Total number of parthenocarpic fruits 92 37 43 36 39 3
单性结实率/% Parthenocarpy rate 98.25±5.54 97.96±5.40 89.81±20.00 92.36±13.54 97.14±7.56 12.16±13.30

图 7可见:过表达CML25-like诱导的单性结实果实与对照CCMC正常授粉果实相比, 其果实横径与长度无明显差异, 而自然发生的CCMC单性结实果实的横径和长度极显著小于CCMC正常授粉果实。表明过表达CML25-like不仅能够诱导果实的形成, 还可促进果实的膨大。

图 7 转基因植株和CCMC的单性结实果实及正常授粉果实的果长和横径比较 Fig. 7 The comparative analysis of fruit length and transverse diameter of parthenocarpic fruits of transgenic plants and CCMC, and normally pollinated fruits of CCMC CCMC1:CCMC授粉果实Normally pollinated fruits of CCMC; CCMC2:CCMC单性结实果实Parthenocarpic fruits of CCMC.
* *P < 0.01(以CCMC授粉果实为对照Normally pollinated fruits of CCMC as a control, n>5).
2.5 过表达CML25-like植株成熟果实中植物激素相关基因的表达分析

图 8可见:与对照CCMC相比, 转基因植株OEL137的成熟果实中有16个激素相关基因上调表达, 其余6个基因表达无明显差异。其中, 生长素运输蛋白基因(AUX1-1AUX1-2)、受体蛋白基因(TIR1-1TIR1-2)、应答基因(AUX/IAA-2)、诱导基因(SAUR-2GH3-1GH3-2)、细胞分裂素的合成基因(CYP735A)和磷酸转运蛋白基因(AHPB-ARR)、赤霉素合成基因(GA-S1)和信号转导基因(GA-S3)、油菜素内酯受体蛋白基因(BIRK1aBIRK1bBIRK1c)均显著上调表达, 而应答基因(AUX/IAA-1)和DELLA蛋白基因(GA-S2)上调表达不显著, 生长素合成基因(PYROX)、诱导基因(SAUR-1)和细胞分裂素下游基因(CRE1-1CRE1-2)的表达没有明显变化。这说明生长素、细胞分裂素、赤霉素和油菜素内酯都参与了过表达CML25-like诱导的单性结实过程。

图 8 黄瓜成熟果实中激素相关基因的表达分析 Fig. 8 The expression analysis of hormone related genes in mature fruits of cucumber * *P < 0.01(以CCMC果实为对照The fruits of CCMC as a control, n=3).
3 讨论

研究表明, 钙调素类似蛋白基因在植物不同组织部位或者同一组织的不同发育时期表达活性各不相同[4]。本研究发现, 在黄瓜中CML25-like的表达也具有组织特异性, 在根、茎、老叶以及雄花中的表达量较低, 而在嫩叶及雌花中的表达量较高。幼叶和雌花都是细胞快速增殖和生长的器官, 表明CML25-like与细胞分裂和分化有关。钙调素类似蛋白是细胞Ca2+信号转导途径中的主要部分, 而Ca2+是细胞内信号传递的第二信使, 对果实的发育具有极其重要的作用。本研究通过CML25-like在黄瓜果实发育不同时期中的表达分析发现, CML25-like在正常果实发育过程中上调表达, 而在果实败育过程中下调表达。CML25-like在雌花中表达量较高, 而雌花又与果实发育相关, 表明CML25-like与黄瓜果实发育密切相关。

果实的发育包括果实形成和膨大2个阶段[13-15]。白吉刚等[16]将拟南芥生长素结合蛋白基因ABP1转入黄瓜后提高了植株的单性结实率, 得出生长素结合蛋白参与黄瓜果实生长发育的结论。本研究通过在CCMC中过表达CML25-like显著提高了植株的单性结实率, 表明CML25-like与果实形成有关。很多单性结实的黄瓜品种在坐果后由于温度、营养、根瓜抑制等原因停止继续膨大, 形成“僵瓜”状态[17]。在本研究中, 对照CCMC虽有单性结实能力, 但其单性结实的果实长度和横径远远小于正常授粉坐果的果实。与对照CCMC相比, 过表达CML25-like的转基因植株单性结实果实数量多, 单性结实率高, 果实的长度和横径可以发育到正常授粉瓜的大小, 且显著大于对照CCMC。说明黄瓜钙调素类似蛋白基因CML25-like不仅能诱导黄瓜单性结实, 也能够促进果实的膨大。

大量研究发现, 4种植物生长物质(生长素、细胞分裂素、赤霉素和油菜素内酯)在果实发育的不同阶段起不同的调节作用[18-20]。在非单性结实的品种中, 外源添加植物生长物质也能诱导单性结实[21-22]。前人研究发现, 当在子房中表达与生长素合成相关的基因时, 生长素信号通过生长素受体TIR1/AFB和Aux/IAA等蛋白家族在植物体内传递, 促进下游相关基因的表达, 进而诱导单性结实[23-25]。本研究发现在过表达CML25-like诱导的单性结实果实中, 生长素受体蛋白基因(TIR1-1TIR1-2)、应答基因(AUX/IAA-2)和诱导基因(SAUR-2GH3-1GH3-2)的表达均显著上调。在果实生长发育过程中, 赤霉素合成酶及氧化酶基因的大量表达能够诱导果实单性结实, 而DELLA蛋白的存在可以负调控GA信号转导途径从而抑制果实生长发育[26]。本研究中, 赤霉素合成基因(GA-S1)相比DELLA蛋白基因(GA-S2)上调表达极显著。我们推测过表达CML25-like的果实中生长素受体蛋白基因、应答基因、诱导基因和赤霉素合成基因的上调表达促进了果实发育, 进而诱导单性结实。Fu等[27]研究发现油菜素内酯能够通过诱导黄瓜活性细胞分裂从而促进黄瓜单性结实, 在植物体内Brassinolide insentitive 1是油菜素内酯的信号转导受体蛋白[28]。本研究中, 3个油菜素内酯信号转导受体蛋白基因(BIRK1aBIRK1bBIRK1c)的表达在转基因植株OEL137果实中也都明显上调, 推测CML25-like通过上调表达油菜素内酯信号转导受体蛋白基因诱导黄瓜活性细胞分裂进而促进单性结实。目前关于细胞分裂素相关基因功能与单性结实之间的关联尚不清楚, 只发现细胞分裂素生物合成的关键酶基因ipt(isopentenyl transferase gene)能够引起单性结实[29]。本研究发现, OEL137果实中细胞分裂素的合成基因(CYP735A)显著上调表达, 而细胞分裂素的下游基因(CRE1-1CRE1-2)没有明显变化, 因此推测细胞分裂素的合成基因参与了过表达CML25-like诱导的单性结实过程。Li等[30]提出黄瓜的单性结实可能是由1个“平行的开关”控制, 它包括激素依赖型和激素非依赖型2种通路; 在足够的激素作用下, 黄瓜子房能够通过这2种通路形成幼果并最终发育成熟; 当激素缺少时, 激素依赖型的黄瓜子房表现出果实败育, 而激素不依赖型的子房则保持“僵瓜”状态。本研究发现, 过表达CML25-like能够引起黄瓜单性结实, 且单性结实果实中生长素、细胞分裂素、赤霉素和油菜素内酯的相关基因大量显著上调表达。前期的转录组学分析发现, CML25-like是1个非激素依赖性基因, 因此我们推测CML25-like通过上调表达生长素、细胞分裂素、赤霉素和油菜素内酯相关基因, 从而使果实内激素含量满足形成单性结实的需求, 进而促进细胞的分裂及生长, 最终促进果实的形成与膨大, 诱导单性结实。

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