南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (2): 358-364   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201804049
0

文章信息

黄佳莹, 曹林
HUANG Jiaying, CAO Lin
食源性致病菌核糖体RNA高效去除体系的建立
Development of an efficient ribosomal RNA depletion system for foodborne pathogens
南京农业大学学报, 2019, 42(2): 358-364
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(2): 358-364.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201804049

文章历史

收稿日期: 2018-04-27
食源性致病菌核糖体RNA高效去除体系的建立
黄佳莹 , 曹林     
南京农业大学食品科学技术学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在解决转录组技术研究食源性致病菌致病机制过程中核糖体RNA(rRNA)无法高效去除的问题。[方法]以9种常见食源性致病菌的201条rRNA序列为参考对象,设计每条rRNA编码基因的反向互补配对DNA探针,随后将探针与细菌总RNA进行杂交,在RNase H和DNaseⅠ的作用下去除rRNA。以大肠杆菌O157:H7 Sakai、单增李斯特菌EGD-e、肠道沙门氏菌CT18以及铜绿假单胞菌PAO1这4株菌的总RNA为模板,分别使用本研究设计的rRNA去除探针以及建立的rRNA去除体系与Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Bacteria)进行rRNA去除,随后用相同方法进行转录组文库构建,并使用Illumina HiSeq X测序平台进行相同数据量的测序,最后通过生物信息分析比较rRNA去除效果。[结果]共设计rRNA去除探针541条。当总RNA使用量范围为1~5 μg,探针使用量为100 pmol,RNase H使用量为2 U,DNaseⅠ保持过量为10 U时,rRNA去除体系的性能达到最优,去除效率达95%以上。使用本研究构建的rRNA去除体系时,4株食源性致病菌残留rRNA平均占总数据量的1.67%,而相同条件下试剂盒残留的rRNA平均占7.61%。此外,本体系对食源性致病菌低表达丰度基因的检出数目是试剂盒的1.90倍。[结论]该体系可以有效去除9种常见食源性致病菌的核糖体RNA,同时也大大降低了试验成本。
关键词食源性致病菌   核糖体RNA(rRNA)   文库构建   转录组   
Development of an efficient ribosomal RNA depletion system for foodborne pathogens
HUANG Jiaying, CAO Lin    
College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] An efficient ribosomal RNA(rRNA) depletion system was developed to solve incomplete rRNA removal problems that exist in researching pathogenesis for foodborne pathogens by transcriptome technology. [Methods] 201 ribosomal RNA sequences from 9 common food-borne pathogens were used as references, and their coding genes reverse complementary sequences were used to design DNA probes that hybridized with bacterial total RNA, and ribosomal RNA was removed under the reaction of RNase H and DNaseⅠ. To check the working efficiency of our rRNA removal system, total RNA from Escherichia coli O157:H7 Sakai, Listeria monocytogenes EGD-e, Salmonella enterica CT18 and Paeruginosa PAO1 were used as templates, and the rRNA removal probes designed in this work and Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Bacteria) were used to remove rRNAs from 4 different strains respectively. Then transcriptome libraries were constructed using the same method, and Illumina HiSeq X sequencing platform was used to sequence the same size of data. Finally, rRNA removal efficiencies between different rRNA removal systems were compared through bioinformatics tools. [Results] A total of 541 rRNA removal probes were designed. RT-qPCR method was used to measure the rRNA removal efficiency, and by using this method, total RNA input range was confirmed to be 1-5 μg, the using amount of rRNA removal probes was confirmed to be 100 pmol, the enzyme concentration of RNase H and DNaseⅠused in this system was confirmed to be 2 U and 10 U, respectively. At this condition, rRNA removal efficiency reached as high as 95% above. Followed by same RNA library construction pipeline and same data-output sequencing strategy, the mean rRNA ratio remaining in 4 RNA libraries prepared by the system developed in this work was 1.67%, and the mean rRNA ratio remaining in 4 RNA libraries prepared by kit was 7.61%. Besides, the number of low expression abundance genes detected in the RNA library pretreated with the system we designed was 1.90 times more than that of the library pretreated with kit. [Conclusions] Through the rRNA removal system developed in this work, we can remove rRNAs from 9 common foodborne pathogenic bacteria efficiently, and effectively reduce experiment expensive.
Keywords: foodborne pathogens    ribosomal RNA(rRNA)    library construction    transcriptome   

目前, 食源性疾病已成为全世界范围广受关注的公共卫生问题之一[1]。食物中的食源性致病菌在正常生长过程中, 会分泌一些毒性物质到细胞外环境, 人类食用后会引起呕吐、恶心、腹泻、发烧等急性中毒症状, 严重时可能会致癌或致畸[2]。目前已经鉴定出一系列与食源性疾病密切相关的致病菌, 如弯曲杆菌(Campylobacter)[3]、大肠杆菌(Escherichia coli)[4]、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)[5]、沙门氏菌(Salmonella)以及金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[6]。然而, 就目前对各类食源性致病菌的致病机制了解, 还不足以找到能够高效治疗各菌属的特定抗菌药物或者有效防治的疫苗。

转录组(transcriptome)技术能够从宏观上反映在特定时空状态下病原菌细胞内的基因表达情况, 结合病原菌的致病表型对基因的功能以及基因的调控网络进行判断, 进而推测病原菌的致病过程以及与宿主细胞的互作机制, 定位与致病过程相关的基因及代谢、信号通路。

宦海霞等[7]通过转录组技术比较具有不同毒力作用的菌株, 以及在不同体外环境中各菌株的基因表达情况, 结果筛选得到各菌株可能的毒力因子编码基因。Dong等[8]通过研究rpoS突变株发现毒力因子RpoS在大肠杆菌O157:H7 EDL933菌株生长稳定期影响基因的表达, 相对野生型菌株超过1 000个基因出现差异表达, 鉴定出RpoS发挥调控功能的时期以及潜在的调控基因集。Casey等[9]通过转录组测序技术分析了李斯特菌6179暴露在亚致死级浓度的氯化苯铵松宁(BZT)后其转录水平的变化, 进而推测该菌对季铵化合物的胁迫机制。

细菌总RNA中包含蛋白质编码RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小RNA(sRNA)以及核糖体RNA(rRNA), rRNA占据了原核细胞内总RNA的85%[10]。构建细菌转录组文库时若不进行RNA筛选, 文库产出数据中有超过80%的数据将来自rRNA[11-12]。根据不同菌属rRNA的序列, 设计与之互补配对的探针, 再通过探针与rRNA杂交捕获的方法去除rRNA, 是目前商业化原核生物RNA建库试剂应用最多的方法[13]。商业试剂盒多数设计了包含大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、弧菌等食源性致病菌的核糖体去除探针, 但是几乎所有菌属的5S rRNA序列均未包含在内[13]。此外, 由于这些兼并探针集包含近百种不同原核细菌的rRNA去除探针, 导致单一物种rRNA去除探针密度较低。与此同时, 该类商业化试剂盒因设计了大量兼并不同菌属的探针, 成本极高, 对于专一研究食源性致病菌各菌属致病机制并不是最理想的选择。

因此, 本研究以9种常见食源性致病菌为研究对象, 从RefSeq数据库中下载各菌株rRNA编码序列, 进行rRNA去除探针设计, 并摸索rRNA去除体系中各组分最佳使用量, 最后选择其中4株致病菌为研究对象, 通过转录组测序数据检测各菌株rRNA残留率, 并比较本研究建立的rRNA去除体系与商业化试剂盒的rRNA去除效果, 以期能够设计一款针对常见食源性致病菌的专用转录组建库试剂盒, 满足高效去除rRNA的同时, 能有效降低试验成本, 旨在为研究者使用转录组学测序技术进行各菌株致病机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料与主要试剂

试验包括3个步骤:1)设计rRNA去除探针; 2)摸索rRNA去除反应体系; 3)使用转录组测序技术分析比较商业化试剂盒和本rRNA去除体系的效率。各步骤使用的菌株名称以及用途见表 1。所有菌株在试验前均经细胞培养、形态观察、血清型鉴定、PCR鉴定以及致病性试验验证。

表 1 本研究所使用的菌株及用途 Table 1 Strains and their functions in this work
菌株Strain 用途Functions rRNA数目Number of rRNA
大肠杆菌O157:H7 SakaiEscherichia coli O157:H7 Sakai 探针设计、体系摸索、生物信息分析Probe design, reaction system determination, bioinformatics analysis 22
单增李斯特菌EGD-eListeria monocytogenes EGD-e 探针设计、生物信息分析Probe design, bioinformatics analysis 18
肠道沙门氏菌CT18Salmonella enterica CT18 探针设计、生物信息分析Probe design, bioinformatics analysis 22
铜绿假单胞菌PAO1Pseudomonas aeruginosa PAO1 探针设计、生物信息分析Probe design, bioinformatics analysis 12
炭疽杆菌Ames Bacillus anthracis Ames 探针设计Probe design 33
副溶血弧菌RIMD 2210633 Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 探针设计Probe design 34
志贺杆菌Sd197 Shigella dysenteriae Sd197 探针设计Probe design 22
金黄色葡萄球菌NCTC 8325 Staphylococcus aureus NCTC 8325 探针设计Probe design 16
小肠结肠炎耶尔森菌8081 Yersinia enteroeolitie subsp. enterocolitica 8081 探针设计Probe design 22
1.2 试验方法 1.2.1 菌株总RNA获取

将活化后的大肠杆菌O157:H7 Sakai菌株接种在肉汤培养基中, 将单增李斯特菌接种在TSB-TE培养基中, 将肠道沙门氏菌接种在SC增菌培养基中, 将铜绿假单胞菌接种在LB培养基中, 均置于37 ℃, 220 r · min-1过夜培养。各吸取1 mL菌液于1.5 mL离心管中, 12 000 r · min-1离心1 min, 弃上层培养液, 于液氮中保存。总RNA提取步骤参考SV Total RNA Isolation System提取试剂盒(Promega公司)说明书。随后使用Qubit RNA XR Assay Kit(Invitrogen公司)对提取的总RNA浓度进行测定。

1.2.2 去rRNA探针设计

从NCBI数据库中下载每个菌株的全部rRNA编码序列(包含5S rRNA、16S rRNA与23S rRNA编码基因, 此处编码基因的序列为rRNA实际使用模板链的DNA序列信息), 共计201条rRNA序列。通过BLAST对这些序列进行比对, 将相似性大于等于0.8且E值小于e-5的序列进行去冗余, 仅仅保留长度最长的1条序列, 若序列长度一致, 则同时保留, 调取放入集合1中; 其余序列调取放入集合2中。使用Perl脚本将集合1和2中的序列分别切成50 bp小片段, 每个小片段的反向互补序列即为最终可以进行rRNA去除的DNA探针序列。其中, 集合1中设计的探针可以兼并去除几种不同菌株的rRNA, 而集合2中设计的探针为物种特异性探针, 只能去除特定菌株的rRNA。本试验共设计541条DNA探针。探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成, 采用高效液相色谱纯化。

1.2.3 rRNA去除流程

1) 以大肠杆菌O157:H7 Sakai为代表菌株, 将适量总RNA、rRNA去除探针以及反应Buffer[200 mmol · L-1 NaCl, 100 mmol · L-1 Tris-HCl(pH7.4)], 使用移液器轻轻吹打至混合均匀, 按照95 ℃ 2 min, 95~22 ℃(每秒降低0.1 ℃), 22 ℃ 5 min的程序, 将混合好的样本放入PCR仪中进行探针杂交; 2)将杂交产物与适量5×RNase H Buffer、RNase H混合均匀, 37 ℃孵育30 min; 3)将反应产物和适量10×DNaseⅠBuffer、DNaseⅠ混合均匀, 再次放入PCR仪中37 ℃孵育30 min; 4)使用Beckman RNA纯化磁珠对去除了rRNA的样本进行纯化; 5)加入10.5 μL Nuclease-free ddH2O洗脱磁珠上的RNA, 室温静置2 min, 使用磁力架将洗脱下的RNA与磁珠分离, 吸取上清液, 获得除rRNA外的全部RNA。

1.2.4 RT-qPCR

将大肠杆菌O157:H7 Sakai总RNA按照1.2.3节中介绍的步骤进行rRNA去除(处理组), 以不加探针而用等量的Nuclease-free ddH2O替代的作为对照组。选择3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapA[14](ID:913285)和23S大亚基编码基因rrlB(ID:914971)作为引物进行RT-qPCR。引物序列分别为:gapA-F:GTTCCTGACTGACGAAACTGCT, gapA-R:AACGGTGGTCATCAGACCTTC; rrlB-F:GTTAAGTTGCAGGGTATAGAC, rrlB-R:TTGCCGAAACAGTGCTCTACC。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成, 采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

1.2.5 rRNA去除效率计算

以对照组RNA为模板, 使用rrlB进行RT-qPCR, 得到的CT值为a; 以处理组RNA为模板, 得到的CT值为b。rRNA去除效率(%)=1-2a/2b

1.2.6 RNA文库构建

总RNA起始量定为2.5 μg, 分别依据本文中rRNA去除步骤和Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Bacteria)(Illumina公司)产品说明书进行rRNA去除。按照VAHTS Total RNA-seq(H/M/R)Library Prep Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)中的步骤, 将2种不同rRNA去除体系的产物分别进行RNA文库构建。

1.2.7 上机测序与数据分析

使用这2种方法对每种菌株进行rRNA去除, 并对所得文库分别进行质检。根据文库浓度以及所需数据量(20 M reads), 对文库混样后进行测序, 测序仪使用Illumina HiSeq X, 测序策略为双端150 bp。取得下机数据后, 采用HISAT2软件与NCBI Genome数据库中4种不同食源性致病菌株的基因组参考序列进行比对分析, 比较本研究设计的rRNA去除试剂盒与商业试剂盒的rRNA去除效率。基因表达量使用每百万个比对上的读长中比对到某基因外显子每千个碱基上的读长个数(RPKM, reads per kilobase of exon model per million mapped reads)进行表示。上机测序与生物信息学分析由深圳华大基因有限公司完成。

2 结果与分析 2.1 食源性致病菌rRNA去除体系中探针使用量的确定

以食源性致病菌大肠杆菌O157:H7 Sakai为代表, 确定rRNA去除体系中探针、总RNA和RNase H的最适使用量。

将大肠杆菌O157:H7 Sakai菌株总RNA使用量设为5和1 μg, 加入过量DNaseⅠ(10 U)和RNase H(10 U), 探针使用量分别设为12.5、25、50、75和100 pmol, 研究rRNA去除探针的最适使用量。由表 2可见:gapA的不同探针使用量与对照的CT值相比, 没有明显变化, 表明rRNA去除探针不影响总RNA中的mRNA含量, 而rrlBCT值随探针使用量的增加而增大。随着探针使用量的增加, rRNA去除效率也不断提高。当rRNA去除探针为100 pmol时, 体系中rRNA去除效率最高, 5 μg总RNA去除效率为97.17%, 1 μg总RNA去除效率为99.92%。考虑到节约成本, 探针使用量不再增加, 确定为100 pmol。

表 2 食源性致病菌rRNA去除体系中探针的使用量及去除效率 Table 2 Probe usage amount and rRNA removal efficiency in foodborne pathogens rRNA removal system
总RNA使用量/μgTotal RNA usage amount 探针使用量/pmolProbe usage amount CTCT value rRNA去除效率/%rRNA removal efficiency
gapA rrlB
5 0(CK) 13.00±0.08 10.39±0.02
12.5 13.47±0.08 10.54±0.11 9.66
25 13.91±0.15 11.76±0.13 61.18
50 13.67±0.06 12.62±0.06 78.67
75 14.98±0.01 14.44±0.01 93.93
100 14.98±0.10 15.53±0.01 97.17
1 0(CK) 14.53±0.01 11.40±0.05
12.5 15.99±0.04 11.95±0.04 31.83
25 15.72±0.03 12.42±0.05 50.78
50 15.89±0.01 17.13±0.01 98.12
75 16.09±0.05 20.46±0.09 99.81
100 16.25±0.07 21.76±0.19 99.92
  注:CT:进行qPCR时每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。下同。
  Note: CT:Number of cycles required in each reaction tube when the fluorescence signal reach to the set threshold during qPCR. The same as follows.
2.2 食源性致病菌rRNA去除体系中总RNA使用量的确定

将rRNA去除体系中探针的使用量设为100 pmol, DNaseⅠ(10 U)和RNase H(10 U)使用量仍保持过量, 确定体系中总RNA使用量范围。由表 3可见:当总RNA使用量在1~5 μg时, gapArrlB处理组的CT值随着总RNA使用量的增加呈先下降后升高的趋势。rRNA的去除效率保持在95%以上, 当使用量增加到6 μg时, rRNA去除效率显著降低。根据不同菌株总RNA提取的难易程度, 可以将总RNA使用量在1~5 μg进行调整。

表 3 食源性致病菌rRNA去除体系中总RNA的使用量和去除效率 Table 3 Total RNA usage amount and rRNA removal efficiency in foodborne pathogens rRNA removal system
总RNA使用量/μgTotal RNA usage amount gapACTCT value of gapA rrlBCTCT value of rrlB rRNA去除效率/%rRNA removal efficiency
处理Treatment 对照Control 处理Treatment 对照Control
1 20.21±0.15 19.94±0.08 21.43±0.19 11.34±0.10 99.91
2 19.95±0.13 18.69±0.13 20.75±0.15 10.80±0.05 99.90
3 19.80±0.11 20.33±0.04 19.11±0.13 9.32±0.11 99.97
4 19.26±0.13 19.37±0.07 16.62±0.06 9.11±0.07 99.44
5 18.08±0.01 19.50±0.05 14.67±0.07 9.19±0.08 97.72
6 18.57±0.15 18.35±0.03 18.35±0.01 11.07±0.05 58.46
2.3 食源性致病菌rRNA去除体系中RNase H使用量的确定

食源性致病菌rRNA去除体系中总RNA使用量设为5 μg, 探针使用量为100 pmol, RNase H使用量设为0.2、0.5、1、2和3 U, 确定最适RNase H的使用量。由表 4可见:当RNase H使用量为0.2~2 U时, gapArrlB处理组的CT值基本上呈上升趋势。随RNase H使用量的增加, rRNA去除效率随之增加。当RNase H使用量为2 U时, rRNA去除效率为95.86%, 而RNase H增加到3 U时, 去除效率为95.90%, 相对2 U并没有显著提高去除效率。因此, 确定rRNA去除体系中RNase H的最适使用量为2 U。

表 4 食源性致病菌rRNA去除体系中RNase H的使用量和去除效率 Table 4 RNase H usage amount and rRNA removal efficiency in foodborne pathogens rRNA removal system
RNase H使用量/URNase H usage amount gapACTCT value of gapA rrlBCTCT value of rrlB rRNA去除效率/%rRNA removal efficiency
处理Treatment 对照Control 处理Treatment 对照Control
0.2 15.81±0.11 18.57±0.02 10.87±0.04 10.60±0.04 16.86
0.5 15.02±0.06 14.07±0.07 12.73±0.10 11.92±0.03 42.96
1 16.65±0.17 15.52±0.10 13.32±0.10 10.23±0.44 88.01
2 17.06±0.08 17.74±0.01 14.17±0.15 9.58±0.08 95.86
3 16.69±0.13 19.39±0.06 14.55±0.05 9.94±0.04 95.90

综上所述, 确定食源性致病菌rRNA去除体系中探针使用量为100 pmol, 总RNA投入量为1~5 μg, RNase H使用量为2 U, DNaseⅠ使用量为10 U, 此时rRNA去除效率较高, 达到95.86%。

2.4 食源性致病菌rRNA去除体系与商业化试剂盒去除效率的比较

选择4株食源性致病菌:大肠杆菌O157:H7 Sakai、单增李斯特菌EGD-e、肠道沙门氏菌CT18和铜绿假单胞菌PAO1, 分别使用本研究建立的体系(T组)和商业化试剂盒(C组)进行rRNA去除, 比较2种方法的去除效率。由表 5可见:4种不同菌株T组平均数据产出为20.63百万读长, C组平均数据产出为18.49百万读长, T组数据产出略高于C组, 但均满足原核生物基因表达分析的数据量要求。通过比较总比对率、双端以及单端比对率, 可以看出T组获得的数据相对于C组的数据与4种菌株参考基因组的比对情况更优。根据4种菌株比对得到的rRNA上的读长数占总读长数的比例即rRNA占比, T组的rRNA占比均比C组低, T组平均残留rRNA占比为1.67%, C组平均残留rRNA占比为7.61%。相比商业化试剂盒, 本研究设计的食源性致病菌专用rRNA去除体系能够更高效地去除食源性致病菌的rRNA。

表 5 4种食源性致病菌基因比对情况以及核糖体残留率 Table 5 Summary of gene mapped ratio and rRNA residual ratio for 4 foodborne pathogens
指标Index 大肠杆菌O157:H7 SakaiE.coli O157:H7 Sakai 单增李斯特菌EGD-eL.monocytogenes EGD-e 肠道沙门氏菌CT18S.enterica CT18 铜绿假单胞菌PAO1P.aeruginosa PAO1
T C T C T C T C
数据量/百万读长Data size/million reads 20.74 18.16 15.22 14.44 21.95 18.97 24.58 22.38
总比对率/%Total mapped ratio 93.81 93.64 50.20 29.56 97.45 64.87 98.20 66.50
双端比对率/%PE mapped ratio 87.75 91.13 46.87 25.77 92.94 63.75 94.52 64.44
单端比对率/%SE mapped ratio 6.06 2.51 3.33 3.79 4.51 1.12 3.68 2.06
rRNA占比/%rRNA ratio 0.06 2.98 5.24 13.65 1.18 6.83 0.20 6.96
  注:T:本研究建立的rRNA去除体系; C:商业化rRNA去除试剂盒。下同。
  Note:T:rRNA removal system developed in this study; C:Commercial rRNA removal kit. The same as follows.

表 6可见:使用2种不同方法对4种菌株去除rRNA后检测到的表达基因总数无明显差异。表达量小于5的低丰度基因, T组共检出2 683个, 而C组仅检出1 206个, 本研究建立的rRNA去除体系对于低丰度基因的检出数量是商业化试剂盒的1.90倍。综上所述, 本研究建立的rRNA去除体系相对于商业化试剂盒有更高的rRNA去除效率, 同时对低丰度基因检测灵敏度也更高。

表 6 4种食源性致病菌基因表达分布统计 Table 6 Summary of gene expression distributions in 4 foodborne pathogens
RPKM 大肠杆菌O157:H7 SakaiE.coli O157:H7 Sakai 单增李斯特菌EGD-eL.monocytogenes EGD-e 肠道沙门氏菌CT18S.enterica CT18 铜绿假单胞菌PAO1P.aeruginosa PAO1
T C T C T C T C
0~0.1 44 34 37 29 5 4 4 0
>0.1~0.5 172 91 105 58 63 46 54 21
>0.5~1 151 57 54 46 32 27 61 31
>1~5 578 394 116 131 167 226 648 11
>5~10 889 862 161 200 392 496 1 204 23
>10~50 1 076 1 245 79 140 1 029 1 119 1 870 2 691
>50~100 566 663 29 47 508 472 900 1 425
>100 1 056 1 185 141 172 1 191 1 050 1 600 1 506
总和Sum 3 954 4 137 606 692 3 220 3 214 5 693 5 697
  注: RPKM:每百万个比对上的读长中比对到某基因外显子每千碱基上的读长个数Reads per kilobase of exon model per million mapped reads.
3 讨论

本研究建立了一个高效去除食源性致病菌核糖体RNA的体系, 可以直接用于包括大肠杆菌O157:H7 Sakai、单增李斯特菌EGD-e、肠道沙门氏菌CT18和铜绿假单胞菌PAO1等9种不同食源性致病菌的转录组建库过程。

目前已有多种去除原核生物核糖体RNA的方法, 主要包括多聚腺苷酸化[15]、电泳片段大小分选[16]、核酸酶处理以及杂交捕获法[17-18]等。杂交捕获法是目前商业化试剂盒去除rRNA使用最多的方法, 如Ambion公司的MICROBExpressTM Bacterial mRNA Enrichment Kit、Illumina公司的Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Bacteria)[13]。该方法设计能够与上百种不同种属细菌16S和23S互补配对的寡核苷酸探针, 并在探针上加上生物素修饰, 利用包被链霉亲和素的磁珠抓取生物素修饰的探针, 同时捕获细菌中的rRNA, 达到与其他RNA分子分离的作用。然而, 该方法去除rRNA的效率在不同细菌种属中存在较大差异, 部分菌属使用杂交捕获法去除rRNA后文库测序总数据量中残留rRNA占比超过50%[19-21]。这一问题可通过多轮杂交捕获、联合不同去除手段以及设计定制化捕获探针[20-21]来解决。本研究设计的rRNA去除方法结合了探针杂交法与核酸酶处理法, 并采用9种常用食源性致病菌的定制化探针进行rRNA去除处理。已有研究比较了使用最广泛的3款商业化试剂盒:Ambion MICROBExpressTM Bacterial mRNA Enrichment Kit、Life RiboMinus Transcriptome Isolation Kit和Illumina Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Bacteria)在铜绿假单胞菌PAO1和金黄色葡萄球菌ATCC6538总RNA中去除rRNA的效果, 结果表明Illumina Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Bacteria)效果最佳[13]。而本研究建立的rRNA去除体系的平均rRNA残留率是Ribo-Zero rRNA Removal Kit的21.96%, 特别是大肠杆菌O157:H7 Sakai和铜绿假单胞菌PAO1, 其残留rRNA占总数据量比例均小于1%, rRNA去除效果比商业化试剂盒明显提高。

此外, 本研究建立的rRNA去除体系获得的文库可以检测出更多低表达丰度的基因, RPKM在0~5的基因检出数量为商业化试剂盒的1.90倍, 表明使用本研究建立的体系可以有效保留更多商业化试剂盒检测不到的低丰度基因, 保证了对食源性致病菌低表达量基因的检测灵敏度。由于本研究设计的探针仅仅针对食源性致病菌, 不包含其他非食源性致病菌的rRNA信息, 所以相对商业化试剂盒合成探针的数量大大降低。Ribo-Zero rRNA Removal Kit单次反应需人民币992元, 而本研究建立的试剂盒单次反应仅需人民币20元, 大大降低细菌rRNA去除这一步的成本, 对于需要使用转录组测序技术进行食源性致病菌致病机制以及抗菌药类研究的科研工作者而言, 这是性价比更高的选择。

参考文献(References)
[1]
Henao O L, Jones T F, Vugia D J, et al. Foodborne diseases active surveillance network:2 decades of achievements, 1996-2015[J]. Emerging Infectious Diseases, 2015, 21(9): 1529-1536. DOI:10.3201/eid2109.150581
[2]
Martinović T, Andjelković U, Gajdošik M Š, et al. Foodborne pathogens and their toxins[J]. Journal of Proteomics, 2016, 147: 226-235. DOI:10.1016/j.jprot.2016.04.029
[3]
Hurd S, Patrick M, Hatch J, et al. Clinical laboratory practices for the isolation and identification of Campylobacter in Foodborne Diseases Active Surveillance Network(FoodNet)sites:baseline information for understanding changes in surveillance data[J]. Clinical Infectious Diseases, 2012, 54(Suppl 5): 5440-5445.
[4]
Neil K P, Biggerstaff G, Macdonald J K, et al. A novel vehicle for transmission of Escherichia coli O157:H7 to humans:multistate outbreak of E.coli O157:H7 infections associated with consumption of ready-to-bake commercial prepackaged cookie dough:United States, 2009[J]. Clinical Infectious Diseases, 2012, 54(4): 511-518. DOI:10.1093/cid/cir831
[5]
Swaminathan B, Gernersmidt P. The epidemiology of human listeriosis[J]. Microbes & Infection, 2007, 9(10): 1236-1243.
[6]
Klevens R M, Morrison M A, Nadle J, et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States[J]. Journal of the American Medical Association, 2007, 298(15): 1763-1771. DOI:10.1001/jama.298.15.1763
[7]
宦海霞, 周琼, 赵李祥, 等. 应用DNA芯片技术研究体外表达禽致病性大肠杆菌可能致病基因[J]. 微生物学报, 2008, 48(1): 103-111.
Huan H X, Zhou Q, Zhao L X, et al. Differential expression of virulence and potential virulence genes of avian pathogenic Escherichia coli in vitro with DNA microarray analysis[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2008, 48(1): 103-111 (in Chinese with English abstract). DOI:10.3321/j.issn:0001-6209.2008.01.019
[8]
Dong T, Schellhorn H E. Global effect of RpoS on gene expression in pathogenic Escherichia coli O157:H7 strain EDL933[J]. BMC Genomics, 2009, 10(1): 349. DOI:10.1186/1471-2164-10-349
[9]
Casey A, Fox E M, Schmitzesser S, et al. Transcriptome analysis of Listeria monocytogenes exposed to biocide stress reveals a multi-system response involving cell wall synthesis, sugar uptake, and motility[J]. Front Microbiol, 2014, 5(1): 68.
[10]
Karpinets T V. RNA:protein ratio of the unicellular organism as a characteristic of phosphorous and nitrogen stoichiometry and of the cellular requirement of ribosomes for protein synthesis[J]. BMC Biology, 2006, 4(1): 1-10. DOI:10.1186/1741-7007-4-1
[11]
Urich T, Anders Lanzén, Qi J, et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome[J]. PLoS One, 2008, 3(6): e2527. DOI:10.1371/journal.pone.0002527
[12]
Vliet A H M V. Next generation sequencing of microbial transcriptomes:challenges and opportunities[J]. Fems Microbiology Letters, 2010, 302(1): 1-7. DOI:10.1111/fml.2010.302.issue-1
[13]
Petrova O E, Garciaalcalde F, Zampaloni C, et al. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes[J]. Sci Rep, 2017, 7: 41114. DOI:10.1038/srep41114
[14]
朱丛睿, 周明旭, 朱国强. 大肠埃希菌内参基因gapA克隆表达及抗体的制备与应用[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2015, 36(2): 14-18.
Zhu C R, Zhou M X, Zhu G Q. Prokaryotic expression of Escherichia coli reference gene gapA, and antiserum preparation and application[J]. Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition), 2015, 36(2): 14-18 (in Chinese with English abstract).
[15]
Amara R R, Vijaya S. Specific polyadenylation and purification of total messenger RNA from Escherichia coli[J]. Nucleic Acids Research, 1997, 25(17): 3465-3470. DOI:10.1093/nar/25.17.3465
[16]
Mcgrath K C, Thomas-Hall S R, Cheng C T, et al. Isolation and analysis of mRNA from environmental microbial communities[J]. J Microbiol Methods, 2008, 75(2): 172-176. DOI:10.1016/j.mimet.2008.05.019
[17]
Su C, Sordillo L M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA[J]. Molecular Biotechnology, 1998, 10(1): 83-85. DOI:10.1007/BF02745865
[18]
Pang X, Zhou D, Song Y, et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method[J]. Microbiology and Immunology, 2004, 48(2): 91-96. DOI:10.1111/mim.2004.48.issue-2
[19]
He S, Wurtzel O, Singh K, et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial meta transcriptomics[J]. Nature Methods, 2011, 7(10): 807-812.
[20]
Sorek R, Cossart P. Prokaryotic transcriptomics:a new view on regulation, physiology and pathogenicity[J]. Nature Reviews Genetics, 2010, 11(11): 9-16.
[21]
Giannoukos G, Ciulla D M, Huang K, et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes[J]. Genome Biology, 2012, 13(3): r23. DOI:10.1186/gb-2012-13-3-r23