南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (2): 345-351 |
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动物繁殖性能的高低在很大程度上决定着畜牧产业的经济效益, 因此提高动物的繁殖性能是畜牧生产的主要目标之一。睾丸是雄性动物的重要生殖器官, 其发育情况影响着动物的性成熟时间和精液品质, 进而影响动物的繁殖性能。睾丸的生长发育和功能完善受到体内和体外多种因素的影响(如动物的遗传特性、饲养管理、营养水平和内分泌代谢等), 但这些因素的变化均会通过作用于机体的关键基因而发挥生物学作用[1]。已有研究报道称kisspeptin[2]、雄激素受体[3]、Wnt/β-catenin[4]和转化生长因子β[5]等均参与调节雄性动物的睾丸发育和性成熟过程, 但睾丸发育和性成熟的具体分子调节机制仍不清楚。此外, 湖羊作为我国太湖地区的重要家畜之一, 是我国一级地方保护畜禽品种, 因其具有早熟、四季发情和繁殖力高等优良性状, 被广泛引入到全国各地, 但目前关于湖羊睾丸发育和性成熟调节的研究还非常有限。因此, 筛选和研究调控其睾丸发育过程的关键基因和调控通路, 可为提高湖羊繁殖性能提供理论依据。
线粒体作为机体的“能量工厂”, 在细胞成熟和器官发育过程中发挥着重要的作用。研究表明线粒体的氧化磷酸化能力与精子的活力密切相关, 并且线粒体的呼吸作用越强, 精子的活力越高[6]。线粒体作为信号传导媒介, 可为睾丸内性激素的合成提供能量, 同时也参与精子的发生过程。线粒体功能异常可能会导致睾丸组织能量代谢异常、生殖细胞排列紊乱以及精母细胞和精子细胞数目减少。因此, 线粒体功能活性与睾丸生长发育和精子形成等过程密切相关。研究显示, 线粒体功能主要受核基因组(90%)和线粒体基因组(10%)的共同调控。核基因组中调控线粒体的最主要基因为核转录因子。核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, PPARGC1A)是PGC-1家族中重要的一员, 在调节线粒体的生成和功能方面有重要作用[7]。研究表明, PPARGC1A既可直接调节线粒体受体基因的表达, 又可通过调节核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1, NRF1)和线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)参与线粒体呼吸的调控。尽管报道称线粒体可为睾丸发育提供能量, 并且与多个通路互作参与调节睾丸生殖细胞的功能, 但关于PPARGC1A/NRF1/TFAM通路参与调控睾丸发育的研究还鲜有报道。此外, 岳根华等[8]观察来自3只不同年龄雄性湖羊睾丸的75个生精小管, 发现精子细胞和精子在80 d时首先在曲细精管中出现。雄性湖羊4月龄时就能够使成年母羊怀孕, 但由于身体未完全成熟发育, 雄性羔羊不应该在6~8月龄前用于繁殖。因此, 本试验选取3月龄和9月龄雄性湖羊分别代表性成熟前、后, 探究线粒体相关基因PPARGC1A、NRF1和TFAM在湖羊睾丸发育过程中的差异表达, 为研究家畜性成熟和睾丸发育的调控机制, 提高动物的繁殖性能提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验样品采集与处理在江苏省姜堰市海伦羊业有限公司选取体质量相近、体况良好和谱系清楚的3月龄和9月龄雄性湖羊各9只, 颈静脉采血后进行阉割处理。采取的血样于-20 ℃保存, 用于睾酮(T)、瘦素、胰岛素及IGF-Ⅰ的检测。阉割采取的睾丸组织用生理盐水冲洗3次后, 一部分保存于布氏固定液中, 用于后续的免疫组化法检测; 另一部分冻存于液氮中, 用于后续的RNA和蛋白提取, 并进行RT-qPCR和Western blot检测。
1.2 睾酮、瘦素、胰岛素和IGF-Ⅰ的检测严格按照商业化(Kmaels公司)测定试剂盒[绵羊睾酮(T)ELISA试剂盒, CSB-E13171Sh; 绵羊瘦素ELISA试剂盒, CSB-EL012870Sh; 绵羊胰岛素ELISA试剂盒, 80-INSOV-E01;绵羊胰岛素样生长因子ⅠELISA试剂盒, CSB-E13753Sh]说明书检测血液样品中T、瘦素、胰岛素及IGF-Ⅰ的浓度。T、瘦素、胰岛素及IGF-Ⅰ检测试剂盒的敏感性分别为0.05、0.78、0.14、3.9 ng · mL-1, 检测试剂盒的组内和组间变异系数均小于15%。
1.3 组织总RNA的提取和RT-qPCR检测用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取睾丸组织总RNA, 经过RNA均一性和完整性检测合格后, 用反转录(RT)试剂盒(TaKaRa)反转录成cDNA。根据NCBI提供的序列信息, 通过Primer-BLAST设计PPARGC1A、NRF1、TFAM和GAPDH 基因的引物对(表 1)。以反转录合成的cDNA为模板, 进行qPCR检测。加样体系:SYBR Green Master 10 μL, 上、下游引物各0.8 μL, cDNA 1 μL, 补加超纯水至20 μL。反应条件:95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40个循环; 72 ℃ 10 min。用2-ΔΔCT法对有效数据进行统计分析。
| 基因名称Target gene | 引物对序列(5′→3′)Primer pairs sequences | GenBank IDAccession number of GenBank | 产物大小/bpProduct size |
| PPARGC1A | F:CACCCACAACTCCTCCTCAT/R:CCTTCCTTTCCTCGTGTC | AY321517.1 | 232 |
| NRF1 | F:AGGCTGGGGCAAAGAAAG/R:CCAACCTGGATAAGCGAGAC | AY368269.1 | 303 |
| TFAM | F:CGCTCCCCCTTTAGTTTTGC/R:CTGCCAGTCTGCCCTGTAAG | XM_015104510.1 | 237 |
| GAPDH | F:GTCAAGGCAGAGAACGGGAA/R:GGTTCACGCCCATCACAAAC | XM_012166462.1 | 232 |
| 注: PPARGC1A :过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α基因Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha gene; NRF1 :核呼吸因子1基因Nuclear respiratory factor 1 gene; TFAM:线粒体转录因子A基因Mitochondrial transcription factor A gene; GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene. | |||
睾丸组织在布氏固定液中固定48 h后进行石蜡包埋和组织切片(7 μm)。石蜡切片脱蜡处理后, 用中高火抗原修复10 min, 自然冷却至室温, 消除内源性过氧化物酶。5% BSA室温封闭1 h后, 加一抗(PPARGC1A多克隆抗体, 1 : 200稀释; NRF1兔多克隆抗体, 1 : 200稀释; mtTFA抗体, 1 : 100稀释)4 ℃过夜孵育, DPBS洗涤3次, 加二抗(HRP标记羊抗兔IgG, 1 : 1 000稀释)室温孵育2 h。DAB染色后用苏木素复染30 s左右, 脱水透明处理后中性树脂封片镜检。用一抗来源动物(兔)的血清替换一抗作为阴性对照试验。
1.5 Western blot检测提取睾丸组织总蛋白, 使用BCA蛋白检测试剂盒(碧云天)检测各组织样蛋白浓度后进行蛋白变性。取30 μg(20 μL)的蛋白样品经SDS-PAGE电泳(80 V)2.5 h, 然后转膜(60 V)1.5 h, 随后用5% BSA室温封闭1 h。加一抗(PPARGC1A抗体, 1 : 200稀释; NRF1兔多克隆抗体, 1 : 200稀释; mtTFA抗体, 1 : 100稀释; GAPDH抗体, 1 : 2 000稀释)4 ℃孵育过夜后, 加二抗(HRP标记羊抗兔IgG, 1 : 1 000稀释)室温孵育2 h。用ECL发光液(Advansta)显影并拍照, 拍照后用Image J软件分析条带灰度值。
1.6 数据的处理与统计分析各个试验均至少重复3次, 试验数据用SPSS 18.0软件(SPSS Inc. USA)进行方差分析, 试验结果均以平均值±标准误(x±SE)表示, 通过t测验进行差异显著性比较。
2 结果与分析 2.1 湖羊血液中T、瘦素、胰岛素及IGF-Ⅰ浓度变化湖羊血液中T、瘦素、胰岛素及IGF-Ⅰ的浓度变化如图 1所示:随着湖羊的发育, 9月龄湖羊血液中T、瘦素、胰岛素及IGF-Ⅰ的浓度均显著高于3月龄湖羊(P < 0.05)。
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图 1 3月龄和9月龄湖羊血液中睾酮(T)、瘦素、胰岛素及IGF-Ⅰ的浓度变化 Fig. 1 Testosterone(T), leptin, insulin and IGF-Ⅰ concentrations in the peripheral blood between 3-month-old and 9-month-old Hu sheep 同一指标中, 不同字母代表组间差异显著(P < 0.05)。下同。 In the same indicator, values with different superscript are significantly different(P < 0.05).The same as follows. |
如图 2所示:在3月龄湖羊睾丸组织中, PPARGC1A、NRF1和TFAM蛋白在睾丸性原细胞、前精原细胞和间质细胞中均有表达。在9月龄湖羊睾丸组织中, PPARGC1A蛋白主要定位于精子细胞、支持细胞和间质细胞, 并在睾丸组织的血管中呈强表达, 在精原干细胞和精母细胞中有微弱表达; NRF1蛋白在精子细胞、支持细胞、间质细胞、精母细胞和肌样细胞中均有表达, 其中在精子细胞中表达最为强烈; TFAM蛋白的表达定位与PPARGC1A蛋白相似, 但TFAM蛋白在睾丸组织的血管中不表达。在阴性对照中, 无目的蛋白着色。
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图 2 PPARGC1A/NRF1/TFAM通路相关蛋白在3月龄和9月龄湖羊睾丸组织中的表达定位 Fig. 2 Localization of PPARGC1A/NRF1/TFAM pathway key proteins in testis of 3-month-old and 9-month-old Hu sheep a—f分别为PPARGC1A、NRF1和TFAM蛋白在性成熟前后湖羊睾丸组织中的细胞定位; a1—f1为相应部位的放大图; g、g1、h、h1为阴性对照。GC:性原细胞; PC:前精原细胞; MC:肌样细胞; ST:精子细胞; SP:精母细胞; SSC:精原干细胞; LC:间质细胞; SC:支持细胞。 a-f are the cellular localization of PPARGC1A, NRF1 and TFAM proteins in the testis tissue of prepubertal and postpubertal Hu sheep; a1-f1 are magnified views of corresponding parts; g, g1, h, h1 are negative control. GC:Gonocytes cells; PC:Prospermatogonia cells; MC:Myoid cells; ST:Spermatozoa; SP:Spermatocytes; SSC:Spermatogonia stem cells; LC:Leydig cells; SC:Sertoli cells. |
由图 3可知:9月龄湖羊睾丸组织中PPARGC1A、NRF1和TFAM mRNA的表达量显著高于3月龄湖羊睾丸组织中的表达量(P < 0.05)。
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图 3 RT-qPCR检测PPARGC1A/NRF1/TFAM通路相关基因在3和9月龄湖羊睾丸组织中的差异表达 Fig. 3 mRNA relative expression levels of PPARGC1A/NRF1/ TFAM pathway associated genes in testis of 3-month-old and 9-month-old Hu sheep analyzed by RT-qPCR |
通过Western blot分析PPARGC1A/NRF1/TFAM信号通路核心因子在湖羊性成熟前后睾丸组织中的表达情况。如图 4所示:随着湖羊的发育, 9月龄湖羊睾丸组织中PPARGC1A、NRF1和TFAM蛋白的表达量显著高于3月龄湖羊睾丸组织中的表达量(P < 0.05)。
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图 4 PPARGC1A/NRF1/TFAM通路相关蛋白在3月龄和9月龄湖羊睾丸中的差异表达 Fig. 4 Expression of PPARGC1A/NRF1/TFAM pathway associated proteins in testis of 3-month-old and 9-month-old Hu sheep |
雄性动物生殖能力受许多激素及其代谢物的影响[9], 其中睾丸间质细胞分泌的T对精子形成和维持繁殖机能具有重要的作用。Nobue等[10]研究发现, 血清中T含量与睾丸发育情况密切相关, 且性成熟后个体血液中T含量显著高于性成熟前, 本研究结果与之一致。此外, 也有研究表明T能够提高胰岛细胞分泌胰岛素的能力[11]。胰岛素是垂体发育的重要调节因子, 而垂体又是机体促肾上腺皮质激素、垂体促性腺激素和生长激素等激素合成的重要器官。同时, 胰岛素在调控支持细胞数量和睾丸大小等方面也起着重要作用。在本研究中, 血清中胰岛素的含量随着湖羊月龄的增加而升高, 这与林晖榕等[12]在大鼠上的研究相一致。
瘦素和胰岛素作为机体代谢中的重要调节因子, 可在脂肪细胞和胰腺β细胞之间建立代谢正反馈联系[13]。IGF-Ⅰ的缺失可导致睾丸支持细胞生长因子减少, 从而间接降低间质细胞的数量, 最终导致T水平降低, 这可能与IGF-Ⅰ具有抗细胞凋亡的特性有关[14]。瘦素对初情期的启动和性成熟的调节具有关键作用, 它不仅可以促进哺乳动物下丘脑-垂体-性腺轴的成熟, 而且还可以直接作用于性腺促进T的分泌, 瘦素还可以通过抑制芳香化酶细胞色素P450活性和mRNA的表达来减少雌激素的产生。李松等[15]研究发现脐血中瘦素含量与动物生长发育呈正相关。在本研究中9月龄湖羊血液中的瘦素含量显著高于3月龄湖羊个体, 这与李松等[15]的研究相似。但也有研究表明, 青春期女性血清瘦素浓度随年龄增长而升高, 而男性血清瘦素浓度在9岁时达到最高, 随后下降, 这可能与瘦素分泌的性别差异和物种差异有关[16]。这些就提示胰岛素等生长代谢激素的分泌可能与动物的生殖生理周期相关。
3.2 PPARGC1A/NEF1/TFAM通路核心基因对湖羊睾丸发育的影响随着动物年龄的增加, 睾丸间质细胞内线粒体的数目越来越多, 并且线粒体的功能活性也越来越强。Guerriero等[17]报道称, 睾丸组织中线粒体产生的低浓度活性氧对二倍体精原细胞的分裂和精子的成熟具有促进作用; 与正常小鼠相比, 线粒体DNA突变小鼠的睾丸质量显著降低, 精子数量减少, 并且间质细胞产生的高浓度活性氧易对精子造成损伤。在未成熟猪或大鼠的睾丸间质细胞中添加cAMP, 可以增加T合成相关蛋白的表达并促进T的分泌[18]。Allen等[19]也通过减少线粒体中电子转运、抑制线粒体ATP合成及破坏线粒体pH等试验发现, 线粒体的功能活性与T的产生和合成密切相关。此外, 线粒体作为细胞能量稳态的主要调节者, 在调控细胞增殖和凋亡等方面也发挥着关键作用。细胞增殖需要能量, 而线粒体DNA编码关键蛋白的电子传递链可通过氧化磷酸化产生ATP, 为细胞增殖提供能量。PPARGC1A在线粒体增殖和呼吸、脂肪形成和脂肪细胞分化以及肝糖异生等生化途径中起着十分重要的作用, 这些结果提示PPARGC1A/NRF1/TFAM通路蛋白作为促进线粒体生物合成的主要调节因子, 可能通过调控睾丸内各种细胞的增殖, 进而促进睾丸的生长发育和成熟。
线粒体的功能与生长相关激素的合成和代谢密切相关。机体内摄取的葡萄糖通过线粒体膜的超极化, 使线粒体基质中Ca2+浓度增加, 从而触发胰岛素的胞吐, 而线粒体DNA的突变可导致胰岛素分泌紊乱, 引起以胰岛素分泌受损为特征的母系遗传性糖尿病的发生。研究发现PPARGC1A和NRF1在胰岛β细胞分泌胰岛素过程中起促进作用, 并且PPARGC1A已成为治疗肥胖和胰岛素抵抗等代谢疾病的新靶点[20]。Rato等[21]研究发现, 胰岛素缺乏会降低PPARGC1A蛋白水平而减弱线粒体的生物合成, 加剧睾丸内各种细胞的氧化损伤, 引发生殖障碍。此外, 与胰岛素结构和作用相似的IGF-Ⅰ可以促进线粒体的功能活性, 减缓心肌细胞的凋亡; 同时IGF-Ⅰ也可以促进有丝分裂, 刺激DNA和RNA的合成, 调控细胞的增殖。也有研究者通过对体外培养的睾丸间质细胞添加不同浓度的IGF-Ⅰ, 发现IGF-Ⅰ对睾丸间质细胞具有保护作用, 且可以促进T合成增加, 从而参与睾丸的生长和发育[22]。在本试验中, 线粒体相关蛋白(PPARGC1A、NRF1和TFAM)表达水平与胰岛素、IGF-Ⅰ的分泌水平均随着睾丸的发育而升高, 这表明胰岛素和IGF-Ⅰ与线粒体可能具有协同作用, 通过调节睾丸内细胞的增殖和代谢来共同促进湖羊睾丸的发育。Martinezabundis等[23]发现瘦素可诱导心肌细胞内线粒体的增生; 而瘦素的分泌紊乱会引起脂质积累, 造成线粒体自噬而导致睾丸间质细胞类固醇生成减少[24]。同时, 类固醇激素也会影响线粒体的功能。Pedram等[25]研究发现雌激素可抑制线粒体膜电位的降低和凋亡的发生, 雄激素可增加细胞色素c氧化酶的活性, 促进线粒体的呼吸功能。在机体发育过程中, 雄激素缺乏会影响PPARGC1A、NRF1和TFAM等线粒体功能调节因子的表达, 降低线粒体的活性, 影响机体发育。本试验中, 线粒体相关蛋白PPARGC1A、NRF1和TFAM表达水平与瘦素、T的分泌水平均随着睾丸的发育而升高, 表明瘦素和T与线粒体也可能具有协同作用, 通过调节睾丸内细胞的增殖和代谢来共同促进湖羊睾丸的发育。Martinezabundis等[23]发现瘦素可诱导心肌细胞内线粒体的增生; 而瘦素的分泌紊乱会引起脂质积累, 造成线粒体自噬而导致睾丸间质细胞类固醇生成减少[24]。同时, 类固醇激素也会影响线粒体的功能。Pedram等[25]研究发现雌激素可抑制线粒体膜电位的降低和凋亡的发生, 雄激素可增加细胞色素c氧化酶的活性, 促进线粒体的呼吸功能。
线粒体不仅是机体的供能中心, 同时也作为信号分子参与细胞周期的调控, 其中线粒体合成关键基因PPARGC1A可通过增加ATP的水平来为机体提供能量, 加速细胞增殖, 还可通过调控细胞周期蛋白来调控细胞周期。睾丸的生长发育是多种细胞连续增殖和分化的过程。本研究中, PPARGC1A、NRF1和TFAM蛋白在湖羊睾丸组织发育过程中呈时空特异性表达, 在3月龄时, PPARGC1A、NRF1和TFAM蛋白在睾丸性原细胞、前精原细胞和间质细胞中均有表达; 在9月龄时, 3种蛋白除在以上3种细胞中表达外, 还在精子细胞、肌样细胞、精原干细胞、精母细胞和支持细胞中表达。这表明PPARGC1A/NRF1/TFAM通路核心基因可能参与睾丸细胞分化, 并且为睾丸细胞增殖和分化过程提供能量, 促进睾丸的生长和发育, 但具体机制仍有待于进一步研究。
本研究结果表明:湖羊性成熟后血液中睾酮、瘦素、胰岛素及IGF-Ⅰ的浓度显著升高, 睾丸组织中PPARGC1A/NRF1/TFAM通路核心因子的表达量显著增加。这说明PPARGC1A/NRF1/TFAM通路可能与湖羊睾丸生长发育和性成熟过程密切相关, 但具体的调控机制还有待进一步研究。
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表1(Table 1)
