南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (2): 336-344   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201806011
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冯程程, 白凯文, 王安谙, 葛晓可, 张莉莉, 王恬
FENG Chengcheng, BAI Kaiwen, WANG Anan, GE Xiaoke, ZHANG Lili, WANG Tian
日粮添加二甲基甘氨酸钠对宫内发育迟缓断奶仔猪肝脏抗氧化能力及免疫指标的影响
Effect of N, N-dimethylglycine sodium salt supplementation on hepatic antioxidant capacity and immune indices in intrauterine growth retardation weanling piglets
南京农业大学学报, 2019, 42(2): 336-344
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(2): 336-344.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201806011

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收稿日期: 2018-06-09
日粮添加二甲基甘氨酸钠对宫内发育迟缓断奶仔猪肝脏抗氧化能力及免疫指标的影响
冯程程 , 白凯文 , 王安谙 , 葛晓可 , 张莉莉 , 王恬     
南京农业大学动物科技学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在研究日粮添加二甲基甘氨酸钠(DMG-Na)对宫内发育迟缓(IUGR)断奶仔猪器官指数、肝脏抗氧化能力和血清免疫指标的调节作用。[方法]分别选择正常初生体质量(NBW)仔猪和IUGR仔猪各16头,21日龄断奶,饲喂基础日粮或补充1 g·kg-1 DMG-Na的试验日粮至49日龄。共分成4个处理组,即NC(NBW+基础日粮)组、ND(NBW+DMG-Na日粮)组、IC(IUGR+基础日粮)组、ID(IUGR+DMG-Na日粮)组,每组8头猪。[结果]与NBW仔猪相比,IUGR仔猪肾脏指数显著降低(P < 0.05),肝脏谷胱甘肽(GSH)含量减少(P < 0.05),抑制羟自由基能力显著降低(P < 0.05),血清补体3(C3)水平下降(P < 0.05),血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)的含量显著升高(P < 0.05)。此外,IUGR仔猪肝脏GSTTNF-α mRNA表达量也显著升高(P < 0.05)。日粮添加1 g·kg-1 DMG-Na后,49日龄仔猪脾脏指数显著增加(P < 0.05),肝中GST活力显著增强(P < 0.05),血清C3水平和白细胞介素10(IL-10)含量显著提高(P < 0.05),并且仔猪肝脏CATGSTGCLCGCLMIL-10 mRNA表达量均显著增加(P < 0.05)。[结论]IUGR断奶仔猪肝脏的抗氧化能力下降,免疫功能受损。日粮补充1 g·kg-1DMG-Na有增强IUGR断奶仔猪肝脏的抗氧化功能和修复仔猪免疫损伤的潜力。
关键词二甲基甘氨酸钠   宫内发育迟缓   器官指数   抗氧化能力   免疫   
Effect of N, N-dimethylglycine sodium salt supplementation on hepatic antioxidant capacity and immune indices in intrauterine growth retardation weanling piglets
FENG Chengcheng, BAI Kaiwen, WANG Anan, GE Xiaoke, ZHANG Lili, WANG Tian    
College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] This experiment was conducted to evaluate the effect of N, N-dimethylglycine sodium salt(DMG-Na) supplementation on organ indexes, hepatic antioxidant capacity and serum immune parameters of intrauterine growth retardation(IUGR) weanling piglets. [Methods] Sixteen normal birth weight(NBW) piglets and sixteen IUGR piglets were selected according to their birth weight. After 21-day-weaning, all piglets were randomly divided into four groups with 8 replicates in each group, and fed control diet alone or supplemented with 1 g·kg-1 DMG-Na to 49 days of age. There were four treatments:NC(NBW+control diet) group, ND(NBW+DMG-Na diet) group, IC(IUGR+control diet) group and ID(IUGR+DMG-Na diet) group. [Results] Compared with NBW piglets, the kidney index of IUGR piglets was lower(P < 0.05), and the hepatic GSH content and the ability to inhibit hydroxyl radicals both decreased(P < 0.05), serum C3 level was significantly reduced(P < 0.05), and the contents of TNF-α and IL-1β in serum increased(P < 0.05). In addition, hepatic mRNA expression levels of GST and TNF-α in IUGR piglets were significantly higher(P < 0.05) than those in NBW piglets. After supplemented with 1 g·kg-1 DMG-Na, the spleen index of IUGR piglets increased(P < 0.05), hepatic GST activity improved(P < 0.05), serum C3 level and IL-10 content increased significantly(P < 0.05), and mRNA expressions of CAT, GST, GCLC, GCLM and IL-10 in IUGR weaned piglets were significantly higher(P < 0.05). [Conclusions] In conclusion, the hepatic antioxidant capacity of IUGR weanling piglets reduced and the immune function was impaired. The control diet supplemented with 1 g·kg-1 DMG-Na had the potential to improve the hepatic antioxidant function and repairs the immune damage triggered by IUGR.
Keywords: N, N-dimethylglycine sodium salt(DMG-Na)    intrauterine growth retardation(IUGR)    organ index    antioxidant capacity    immunity   

胎儿在子宫内的生长发育受到多种因素的制约, 包括营养不良、环境应激或子宫发育不全等, 这些都可能导致胎儿生长滞后, 并对后代造成长期影响[1-2]。临床研究发现, 宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation, IUGR)胎儿在围产期有较高的发病率和死亡率, 从长远来看, IUGR会严重损害机体发育, 后代在成年期发生代谢性疾病的风险也更大[3-4]。在畜牧生产中, 猪作为多胎动物最容易自然发生IUGR, 降低新生猪的存活率, 生长迟缓并影响饲料利用率, 威胁机体健康。研究表明, IUGR会降低机体的抗氧化能力, 使动物更易遭受氧化应激, 而严重的氧化应激则会进一步损伤机体的免疫系统[5-7]。Raqib等[8]发现, IUGR婴儿在整个童年期间遭受持续的免疫损伤。此外, IUGR还导致胎盘和胎儿中细胞因子表达谱的改变[9-10]。肝脏是脊椎动物体内最大的代谢器官, 参与机体新陈代谢过程, 在免疫防御体系中发挥作用。肝脏能够清除代谢过程形成的自由基, 防止其在体内积累过量引起损伤[11]。由于肝脏在胚胎和新生阶段较其他器官发育快, 因此更容易遭受IUGR带来的不良影响。

二甲基甘氨酸(N, N-dimethylglycine, DMG)是动植物代谢过程产生的中间体, 出现在胆碱到甘氨酸代谢的途径中[12]。DMG用作添加剂, 具有增强免疫力和抗氧化能力等生理生化作用[13-14]。DMG是一种亲脂性的水溶性小分子, 能轻松穿过细胞膜, 因此二甲基甘氨酸酯具有表面活性剂特性, 口服后可以迅速、完全被吸收。研究报道, 在日粮中短期添加二甲基甘氨酸钠(N, N-dimethylglycine sodium salt, DMG-Na)具有乳化作用, 可以提高母猪的营养消化率[15]。此外, 给肉鸡饲喂添加1 500 mg · kg-1 DMG-Na可以显著提高肉鸡血液及肝脏的总抗氧化能力[16]。寇涛等[17]还发现在日粮中补充1 000~1 500 mg · kg-1 DMG-Na能提高肉鸡表观利用率和内源消化酶活性, 并能显著改善肉鸡的生产性能。在小鼠上研究发现, DMG-Na可以直接和间接提高机体自由基清除力, 清除过量自由基来保护机体抵抗脂多糖(LPS)诱导的氧化应激, 增强抗氧化防御系统的活性[18]。Hariganesh等[14]推断, DMG可能具有自由基清除活性和通过介导胃黏膜的细胞保护作用, 从而对大鼠胃溃疡具有保护效应。以上结果均说明DMG-Na有促进动物生长、增强机体抗氧化功能、保证健康的潜力。

作为理想的动物模型, IUGR仔猪可以应用于人类IUGR综合症的研究, 为防治IUGR提供一定的思路。然而, 关于DMG-Na在IUGR胎儿方面的研究却很少。所以, 本试验选用断奶后的IUGR仔猪为模型, 检测断奶后添加DMG-Na对IUGR仔猪肝脏抗氧化以及机体免疫功能的影响, 以期作为IUGR后代营养干预方面的参考依据, 同时也为畜牧生产中应用DMG-Na提供理论指导。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验所用DMG-Na(纯度99%)购自齐鲁晟华制药有限公司。

1.2 试验设计与日粮

筛选16头胎次和妊娠期均相近的母猪, 分娩后的新生猪(杜×长×大三元杂交猪)选取体质量相近的作为试验动物。每窝挑选1头正常初生体质量(normal birth weight, NBW)的仔猪(平均1.53 kg)和1头性别相同的IUGR仔猪(平均0.76 kg)[19], 即NBW和IUGR仔猪各16头, 公母各半。本试验采用2×2因子设计, 全部仔猪哺乳至21日龄断奶, 随机分为4组, 分别用基础日粮或DMG-Na日粮(基础日粮+1 g · kg-1 DMG-Na)饲喂至49日龄, 即NC(NBW+基础日粮)组、ND(NBW+DMG-Na日粮)组、IC(IUGR+基础日粮)组、ID(IUGR+DMG-Na日粮)组, 每组8个重复, 每个重复1头猪。依据美国国家科学院(2012)公布的《猪的营养需要》配制基础日粮。基础日粮成分及营养水平见表 1

表 1 基础日粮组成和营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis)
原料组成Ingredient component 含量/%Content 原料组成Ingredient component 含量/%Content 营养组成2)Nutrient component 含量/%Content
玉米Corn 40.00 L-赖氨酸盐酸盐L-lysine-HCl(98%) 0.30 粗蛋白Crude protein 20.20
碎米Broken rice 15.00 L-苏氨酸L-threonine 0.20 亮氨酸Leucine 1.45
发酵豆粕Fermented soybean meal 10.00 L-甲硫氨酸L-methionine 0.15 甲硫氨酸+胱氨酸Methionine+cystine 0.79
去皮豆粕De-hulled soybean meal 6.00 L-色氨酸L-tryptophan 0.05 赖氨酸Lysine 1.34
血浆豆粕Plasma soybean meal 5.00 L-缬氨酸L-valine 0.05 苏氨酸Threonine 0.81
乳清粉Whey powder 7.00 L-异亮氨酸L-isoleucine 0.05 色氨酸Tryptophan 0.23
鱼粉Fish meal 4.00 食盐NaCl 0.30 异亮氨酸Isoleucine 0.74
白糖Sugar 4.50 石粉Limestone 1.10 缬氨酸Valine 0.89
葡萄糖Glucose 3.00 磷酸氢钙Calcium hydrogen phosphate 0.80 钙Calcium 0.85
豆油Soybean oil 1.50 预混料1)Premix* 1.00 总磷Total phosphorus 0.70
  注: 1)每千克预混料中主要物质含量:铁170 mg, 铜150 mg, 锌150 mg, 锰80 mg, 镁68 mg, 碘0.90 mg, 钴0.3 mg, 硒0.2 mg, 维生素A 15 000 IU, 维生素D3 3 000 IU, 维生素E 150 mg, 维生素K3 3 mg, 维生素B1 3 mg, 维生素B2 6 mg, 维生素B6 5 mg, 维生素B12 0.03 mg, 烟酸45 mg, 维生素C 250 mg, 泛酸钙9 mg, 叶酸1 mg, 生物素0.3 mg, 氯化胆碱500 mg。2)消化能为14.34 MJ · kg-1
  Note: 1)In premix, provided per kg of diet:Fe 170 mg; Cu 150 mg; Zn 150 mg; Mn 80 mg; Mg 68 mg; I 0.90 mg; Co 0.30 mg; Se 0.2 mg; vitamin A 15 000 IU; vitamin D3 3 000 IU; vitamin E 150 mg; vitamin K3 3 mg; vitamin B1 3 mg; vitamin B2 6 mg; vitamin B6 5 mg; vitamin B12 0.03 mg; niacin 45 mg; vitamin C 250 mg; calcium pantothenate 9 mg; folic acid 1 mg; biotin 0.3 mg; choline chloride 500 mg. 2)Digestible energy is 14.34 MJ · kg-1.
1.3 饲养管理

试验仔猪每重复饲养于一栏, 自由采食、饮水, 定时清扫猪舍, 舍内温度控制在25~28 ℃, 保持相对湿度在50%~70%。在试验期间, 根据猪场饲养管理要求进行常规免疫和定期消毒。

1.4 样品采集

在仔猪49日龄当天, 全部屠宰。屠宰前禁食12 h, 前腔静脉采血并于4 ℃、3 000 r · min-1离心15 min制备血清, 储存在-20 ℃冰箱中待用。剖开腹腔, 迅速取出肝脏、脾脏、肾脏和胰腺称质量, 切取肝脏的相同部位样本用少量预冷的磷酸盐缓冲液冲洗后, 装入1.5 mL无菌冻存管中立即置于液氮罐保存, 用于后期指标测定。

1.5 测定指标及方法 1.5.1 器官指数

将肝脏、脾脏、肾脏和胰腺分离并称量后使用下列公式计算各器官指数:

1.5.2 肝脏抗氧化能力测定

取肝组织根据1 : 4的质量体积比添加预冷的生理盐水, 用匀浆机冰水浴中匀浆, 4 ℃、3 000 r · min-1离心15 min, 吸取上清液保存于-20 ℃冰箱中待用。肝脏过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性, 抑制羟自由基能力(IHA)、抗超氧阴离子能力和谷胱甘肽(GSH)含量等的测定严格按照南京建成生物技术研究所试剂盒说明书的步骤进行。

1.5.3 血清免疫指标的测定

血清溶菌酶(LZM)活性、补体3(C3)和补体4(C4)水平的测定严格按照南京建成生物技术研究所试剂盒说明书的方法、步骤进行。采用ELISA试剂盒测定血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素10(IL-10)的含量, 试剂盒购自南京建成生物技术研究所。

1.5.4 肝脏抗氧化及免疫相关基因mRNA表达量的测定

使用Trizol试剂提取肝脏总RNA, 并检测其完整性。采用超微量分光光度计确定总RNA浓度和纯度(1.8<D260/D280 < 2.0), 用1 g · L-1的焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate, DEPC)水将RNA浓度统一至500 ng · μL-1。反转录(RT):使用20 μL RT反应体系, 根据TaKaRa反转录试剂盒说明书的方法操作。反转录条件:37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。反转录产物cDNA保存在-20 ℃待用。

qPCR:基因引物序列见表 2(上海Invitrogen公司设计并合成)。采用20 μL qPCR反应体系:SYBR 10 μL, DEPC水6.8 μL, 上、下游引物各0.4 μL, Rox参考染料(50×)0.4 μL, cDNA模板2 μL。qPCR反应程序: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 1 s, 40个循环。每个样品各3个重复。以β-actin作为内参基因, 以NC组目的基因的表达为基准, 用2-ΔΔCT方法计算各目的基因的相对表达量。

表 2 实时荧光定量PCR引物序列 Table 2 Sequences of primers for real-time PCR
基因Gene GenBank序列号GenBank No. 引物对序列(5′→ 3′)Primer pairs sequences 产物长度/bpProduct size
CAT XM_021081498.1 AGCTTTGCCCTTGCACAAAC/ACATCCTGAACAAGAAGGGGC 119
GST Z69586.1 TTCAATGGCCGAGGCAGAAT/GAGGTTGTACTTGGTGGCGA 216
GCLC XM_021098556.1 TTGCAGAGGCTTAACTCTCCC/AGACAGGACCAACTGGACTTT 115
GCLM XM_001926378.4 GTGATGCCGCCCGATTTAAC/TCGCTTCCGAAAGCAGTTCT 91
TNF-α NM_214022.1 CCAGACCAAGGTCAACCTCC/TCCCAGGTAGATGGGTTCGT 103
IL- NM_214055.1 ATTCAGGGACCCTACCCTCTC/CTTGGCGGGTTCAGGTACTA 84
IL-10 NM_214041.1 TTCGGCCCAGTGAAGAGTTT/GGCAACCCAGGTAACCCTTA 100
β-actin DQ845171.1 CGGCATCCACGAAACTACCT/ACTCCTGCTTGCTGATCCAC 269
  注: CAT:过氧化氢酶基因Catalase gene; GST:谷胱甘肽硫转移酶基因Glutathione S-transferase gene; GCLC:谷氨酸半胱氨酸催化亚基基因Glutamate cysteine ligase gene; GCLM:谷氨酸半胱氨酸连接酶基因Glutamate-cysteine ligase gene; TNF-α:肿瘤坏死因子α基因Tumor necrosis factor-α gene; IL- :白细胞介素1β基因Interleukin1β gene; IL-10 :白细胞介素10基因Interleukin-10 gene; β-actin:β肌动蛋白基因。下同。The same as follows.
1.6 数据统计分析

试验数据的统计处理使用SPSS 22.0软件, 采用一般线性模型中的Two-way ANOVA分析比较主因素(仔猪和日粮)及其交互作用的影响。当互作效应P < 0.05时, 采用One-way ANOVA、Turkey法进行多重比较。结果均以平均值表示。

2 结果与分析 2.1 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪器官指数的影响

表 3可知:与NBW仔猪相比, IUGR仔猪肾脏指数显著降低(P < 0.05), 肝脏指数显著升高(P < 0.05), 而脾脏和胰腺指数无明显差异(P>0.05)。添加DMG-Na后, 可使断奶仔猪脾脏指数显著增加(P < 0.05), 其他器官指数变化不显著(P>0.05)。此外, 仔猪初生体质量与日粮对肝脏指数和脾脏指数的影响存在交互作用(P < 0.05), 即饲喂DMG-Na日粮的NBW和IUGR仔猪间肝脏指数差异显著(P < 0.05), 而饲喂补充DMG-Na的日粮只对IUGR仔猪的脾脏指数影响显著(P < 0.05)。

表 3 DMG-Na对正常初生体质量(NBW)和宫内发育迟缓(IUGR)断奶仔猪器官指数的影响 Table 3 Effects of DMG-Na supplementation on organ indexes of normal birth weight(NBW) and intrauterine growth-retardation(IVGR)weanling piglets
项目Item 组别Groups SE PP-value
NC ND IC ID BW Diet BW×Diet
肝脏指数/% Liver index 3.110b 2.966b 3.060b 3.422a 0.066 0.007 0.119 0.001
肾脏指数/% Kidney index 0.184 0.180 0.149 0.160 0.013 0.043 0.787 0.580
脾脏指数/% Spleen index 0.249a 0.255a 0.221b 0.260a 0.006 0.090 0.002 0.019
胰腺指数/% Pancreas index 0.194 0.207 0.221 0.217 0.011 0.084 0.631 0.407
  注: 1)NC:NBW仔猪饲喂基础日粮; ND:NBW仔猪饲喂二甲基甘氨酸钠(DMG-Na)日粮; IC:IUGR仔猪饲喂基础日粮; ID:IUGR仔猪饲喂DMG-Na日粮; SE:标准误; BW:初生体质量; Diet:日粮。2)同行不同小写字母代表组间差异显著(P<0.05)。下同。
  Note: 1)NC:NBW piglets fed with control diet; ND:NBW piglets fed with dimethylglycine sodium salt(DMG-Na)diet; IC:IUGR piglets fed with control diet; ID:IUGR piglets fed with DMG-Na diet. SE:Standard error of the means; BW:Birth weight. 2)Different letters in the same row mean significant difference among the treatments. The same as below.
2.2 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪肝脏抗氧化能力的影响

表 4可知:与NBW仔猪相比, IUGR仔猪肝脏GSH含量和抑制羟自由基能力显著降低(P < 0.05), 而肝脏CAT、GST活性以及抗超氧阴离子能力无显著变化(P>0.05)。日粮中添加DMG-Na后, 49日龄仔猪肝脏GST活性显著增强(P < 0.05), 而GSH含量有升高的趋势(P=0.08)。另外, 仔猪初生体质量与日粮对仔猪肝脏抗氧化功能的影响不存在交互作用(P>0.05)。

表 4 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪肝脏抗氧化能力的影响 Table 4 Effects of DMG-Na supplementation on hepatic antioxidant capacity of NBW and IVGR weanling piglets
项目Item 组别Groups SE PP-value
NC ND IC ID BW Diet BW×Diet
过氧化氢酶(CAT)活性/(U·mg-1)Catalase activity 3.421 3.175 2.944 2.930 0.222 0.175 0.617 0.654
谷胱甘肽(GSH)含量/(μmol·g-1)Glutathione content 69.992 72.292 58.259 67.827 3.219 0.021 0.080 0.272
谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性/(U·mg-1)Glutathione S-transferase activity 12.132 16.376 10.024 13.609 1.896 0.201 0.049 0.859
抗超氧阴离子能力/(U·g-1)Anti-superoxide anion ability 12.535 12.252 12.609 12.326 0.469 0.873 0.547 0.999
抑制羟自由基能力/(U·mg-1)Inhibition of hydroxyl radicals 6.722 6.636 6.098 6.535 0.168 0.037 0.290 0.121
2.3 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪血清溶菌酶活性以及C3和C4水平的影响

表 5可知:与NBW仔猪相比, IUGR仔猪血清C3水平显著降低(P < .05), C4水平和溶菌酶活性无显著差异(P>0.05)。添加DMG-Na可使49日龄断奶仔猪血清C3水平显著提高(P < 0.05), 而C4水平有升高的趋势(P=0.077), 血清溶菌酶活性变化不明显(P>0.05)。此外, 仔猪初生体质量与日粮对血清C3、C4水平的影响存在交互作用(P < 0.05)。

表 5 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪血清溶菌酶活性及C3和C4水平的影响 Table 5 Effects of DMG-Na supplementation on lysozyme activity and levels of C3, C4 in the serum of NBW and IVGR weanling piglets
项目Item 组别Groups SE PP-value
NC ND IC ID BW Diet BW×Diet
溶菌酶活性/(μg·mL-1)Lysozyme activity 2.293 2.431 2.141 2.436 0.203 0.683 0.321 0.739
补体3(C3)水平/(g·mL-1)Complement 3 level 11.758a 13.112a 3.665b 12.433a 1.677 0.017 0.007 0.039
补体4(C4)水平/(g·mL-1)Complement 4 level 62.095a 53.424b 59.125ab 60.270a 1.994 0.333 0.077 0.024
2.4 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪血清炎症细胞因子水平的影响

表 6可知:与NBW仔猪相比, IUGR仔猪血清TNF-α、IL-1β的水平显著升高(P < 0.05), 而IL-10水平则显著降低(P < 0.05)。补充DMG-Na之后, 49日龄断奶仔猪血清中IL-10水平显著提高(P < 0.05), 但是TNF-α和IL-1β的水平没有明显变化(P>0.05)。另外, 仔猪初生体质量与日粮对血清细胞因子含量的影响不存在交互作用(P>0.05)。

表 6 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪血清炎症细胞因子水平的影响 Table 6 Effects of DMG-Na supplementation on the level of cytokines in the serum of NBW and IVGR weanling piglets
项目Item 组别Groups SE PP-value
NC ND IC ID BW Diet BW×Diet
肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平/(pg·mL-1)Tumor necrosis factor-α level 435.571 425.005 528.579 461.217 29.123 0.038 0.196 0.341
白细胞介素1β(IL-1β)水平/(ng·mL-1)Interleukin-1β level 128.439 134.874 196.482 155.375 20.390 0.042 0.405 0.257
白细胞介素10(IL-10)水平/(ng·mL-1)Interleukin-10 level 138.246 143.874 118.937 141.637 5.002 0.043 0.010 0.104
2.5 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪肝脏抗氧化及免疫相关基因mRNA相对表达量的影响

表 7可知:与NBW仔猪相比, IUGR仔猪肝脏GST mRNA相对表达量显著升高(P < 0.05), 而CATGCLCGCLM mRNA表达量未见明显变化(P>0.05)。日粮中添加DMG-Na使49日龄NBW和IUGR断奶仔猪肝脏内CATGSTGCLCGCLM mRNA表达量均显著增加(P < 0.05)。另外, 仔猪初生体质量与日粮对肝脏抗氧化基因mRNA相对表达量的影响不存在交互作用(P>0.05)。

表 7 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪肝脏抗氧化及免疫相关基因mRNA相对表达量的影响 Table 7 Effects of DMG-Na on mRNA relative expression level of hepatic antioxidant and immune related genes in NBW and IVGR weanling piglets
基因Gene 组别Groups SE PP-value
NC ND IC ID BW Diet BW×Diet
CAT 1.000 1.224 0.752 1.159 0.125 0.227 0.020 0.473
GST 1.000 1.446 1.390 2.008 0.191 0.021 0.011 0.257
GCLC 1.000 1.121 0.751 1.097 0.103 0.201 0.035 0.288
GCLM 1.000 1.282 0.967 1.599 0.141 0.328 0.004 0.228
TNF-α 1.000 0.971 1.357 1.078 0.082 0.010 0.074 0.142
IL- 1.000 1.182 1.255 1.525 0.156 0.071 0.164 0.782
IL-10 1.000 1.213 0.613 1.271 0.123 0.197 0.002 0.086

表 7可知:与NBW仔猪相比, IUGR仔猪肝脏TNF-α mRNA表达量显著增加(P < 0.05), 而IL- mRNA表达量有升高的趋势(P=0.071), IL-10 mRNA表达量未见明显差异(P>0.05)。在日粮中添加DMG-Na后, 49日龄NBW和IUGR断奶仔猪肝脏IL-10 mRNA表达量均显著增加, TNF-αmRNA表达量则有下降的趋势(P=0.074)。此外, 仔猪初生体质量与日粮对肝脏免疫基因mRNA相对表达量的影响不存在交互作用(P>0.05)。

3 讨论 3.1 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪器官指数的影响

目前, 由于IUGR的发生率较高, 并可对机体造成不可逆转的损伤, 日益受到医学和营养学方面的关注[1, 20]。内脏器官的发育情况是机体能否正常发挥各项生理功能的基础, 器官指数是动物试验中常用的指标之一, 在某种程度上能够反映动物机体机能情况[21]。Bauer等[22]研究发现, 新生仔猪内脏器官质量与体质量呈显著正相关, 与正常仔猪相比, IUGR仔猪的内脏器官质量显著降低。何进田等[23]研究发现IUGR会限制哺乳仔猪肝脏发育, IUGR仔猪肝脏质量显著低于NBW组。Xu等[24]的试验表明IUGR降低了35日龄仔猪肝脏、肾脏和胰腺的相对质量。本试验发现IUGR断奶仔猪的肾脏指数显著降低, 而脾脏和胰腺指数并无显著差异, 这与前人的研究结果并不完全一致, 可能是由于品种、饲养条件以及日粮等差异所致。此外, 我们发现IUGR仔猪肝脏指数高于NBW仔猪, 器官指数提高表明器官成熟快, 代谢水平高, 这或许可以用补偿生长来解释。补偿生长是动物机体为抵御和补偿营养、环境、疾病等因素的限制和制约而反馈性地处于一种适应性的有组织状态, IUGR仔猪在受到营养限制后, 物质代谢和能量转化在不断的动态变化中努力达到一种“相对的动态平衡”的反馈性调节。饲喂补充了DMG-Na的日粮后, 49日龄仔猪脾脏指数显著增加。脾脏是动物机体最大的外周免疫器官, 脾脏的发育状况关系到体液和细胞免疫的功能能否正常发挥。DMG-Na的添加提高了断奶仔猪的脾脏指数, 说明DMG-Na对仔猪免疫器官的发育有一定的促进作用。一般认为, 免疫器官质量增加是由于其自身细胞生长发育和分裂增殖所致, 是免疫增强的表现。

3.2 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪肝脏抗氧化能力的影响

在健康状态时, 动物处于体内氧化和抗氧化间的动态平衡中, 机体一旦遭受如营养不均衡、疾病等应激时, 就会生成大量的自由基, 而体内抗氧化系统的清除能力有限, 过量的自由基将机体的氧化还原平衡状态打破, 最终导致氧化应激反应[25], 损害动物健康。CAT是一种经典的抗氧化酶, 能将H2O2分解为水和氧气, 在细胞防御由H2O2导致的氧化损伤中发挥重要作用[26]。GST是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一, 是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒酶, 保护胞内生物大分子免受亲电子化合物的攻击[27]。GSH是自由基清除剂, 是体内一种非酶抗氧化物质。而抑制羟自由基能力和抗超氧阴离子能力则直接反映机体对自由基的清除能力。上述几种指标可在一定程度上反映机体的氧化还原状态。本试验结果表明, 虽然49日龄IUGR仔猪肝脏抗超氧阴离子能力与NBW仔猪相比无显著差异, 但GSH含量和抑制羟自由基能力却显著下降, 这提示IUGR可能一定程度抑制了肝脏清除自由基的能力。Zhang等[28]的试验结果表明, 21日龄IUGR仔猪肝脏中GSH含量显著减少, 本试验结果与之一致。李博等[29]发现, 7日龄IUGR仔猪的肝脏CAT活性显著降低, 但本试验中IUGR仔猪和正常仔猪肝脏CAT活性无明显差异, 或许是因为本试验样本是49日龄仔猪, 随着饲养时间的延长, 肝脏CAT活性逐渐得到了恢复。日粮添加DMG-Na后, 49日龄仔猪肝脏GST活性显著增强, GSH含量也有升高的趋势。DMG-Na在体内经由肝脏中的脱甲基氧化酶代谢后能够生成细胞内的重要产物肌氨酸和甘氨酸, 二者都在细胞生理和生化过程中起重要作用。值得注意的是, 甘氨酸是参与GSH合成的氨基酸, 而GSH与抗氧化应激以及蛋白质和DNA合成的调节有关。甘氨酸被认为是早产儿的条件性必需氨基酸。据报道, 母体对胎儿的甘氨酸转移在人类和其他物种中是受限的[30-31]。我们推测, DMG-Na可能通过直接增强肝脏GST活性, 增加GSH含量, 提高断奶仔猪肝脏抗氧化能力和自由基清除力。Bai等[18]通过体外试验和小鼠体内试验证明DMG-Na能提高肝脏自由基清除率, 显著提高LPS处理小鼠的肝脏GSH含量并增强CAT活性, 本试验结果与之相似。

3.3 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪血清溶菌酶活性及C3和C4水平的影响

仔猪血液指标的变化与其健康状况、生长状态密切相关。溶菌酶是一种非特异性抗菌物质, 主要来源于吞噬细胞, 能水解病原菌中黏多糖的碱性酶[32]。C3、C4是补体系统的基本组成要素, 保护机体参与免疫应答并维持体内稳态, 帮助抗体消灭病原体, 在非特异性抗感染方面发挥效应[33]。本研究结果表明, 与NBW仔猪相比, IUGR断奶仔猪血清C3水平显著降低, 这与黄强等[33]的研究结果一致; 而C3水平下降的结果提示, IUGR仔猪血液中的某些非特异性抗菌物质可能受到抑制而削弱了机体的免疫功能。此外, 肝脏是合成补体的主要部位, 也间接表明了IUGR与肝脏损伤之间的关系。但IUGR仔猪血清溶菌酶活性与NBW仔猪相比并无差异。本试验发现, 日粮补充DMG-Na后, 仔猪血清C3水平显著升高, C4水平也有提高的趋势, 说明添加DMG-Na能够在一定程度加强断奶后IUGR猪的非特异性免疫能力, 有利于动物的生长健康。

3.4 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪血清炎症细胞因子含量的影响

细胞因子本质是糖蛋白或多肽类物质, 由巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞分泌, 并能够影响其他免疫细胞的功能[33]。根据功能可将它们分为4类:具有有抗病毒活性的细胞因子, 具有免疫调节活性的细胞因子, 具有炎症介导活性的细胞因子和具有造血生长活性的细胞因子。介导炎症活性的细胞因子有促炎和抗炎之分, 促炎细胞因子主要有IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等, 抗炎细胞因子主要是IL-2、IL-4和IL-10[34]。本试验发现, 与NBW仔猪相比, IUGR使血清TNF-α和IL-1β含量显著增加, 而IL-10含量显著降低, 这表明IUGR可能通过促进促炎因子的释放及抑制抗炎细胞因子形成而影响仔猪的免疫功能。而Han等[35]研究发现IUGR新生仔猪血清TNF-α、IL-1β含量显著减少。我们猜测, IUGR新生仔猪体内降低的细胞因子水平可能与其体内免疫细胞数量较少有关; 此外, 本试验的研究对象是断奶仔猪, 断奶过程会引起断奶应激, 而IUGR仔猪应激情况会更为严重, 导致促炎细胞因子分泌能力增强。日粮补充DMG-Na后, 仔猪血清中IL-10含量显著提高, 提示DMG-Na可以促进抗炎因子的产生与释放, 从而对IUGR引起的仔猪免疫缺陷可能起到一定的缓解作用。

3.5 DMG-Na对NBW和IUGR断奶仔猪肝脏抗氧化和免疫相关基因表达量的影响

基因水平上的研究结果表明, NBW和IUGR断奶仔猪的肝脏CATGCLCGCLM mRNA相对表达量无明显差异, 但IUGR仔猪肝脏GST mRNA相对表达量高于NBW仔猪, 我们推断或许是因为IUGR造成了氧化应激, 激活机体自我损伤修复系统, 增加抗氧化基因GST mRNA表达量。在日粮中添加DMG-Na后, 肝脏CATGST mRNA表达量与基础日粮组断奶仔猪相比显著提高, 说明DMG-Na能够从基因水平促进肝脏抗氧化系统发育。GSH的合成由2种酶介导, 分别是γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(γ-GCL)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS), 其中γ-GCL通常是限速酶。GCL全酶由谷氨酰半胱氨酸连接酶调控亚基(GCLM)和谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)组成[36]。补充DMG-Na后, 断奶仔猪肝脏GCLCGCLM mRNA表达量均显著升高, 结合肝脏GSH含量有增加的趋势, 提示DMG-Na或许是通过提高GCLCGCLM mRNA相对表达量并提供甘氨酸作为原料促进肝脏GSH的合成, 进而增强IUGR仔猪肝脏清除自由基的能力并提高机体抗氧化能力。

IUGR仔猪肝脏TNF-αIL- mRNA相对表达量低于NBW仔猪, 尤其是TNF-α表达量显著降低, 这与黄强等[33]在IUGR仔猪回肠上的研究结果相似。血清中TNF-α和IL-1β检测结果与肝脏相应基因mRNA表达趋势不一致, 可能是由于组织特异性以及从基因表达到蛋白质合成过程中的复杂性所致。DMG-Na的添加显著提高了IL-10 mRNA表达量, 也与血清IL-10的含量变化趋势一致, 推测DMG-Na主要通过促进抗炎细胞因子的表达来修复免疫损伤。DMG-Na调控IUGR断奶仔猪肝脏抗氧化与免疫功能的机制还需要从基因转录水平及蛋白质翻译水平上进一步探究证实。

综合本试验结果, IUGR断奶仔猪的肝脏GSH含量和抑制羟自由基能力显著降低。另外, IUGR显著下调了血清C3水平, 并引起促炎细胞因子水平显著升高, 抗炎细胞因子水平降低, 相应基因的mRNA相对表达水平也表现类似改变。断奶仔猪日粮中添加1 g · kg-1 DMG-Na能增加脾脏器官指数, 减轻IUGR引起的免疫功能损伤, 促进抗氧化基因表达, 加强肝脏抗氧化功能的潜力。结果提示:DMG-Na可能通过增强肝脏抗氧化防御系统, 提高自由基清除能力和修复免疫损伤等作用保护动物健康, 为DMG-Na作为饲料添加剂应用到畜牧生产中提供了理论基础。

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