文章信息
- 崔梦杰, 郭凤菲, 王晨, 纠松涛, 朱旭东, 房经贵
- CUI Mengjie, GUO Fengfei, WANG Chen, JIU Songtao, ZHU Xudong, FANG Jinggui
- 葡萄VvAGL11和VvAGL15基因的鉴定及其在赤霉素诱导葡萄无核果实发育过程中的作用
- Identification and roles of VvAGL11 and VvAGL15 gene in the development process of seedless grape berry induced by gibberellin
- 南京农业大学学报, 2019, 42(2): 261-269
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(2): 261-269.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201803054
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文章历史
- 收稿日期: 2018-03-27
2. 南京大学生命科学学院, 江苏 南京 210023
2. College of Life Science, Nanjing University, Nanjing 210023, China
葡萄(Vitis vinifera L.)可用于鲜食、酿酒、制干和制汁, 在市场上很受欢迎。无核是鲜食和制干葡萄的优良性状之一[1], 也是提高葡萄经济价值的首要性状[2], 因此, 生产质优、无公害的无核葡萄是未来葡萄产业发展的趋势。赤霉素(GA3)作为植物体生命活动重要的调节物质, 是诱导葡萄无核的关键激素[3-4]。目前, 对葡萄生理机制方面的研究较多[5-6], 而有关分子机制方面研究较少。
MADS-box(如:MCM1、AGAMOUS、DEFICIENS、SRF4)蛋白家族是植物特有的转录因子, 大量不同植物种类的MADS家族基因已被成功克隆, 它们在生长发育调控和信号转导中发挥着重要作用[7-9]。AGL11和AGL15基因是MADS家族中的2个成员, 已有研究表明, AGL11和AGL15通过结合基因启动子区的DNA和调控基因表达在植物胚胎发育中发挥重要作用[10-13]。研究发现, 种胚发育是影响果实无核的重要因素[6], 下调葡萄果实中VvAGL11基因的表达, 可以促进无核果实的形成[11]。但目前尚未有葡萄VvAGL11和VvAGL15应答GA3信号, 参与果实种胚发育过程的相关报道。因此, 本研究从‘巨峰’葡萄中鉴定到了VvAGL11和VvAGL15基因, 分析其序列特征及潜在功能, 并利用荧光定量PCR分析2个基因应答赤霉素信号在果实发育不同时期及不同部位的表达模式, 探讨其在葡萄果实种胚发育过程中的作用, 为深入阐释赤霉素诱导葡萄无核的分子机制提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 供试材料及取样试验于2016年5月12日—7月21日在江苏省农博园葡萄园内进行。葡萄园区位于江苏省句容市, 属于亚热带季风气候, 年均气温15.4 ℃, 年降雨量1 150 mm。供试材料为5年生、欧美杂交品种‘巨峰’, 株距为1.0 m, 行距为2.5 m, 双十字V型架, 避雨栽培。
选取生长势、负载量较为一致的‘巨峰’葡萄, 根据前人研究[14-15]和预试验结果, 设置50 mg · L-1赤霉素(GA3)水溶液处理, 清水处理作为对照。每个处理选定6株长势较为一致的植株, 每2株为1个重复, 共设3次重复。于葡萄盛花期(5月12日)进行浸蘸花穗处理, 每小时蘸1次, 每次30 s, 共浸蘸3次。
根据文献[16]报道, 并结合生产经验, 分别采集葡萄幼果期(花后10 d, 5月22日)、硬核期(花后39 d, 6月20日)、转色前1周(花后52 d, 7月3日)及转色期(花后70 d, 7月21日)的果实。分别从每组对照与处理的植株中随机选择4个果穗, 每穗分上、中、下3个部位随机采取若干个果粒。采集后的样品一部分用于生理指标测定及体式显微镜观察; 另一部分分离果实各个部位:果皮、果肉、种子/种子区, 液氮速冻后带回实验室于-70 ℃冰箱中保存备用。
1.2 葡萄果穗和浆果生长情况的观察采样阶段实时拍照, 并使用直尺测量果穗的长、宽; 采样后使用体式显微镜进行微观拍摄与比对(果实纵剖); 电子天平称取不同时期各处理单果质量; 电显式游标卡尺测量单果横、纵径。
1.3 AGL11和AGL15基因序列识别采用CTAB方法[17]提取葡萄果实RNA, 采用Prime ScriptTM RT-PCR反转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA。以拟南芥AGL11和AGL15的氨基酸序列为信息, 比对葡萄基因组数据库(http://genomes.cribi.unipd.it/grape/blast/blast.php和http://www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/ggb/vitis/12X/gbrowse/vitis/), 得到预测的cDNA序列。设计特异性引物(表 1)进行PCR扩增, 反应程序为:94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃ 10 min。回收PCR产物, 并连接到pMD19-T载体上, 构建重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 筛选阳性克隆, 送交测序。
| 引物Primer | 引物序列Primer sequence(5′→3′) | 用途Usage |
| VvAGL11-F/R | ATGGGGAGAGGAAAGATCGAGATC/CTACCCAATGCATGGCTTG | ORF扩增ORF amplification |
| VvAGL15-F/R | ATGGGACGTGGTAAGATTGAG/TTAACTGCCAGAGTTGTTGGAG | ORF扩增ORF amplification |
| VvAGL11-F/R | GCTCGAGAACAGGCTTGAAC/GCCTCTCCACTTCTGCAATC | RT-qPCR |
| VvAGL15-F/R | TCCGGCTTGAGCTTAAAAGA/AACCAAACCTCGAAGCTCCT | RT-qPCR |
| VvACTIN-F/R | GCTCGCTGTTTTGCAGTTCTAC/AACATAGGTGAGGCCGCACTT | RT-qPCR |
根据所得cDNA片段, 利用在线软件ORF Finder对其进行ORF分析; 利用NCBI网站的BLASTp程序进行同源序列比对; 采用DNAMAN V6软件分析其氨基酸序列; 采用MEGA 7软件中的邻接法, 进行系统进化树构建, 步长值为1 000;利用NCBI中Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)程序进行蛋白保守域结构预测; 利用在线软件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)进行蛋白质作用元件分析。利用PredictProtein在线软件(http://www.predictprotein.org/)进行蛋白质亚细胞定位预测; 基因的蛋白质二级结构在网站Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)进行预测。
1.4 VvAGL11和VvAGL15基因在葡萄果实发育过程中的表达采用葡萄VvACTIN(XM_002273532)作为内参基因。根据定量PCR引物的设计原则, 利用Primer 3 Input(http://primer3.ut.ee/), 对葡萄VvAGL11和VvAGL15基因设计定量PCR引物(表 1)。按照SYBR Premix ExTaqTM试剂盒(宝生物工程有限公司)说明书操作, 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法, 检测基因的相对表达量。扩增体系(20 μL):1 μL cDNA, 上、下游引物各0.4 μL, 10 μL 2×TransStart® Tip Green qPCR SuperMix, 8.2 μL ddH2O。反应程序为:94 ℃ 30 s; 94 ℃ 5 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s, 40个循环。试验设置3次重复。反应结束后分析荧光值变化曲线以及熔解曲线。试验数据采用2-ΔΔCT法[18]进行分析。
1.5 葡萄VvAGL11和VvAGL15基因的启动子作用元件分析在Grape Genome Browser(http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)中, 寻找到每一个基因序列上游1 500 bp的片段, 即获得基因的启动子序列, 将其放入PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中, 即可查找到每个基因的启动子所对应的作用元件, 从而预测每一个基因潜在的生物学功能。
1.6 数据处理所有数据应用方差分析软件进行分析。采用新复极差法进行显著性检验, 采用Excel 2013进行绘图。
2 结果与分析 2.1 赤霉素处理对‘巨峰’葡萄果粒及果穗的影响由图 1可见:赤霉素(GA3)处理的葡萄果实出现无核化的现象。由表 2可见:GA3处理后, ‘巨峰’葡萄果粒纵径以及果穗长度和宽度均显著增加; 果穗轴直径显著增加, 且该现象发生在果实硬核期之前。表明赤霉素处理具有明显加粗穗轴的作用。
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图 1 ‘巨峰’葡萄不同生长发育期的横切面 Fig. 1 Longitudinal section of'Kyoho'grape berry at different development stages CK:对照Control; GA3:赤霉素处理Gibberellin treatment.下同。The same as follows. |
| 指标Index | 05-12 | 05-22 | 06-20 | 07-03 | 07-21 | |||||||||
| CK | GA3 | CK | GA3 | CK | GA3 | CK | GA3 | CK | GA3 | |||||
| 横径/mm Transverse diameter | 5.50a | 5.50a | 8.67b | 10.09a | 15.80a | 15.80a | 20.00a | 16.50b | 22.60a | 18.00b | ||||
| 纵径/mm Longitudinal diameter | 6.10a | 6.10a | 9.52b | 12.77a | 16.80b | 22.40a | 21.00b | 23.60a | 23.80b | 25.40a | ||||
| 果穗长度/cm Length of clusters | 5.50a | 5.50a | 7.80b | 8.00a | 10.50b | 11.00a | 11.80b | 11.90a | 12.10b | 12.90a | ||||
| 果穗宽度/cm Width of clusters | 10.40a | 10.40a | 13.20b | 15.10a | 19.20b | 22.40a | 24.30b | 26.30a | 25.20b | 28.40a | ||||
| 单果质量/g Single weight | 0.20a | 0.20a | 0.50b | 0.60a | 1.30b | 1.40a | 1.80a | 1.60b | 2.20a | 1.90b | ||||
| 果穗轴直径/cm Diameter of spike stalk | 0.30a | 0.30a | 0.40b | 0.60a | 0.55b | 0.90a | 0.60b | 1.10a | 0.61b | 1.20a | ||||
| 注:不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。下同。 Note:Different small letters indicated significant difference at 0.05 level between treatments. The same as follows. | ||||||||||||||
以拟南芥的AGL11和AGL15基因(登录号:AT4G09960、AT5G13790)cDNA序列为信息探针, 对葡萄基因组网站进行BLAST搜索, 得到2个cDNA序列, 分别是GSVIVT01025945001(VvAGL11)和GSVIVT01001437001(VvAGL15)。基因结构示意图见图 2-A, VvAGL11和VvAGL15所在染色体分别为Chr18、Chr13, 开放阅读框(ORF)分别为702和747 bp, 分别编码233和248个氨基酸, 蛋白质相对分子质量分别为56.89×103和60.34×103, 理论等电点均为4.96。在线软件ORF Finder分析发现克隆得到的基因(登录号为MG581423和MG581424)与预测得到的基因序列片段相同, 且均含有MADS-MEF2-like和K-box结构域(图 2-B)。
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图 2 VvAGL11和VvAGL15基因序列分析
Fig. 2 Sequences analysis of VvAGL11 and VvAGL15
A. GSVIVT01025945001和GSVIVT01001437001基因组序列结构示意图; B.葡萄VvAGL11和VvAGL15的ORF及其编码的氨基酸序列。 A. Schematic diagram of GSVIVT01025945001 and GSVIVT01001437001 genome sequences; B. The ORF sequence and amino acid sequence of grape VvAGL11 and VvAGL15. TAG和TAA为终止密码子。TAG and TAA are the stop codon. |
将上述cDNA编码氨基酸序列提交NCBI-BLASTp在线对比结果发现, 在搜索到的22个物种中, 除了木瓜、花生、梨、桃树、芝麻、甜瓜、拟南芥, VvAGL11与其余15个物种同源性在90%以上。而VvAGL15与苦瓜、大豆、木豆、甜瓜、拟南芥的同源性较低, 与其他17个物种的同源性均在80%以上。氨基酸序列比对结果显示, MG581423(VvAGL11)和MG581424(VvAGL15)的氨基酸序列与绝大多数物种的同源性较高。
2.3.2 蛋白序列进化分析由图 3可见:葡萄VvAGL11与柑橘和苦瓜的亲缘关系最近, VvAGL15与苹果和梨的亲缘关系最近, 而两者均与桃和青梅的亲缘关系较远。
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图 3 葡萄AGL11和AGL15与其他物种的系统进化分析 Fig. 3 The phylogenetic relationships of AGL11 and AGL15 of grape and other species Me:木薯Manihot esculenta; Hb:巴西橡胶树Hevea brasiliensis; Jc:麻疯树Jatropha curcas; Tc:可可Theobroma cacao; Vv:葡萄Vitis vinifera; Cs:柑橘Citrus sinensis; Gh:陆地棉Gossypium hirsutum; Cp:木瓜Carica papaya; Mc:苦瓜Momordica charantia; Ai:花生Arachis ipaensis; Gm:大豆Glycine max; Cc:木豆Cajanus cajan; Fa:草莓Fragaria× ananassa; Pb:梨Pyrus× bretschneideri; Pp:桃Prunus persica; Pm:青梅Prunus mume; Si:芝麻Sesamum indicum; Jr:核桃Juglans regia; Cm:甜瓜Cucumis melo; Md:苹果Malus domestica; At:拟南芥Arabidopsis thaliana; Rc:蓖麻Ricinus communis.下同。The same as follows. |
通过蛋白质保守结构域分析, 结果(图 4)表明葡萄AGL11和AGL15与拟南芥等植物保守结构域相同, 均含有MADS-MEF2-like结构域和K-box家族保守结构。根据该结果可以推测, 克隆得到的MG581423和MG581424即为葡萄VvAGL11和VvAGL15序列。
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图 4 葡萄AGL11、AGL15与其他植物保守结构域分析 Fig. 4 Conserved domain analysis of AGL11 and AGL15 from grape and other species |
由图 5可知:在搜索到的10个作用元件中, VvAGL11有4个作用元件(motif 1、motif 2、motif 6、motif 10)在所比对物种中完全保守; 而VvAGL15有5个作用元件(motif 1、motif 4、motif 6、motif 7、motif 9)在所比对的物种中完全保守。这表明葡萄VvAGL11和VvAGL15的氨基酸序列与其他植物相比, 保守性较高。该结果进一步证明, 克隆得到的基因即为葡萄VvAGL11和VvAGL15序列。
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图 5 葡萄VvAGL11和VvAGL15与其他植物保守结构分析 Fig. 5 Structural analysis of conserved protein of AGL11 and AGL15 from grape and other species |
对葡萄VvAGL11和VvAGL15蛋白质二级结构(图 6)分析发现, 其蛋白二级结构均有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲3种形式组成, 且均以α-螺旋和无规则卷曲为主, β-折叠结构最少(图 6-A)。亚细胞定位预测显示:VvAGL11、VvAGL15均定位于细胞核中(图 6-B)。VvAGL11和VvAGL15蛋白结构及亚细胞定位的相似性预示着二者蛋白功能的相似性。
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图 6 VvAGL11和VvAGL15蛋白质二级结构图和亚细胞定位预测 Fig. 6 The secondary structures and subcellular localization prediction of VvAGL11 and VvAGL15 protein |
由表 3可见:VvAGL11和VvAGL15的启动子元件可分为5个类型, 分别为光响应相关元件:ACE、AE-box、Box 4、Box Ⅰ、G-Box、GA-motif、GAG-motif、Ⅰ-box、LAMP-element、Sp1、TCCC-motif、GATA-motif等; 激素相关响应元件:ABRE、ERE、GARE-motif、P-box、TATC-box、TCA-element、TGACG-motif等; 胚乳表达响应元件:Skn-1_motif; 胁迫相关响应元件:ARE、Box-W1、HSE、TC-rich repeats等; 周期节律相关的元件:circadian等。其中光响应相关元件数量最多, 胁迫相关和激素相关响应元件的数量次之, 周期节律相关响应元件的数量最少。
| 基因 Gene |
光响应相关元件 Light-relatedelements |
胁迫相关响应元件 Stress responsiveelements |
胚乳表达响应元件 Endospermexpressionelements |
周期节律相关元件 Circadian-relatedelements |
激素相关响应元件 Hormone-related elements |
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| 脱落酸 Abscisic acid |
乙烯 Ethylene |
赤霉素 Gibberellin |
水杨酸 Salicylic acid |
茉莉酸甲酯 MeJA |
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| VvAGL11 | 20 | 7 | 4 | 2 | 2 | 1 | 3 | 1 | 0 |
| VvAGL15 | 21 | 4 | 5 | 1 | 0 | 0 | 2 | 1 | 2 |
研究还发现VvAGL11和VvAGL15的激素响应元件中均含有赤霉素相关响应元件, 说明这2个基因可能响应赤霉素信号, 从而在赤霉素信号途径中发挥重要作用; 此外, 在2个基因启动子作用元件中也发现了与胚乳发育相关元件, 表明葡萄VvAGL11和VvAGL15基因与胚乳的形成等生命活动密切相关, 且进一步表明2个基因功能的相似性。
2.6 VvAGL11和VvAGL15应答GA3信号在葡萄果实胚发育过程中的表达分析RT-qPCR结果(图 7和图 8)表明, 葡萄VvAGL11和VvAGL15在果实发育不同时期不同组织中的表达具有时空特异性。VvAGL11和VvAGL15基因在果实硬核期和转色前1周以及VvAGL15基因在转色期时, 其种子内表达量均较高, 其余部位较低。表明VvAGL11和VvAGL15基因均在果实种子区发挥着重要的作用。在果皮和果肉中, GA3处理能够上调VvAGL11和VvAGL15基因在果实整个发育时期中的表达; 而在种子中, GA3处理下调其在整个发育时期的表达。结合GA3在葡萄果实种子发育中的作用, 可以推测VvAGL11和VvAGL15应答GA3信号, 降低自身在葡萄种子区的表达, 从而影响种胚的正常发育, 形成无核果实。
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图 7 ‘巨峰’葡萄果实VvAGL11基因的表达 Fig. 7 Expression level of VvAGL11 gene in'Kyoho'gape berry |
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图 8 ‘巨峰’葡萄果实VvAGL15基因的表达 Fig. 8 Expression level of VvAGL15 gene in'Kyoho'gape berry |
赤霉素是植物生长发育过程中的主要激素, 也是开花、坐果及果实发育所必需的激素。赤霉素诱导葡萄无核化技术目前已被广泛应用于葡萄生产, 产生了很高的经济效益。生产上主要通过外源赤霉素来诱导葡萄无核化, 但到目前为止, 其分子机制尚不太清楚。因此, 探索植物应答赤霉素信号的分子调控机制对于开展无核葡萄分子设计育种具有重要意义。
MADS-box基因编码的蛋白质是一类数目庞大的转录因子家族, 在植物花的形态建成、胚珠、种子、叶片和根的发育过程中起到重要的调控作用[19-22]。本研究对MADS-box基因家族VvAGL11和VvAGL15蛋白序列分析表明, 其在不同物种中序列的同源性较高, 且均含有MADS-MEF2-like和K-box结构域, 与棉花[23]、苹果[24]、龙眼[25]等物种中克隆到的AGL11和AGL15的结构域相同, 且它们可能参与植物的胚发育进程[26]。但是, 植物胚发育是一个受多基因调控的复杂过程, 如拟南芥AtAGL15在胚胎发育中表达量达到高峰, 并且与其下游靶控基因DTA1 (downstream target of AGL151 )共同参与拟南芥胚胎发育的赤霉素调控途径[12]。抑制番茄SlAGL11 基因的表达能够产生无籽果实[10]。本研究中, VvAGL11、VvAGL15在果实生长发育期的种子区表达量较高, 而GA3能够显著抑制其在种子区的表达量。此外, VvAGL11和VvAGL15启动子作用元件中含有赤霉素响应元件及胚乳发育响应元件, 表明这2个基因可能响应赤霉素信号, 同时与胚乳发育相关。而前人研究发现胚乳停止发育可导致葡萄胚的败育[27], 结合GA3诱导葡萄无核化的现象, 我们推测, GA3可能通过下调其表达从而抑制其胚乳的正常发育, 形成无核果实, 这与番茄研究的结论一致[10], 但还有待进一步的生物学功能验证。
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