南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (2): 261-269   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201803054
0

文章信息

崔梦杰, 郭凤菲, 王晨, 纠松涛, 朱旭东, 房经贵
CUI Mengjie, GUO Fengfei, WANG Chen, JIU Songtao, ZHU Xudong, FANG Jinggui
葡萄VvAGL11VvAGL15基因的鉴定及其在赤霉素诱导葡萄无核果实发育过程中的作用
Identification and roles of VvAGL11 and VvAGL15 gene in the development process of seedless grape berry induced by gibberellin
南京农业大学学报, 2019, 42(2): 261-269
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(2): 261-269.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201803054

文章历史

收稿日期: 2018-03-27
葡萄VvAGL11VvAGL15基因的鉴定及其在赤霉素诱导葡萄无核果实发育过程中的作用
崔梦杰1 , 郭凤菲2 , 王晨1 , 纠松涛1 , 朱旭东1 , 房经贵1     
1. 南京农业大学园艺学院, 江苏 南京 210095;
2. 南京大学生命科学学院, 江苏 南京 210023
摘要[目的]本文旨在研究VvAGL11VvAGL15在应答赤霉素(GA3)信号诱导葡萄无核果实发育过程中的作用。[方法]以‘巨峰’葡萄为试材,鉴定了VvAGL11VvAGL15的cDNA全长序列,并通过分析基因的启动子顺式作用元件预测其潜在功能,同时运用RT-qPCR方法检测对照和GA3处理组葡萄VvAGL11VvAGL15的时空表达水平。[结果]GA3处理能够诱导葡萄果实无核化,使葡萄果粒和果穗显著伸长,穗轴增粗。同时,鉴定到VvAGL11(MG581423)和VvAGL15(MG581424)的cDNA全长序列。VvAGL11和VvAGL15蛋白序列与可可和棉花的亲缘关系较近;二者均含有MADS-MEF2-like和K-box家族保守结构域,属于MADS-box转录因子家族;其主要二级结构元件为α-螺旋和无规则卷曲,且主要定位于细胞核中,蛋白结构具有保守性。启动子顺式作用元件分析显示:二者均含有响应赤霉素和胚乳发育相关的motifs。RT-qPCR分析显示,在果实硬核期和转色期的种子中,VvAGL11VvAGL15的表达量较高,而GA3处理能够显著抑制其在种子中的表达。[结论]鉴定到MADS-box基因家族中的2个成员,分别为VvAGL11VvAGL15。GA3处理可抑制VvAGL11VvAGL15在种子区的表达,影响种胚的正常发育,从而形成无核果实。
关键词葡萄   VvAGL11   VvAGL15   克隆   种胚发育   
Identification and roles of VvAGL11 and VvAGL15 gene in the development process of seedless grape berry induced by gibberellin
CUI Mengjie1, GUO Fengfei2, WANG Chen1 , JIU Songtao1, ZHU Xudong1, FANG Jinggui1    
1. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. College of Life Science, Nanjing University, Nanjing 210023, China
Abstract: [Objectives] The paper aimed to study the role of VvAGL11 and VvAGL15 in development process of seedless grape berry induced by gibberellin. [Methods] Full-length of cDNA of VvAGL11 and VvAGL15 was obtained from 'Kyoho'. Potential function of VvAGL11 and VvAGL15 was predicted by analyzing its promoter motif elements. Spatio-temporal expression level of VvAGL11 and VvAGL15 in grape berry from control and GA3 treatment groups was detected by RT-qPCR. [Results] Seedless grape berries were induced by GA3 treatment which can significantly elongate grape berry and clusters and thickening spike stalk. At the same time, cDNA full-length of VvAGL11(MG581423) and VvAGL15(MG581424) was identified. Both VvAGL11 and VvAGL15 contained conserved domains of MADS-MEF2-like and K-box, belonging to the MADS-box transcription factor family. The main secondary structural elements were α-helix and random coil, and these two genes were mainly located in the nucleus. The protein structure was conservative. Promoter cis-acting element analysis showed that both of them contained the gibberellin-responsive elements and the elements required for endosperm expression. RT-qPCR results showed that VvAGL11 and VvAGL15 expressed highly in grape stone hardening stage and veraison stage. GA3 treatment could significantly down-regulate the expression of them only in the seed region. [Conclusions] VvAGL11 and VvAGL15 were identified as members of the MADS-box gene family. GA3 can inhibit the development of seed by down-regulating the expression of VvAGL11 and VvAGL15.
Keywords: Vitis vinifera L.    VvAGL11    VvAGL15    clone    seed development   

葡萄(Vitis vinifera L.)可用于鲜食、酿酒、制干和制汁, 在市场上很受欢迎。无核是鲜食和制干葡萄的优良性状之一[1], 也是提高葡萄经济价值的首要性状[2], 因此, 生产质优、无公害的无核葡萄是未来葡萄产业发展的趋势。赤霉素(GA3)作为植物体生命活动重要的调节物质, 是诱导葡萄无核的关键激素[3-4]。目前, 对葡萄生理机制方面的研究较多[5-6], 而有关分子机制方面研究较少。

MADS-box(如:MCM1、AGAMOUS、DEFICIENS、SRF4)蛋白家族是植物特有的转录因子, 大量不同植物种类的MADS家族基因已被成功克隆, 它们在生长发育调控和信号转导中发挥着重要作用[7-9]AGL11AGL15基因是MADS家族中的2个成员, 已有研究表明, AGL11和AGL15通过结合基因启动子区的DNA和调控基因表达在植物胚胎发育中发挥重要作用[10-13]。研究发现, 种胚发育是影响果实无核的重要因素[6], 下调葡萄果实中VvAGL11基因的表达, 可以促进无核果实的形成[11]。但目前尚未有葡萄VvAGL11VvAGL15应答GA3信号, 参与果实种胚发育过程的相关报道。因此, 本研究从‘巨峰’葡萄中鉴定到了VvAGL11VvAGL15基因, 分析其序列特征及潜在功能, 并利用荧光定量PCR分析2个基因应答赤霉素信号在果实发育不同时期及不同部位的表达模式, 探讨其在葡萄果实种胚发育过程中的作用, 为深入阐释赤霉素诱导葡萄无核的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 供试材料及取样

试验于2016年5月12日—7月21日在江苏省农博园葡萄园内进行。葡萄园区位于江苏省句容市, 属于亚热带季风气候, 年均气温15.4 ℃, 年降雨量1 150 mm。供试材料为5年生、欧美杂交品种‘巨峰’, 株距为1.0 m, 行距为2.5 m, 双十字V型架, 避雨栽培。

选取生长势、负载量较为一致的‘巨峰’葡萄, 根据前人研究[14-15]和预试验结果, 设置50 mg · L-1赤霉素(GA3)水溶液处理, 清水处理作为对照。每个处理选定6株长势较为一致的植株, 每2株为1个重复, 共设3次重复。于葡萄盛花期(5月12日)进行浸蘸花穗处理, 每小时蘸1次, 每次30 s, 共浸蘸3次。

根据文献[16]报道, 并结合生产经验, 分别采集葡萄幼果期(花后10 d, 5月22日)、硬核期(花后39 d, 6月20日)、转色前1周(花后52 d, 7月3日)及转色期(花后70 d, 7月21日)的果实。分别从每组对照与处理的植株中随机选择4个果穗, 每穗分上、中、下3个部位随机采取若干个果粒。采集后的样品一部分用于生理指标测定及体式显微镜观察; 另一部分分离果实各个部位:果皮、果肉、种子/种子区, 液氮速冻后带回实验室于-70 ℃冰箱中保存备用。

1.2 葡萄果穗和浆果生长情况的观察

采样阶段实时拍照, 并使用直尺测量果穗的长、宽; 采样后使用体式显微镜进行微观拍摄与比对(果实纵剖); 电子天平称取不同时期各处理单果质量; 电显式游标卡尺测量单果横、纵径。

1.3 AGL11AGL15基因序列识别

采用CTAB方法[17]提取葡萄果实RNA, 采用Prime ScriptTM RT-PCR反转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA。以拟南芥AGL11和AGL15的氨基酸序列为信息, 比对葡萄基因组数据库(http://genomes.cribi.unipd.it/grape/blast/blast.phphttp://www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/ggb/vitis/12X/gbrowse/vitis/), 得到预测的cDNA序列。设计特异性引物(表 1)进行PCR扩增, 反应程序为:94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃ 10 min。回收PCR产物, 并连接到pMD19-T载体上, 构建重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 筛选阳性克隆, 送交测序。

表 1 引物序列 Table 1 Sequence of primers in this study
引物Primer 引物序列Primer sequence(5′→3′) 用途Usage
VvAGL11-F/R ATGGGGAGAGGAAAGATCGAGATC/CTACCCAATGCATGGCTTG ORF扩增ORF amplification
VvAGL15-F/R ATGGGACGTGGTAAGATTGAG/TTAACTGCCAGAGTTGTTGGAG ORF扩增ORF amplification
VvAGL11-F/R GCTCGAGAACAGGCTTGAAC/GCCTCTCCACTTCTGCAATC RT-qPCR
VvAGL15-F/R TCCGGCTTGAGCTTAAAAGA/AACCAAACCTCGAAGCTCCT RT-qPCR
VvACTIN-F/R GCTCGCTGTTTTGCAGTTCTAC/AACATAGGTGAGGCCGCACTT RT-qPCR

根据所得cDNA片段, 利用在线软件ORF Finder对其进行ORF分析; 利用NCBI网站的BLASTp程序进行同源序列比对; 采用DNAMAN V6软件分析其氨基酸序列; 采用MEGA 7软件中的邻接法, 进行系统进化树构建, 步长值为1 000;利用NCBI中Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)程序进行蛋白保守域结构预测; 利用在线软件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)进行蛋白质作用元件分析。利用PredictProtein在线软件(http://www.predictprotein.org/)进行蛋白质亚细胞定位预测; 基因的蛋白质二级结构在网站Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)进行预测。

1.4 VvAGL11VvAGL15基因在葡萄果实发育过程中的表达

采用葡萄VvACTIN(XM_002273532)作为内参基因。根据定量PCR引物的设计原则, 利用Primer 3 Input(http://primer3.ut.ee/), 对葡萄VvAGL11VvAGL15基因设计定量PCR引物(表 1)。按照SYBR Premix ExTaqTM试剂盒(宝生物工程有限公司)说明书操作, 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法, 检测基因的相对表达量。扩增体系(20 μL):1 μL cDNA, 上、下游引物各0.4 μL, 10 μL 2×TransStart® Tip Green qPCR SuperMix, 8.2 μL ddH2O。反应程序为:94 ℃ 30 s; 94 ℃ 5 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s, 40个循环。试验设置3次重复。反应结束后分析荧光值变化曲线以及熔解曲线。试验数据采用2-ΔΔCT[18]进行分析。

1.5 葡萄VvAGL11VvAGL15基因的启动子作用元件分析

在Grape Genome Browser(http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)中, 寻找到每一个基因序列上游1 500 bp的片段, 即获得基因的启动子序列, 将其放入PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中, 即可查找到每个基因的启动子所对应的作用元件, 从而预测每一个基因潜在的生物学功能。

1.6 数据处理

所有数据应用方差分析软件进行分析。采用新复极差法进行显著性检验, 采用Excel 2013进行绘图。

2 结果与分析 2.1 赤霉素处理对‘巨峰’葡萄果粒及果穗的影响

图 1可见:赤霉素(GA3)处理的葡萄果实出现无核化的现象。由表 2可见:GA3处理后, ‘巨峰’葡萄果粒纵径以及果穗长度和宽度均显著增加; 果穗轴直径显著增加, 且该现象发生在果实硬核期之前。表明赤霉素处理具有明显加粗穗轴的作用。

图 1 ‘巨峰’葡萄不同生长发育期的横切面 Fig. 1 Longitudinal section of'Kyoho'grape berry at different development stages CK:对照Control; GA3:赤霉素处理Gibberellin treatment.下同。The same as follows.
表 2 ‘巨峰’葡萄果实和果穗生长情况 Table 2 Growth state of'Kyoho'grape berry and clusters
指标Index 05-12 05-22 06-20 07-03 07-21
CK GA3 CK GA3 CK GA3 CK GA3 CK GA3
横径/mm Transverse diameter 5.50a 5.50a 8.67b 10.09a 15.80a 15.80a 20.00a 16.50b 22.60a 18.00b
纵径/mm Longitudinal diameter 6.10a 6.10a 9.52b 12.77a 16.80b 22.40a 21.00b 23.60a 23.80b 25.40a
果穗长度/cm Length of clusters 5.50a 5.50a 7.80b 8.00a 10.50b 11.00a 11.80b 11.90a 12.10b 12.90a
果穗宽度/cm Width of clusters 10.40a 10.40a 13.20b 15.10a 19.20b 22.40a 24.30b 26.30a 25.20b 28.40a
单果质量/g Single weight 0.20a 0.20a 0.50b 0.60a 1.30b 1.40a 1.80a 1.60b 2.20a 1.90b
果穗轴直径/cm Diameter of spike stalk 0.30a 0.30a 0.40b 0.60a 0.55b 0.90a 0.60b 1.10a 0.61b 1.20a
注:不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。下同。
Note:Different small letters indicated significant difference at 0.05 level between treatments. The same as follows.
2.2 葡萄VvAGL11VvAGL15基因序列识别鉴定

以拟南芥的AGL11AGL15基因(登录号:AT4G09960、AT5G13790)cDNA序列为信息探针, 对葡萄基因组网站进行BLAST搜索, 得到2个cDNA序列, 分别是GSVIVT01025945001(VvAGL11)和GSVIVT01001437001(VvAGL15)。基因结构示意图见图 2-A, VvAGL11VvAGL15所在染色体分别为Chr18、Chr13, 开放阅读框(ORF)分别为702和747 bp, 分别编码233和248个氨基酸, 蛋白质相对分子质量分别为56.89×103和60.34×103, 理论等电点均为4.96。在线软件ORF Finder分析发现克隆得到的基因(登录号为MG581423和MG581424)与预测得到的基因序列片段相同, 且均含有MADS-MEF2-like和K-box结构域(图 2-B)。

图 2 VvAGL11VvAGL15基因序列分析 Fig. 2 Sequences analysis of VvAGL11 and VvAGL15 A. GSVIVT01025945001和GSVIVT01001437001基因组序列结构示意图; B.葡萄VvAGL11VvAGL15的ORF及其编码的氨基酸序列。
A. Schematic diagram of GSVIVT01025945001 and GSVIVT01001437001 genome sequences; B. The ORF sequence and amino acid sequence of grape VvAGL11 and VvAGL15.
TAG和TAA为终止密码子。TAG and TAA are the stop codon.
2.3 VvAGL11和VvAGL15蛋白生物信息学分析 2.3.1 氨基酸序列同源性分析

将上述cDNA编码氨基酸序列提交NCBI-BLASTp在线对比结果发现, 在搜索到的22个物种中, 除了木瓜、花生、梨、桃树、芝麻、甜瓜、拟南芥, VvAGL11与其余15个物种同源性在90%以上。而VvAGL15与苦瓜、大豆、木豆、甜瓜、拟南芥的同源性较低, 与其他17个物种的同源性均在80%以上。氨基酸序列比对结果显示, MG581423(VvAGL11)和MG581424(VvAGL15)的氨基酸序列与绝大多数物种的同源性较高。

2.3.2 蛋白序列进化分析

图 3可见:葡萄VvAGL11与柑橘和苦瓜的亲缘关系最近, VvAGL15与苹果和梨的亲缘关系最近, 而两者均与桃和青梅的亲缘关系较远。

图 3 葡萄AGL11和AGL15与其他物种的系统进化分析 Fig. 3 The phylogenetic relationships of AGL11 and AGL15 of grape and other species Me:木薯Manihot esculenta; Hb:巴西橡胶树Hevea brasiliensis; Jc:麻疯树Jatropha curcas; Tc:可可Theobroma cacao; Vv:葡萄Vitis vinifera; Cs:柑橘Citrus sinensis; Gh:陆地棉Gossypium hirsutum; Cp:木瓜Carica papaya; Mc:苦瓜Momordica charantia; Ai:花生Arachis ipaensis; Gm:大豆Glycine max; Cc:木豆Cajanus cajan; Fa:草莓Fragaria× ananassa; Pb:梨Pyrus× bretschneideri; Pp:桃Prunus persica; Pm:青梅Prunus mume; Si:芝麻Sesamum indicum; Jr:核桃Juglans regia; Cm:甜瓜Cucumis melo; Md:苹果Malus domestica; At:拟南芥Arabidopsis thaliana; Rc:蓖麻Ricinus communis.下同。The same as follows.
2.3.3 VvAGL11和VvAGL15功能结构域分析

通过蛋白质保守结构域分析, 结果(图 4)表明葡萄AGL11和AGL15与拟南芥等植物保守结构域相同, 均含有MADS-MEF2-like结构域和K-box家族保守结构。根据该结果可以推测, 克隆得到的MG581423和MG581424即为葡萄VvAGL11VvAGL15序列。

图 4 葡萄AGL11、AGL15与其他植物保守结构域分析 Fig. 4 Conserved domain analysis of AGL11 and AGL15 from grape and other species
2.3.4 VvAGL11和VvAGL15氨基酸序列与其他物种同源蛋白的保守结构的作用元件分析

图 5可知:在搜索到的10个作用元件中, VvAGL11有4个作用元件(motif 1、motif 2、motif 6、motif 10)在所比对物种中完全保守; 而VvAGL15有5个作用元件(motif 1、motif 4、motif 6、motif 7、motif 9)在所比对的物种中完全保守。这表明葡萄VvAGL11和VvAGL15的氨基酸序列与其他植物相比, 保守性较高。该结果进一步证明, 克隆得到的基因即为葡萄VvAGL11VvAGL15序列。

图 5 葡萄VvAGL11和VvAGL15与其他植物保守结构分析 Fig. 5 Structural analysis of conserved protein of AGL11 and AGL15 from grape and other species
2.4 葡萄VvAGL11和VvAGL15蛋白结构及亚细胞定位预测

对葡萄VvAGL11和VvAGL15蛋白质二级结构(图 6)分析发现, 其蛋白二级结构均有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲3种形式组成, 且均以α-螺旋和无规则卷曲为主, β-折叠结构最少(图 6-A)。亚细胞定位预测显示:VvAGL11、VvAGL15均定位于细胞核中(图 6-B)。VvAGL11和VvAGL15蛋白结构及亚细胞定位的相似性预示着二者蛋白功能的相似性。

图 6 VvAGL11和VvAGL15蛋白质二级结构图和亚细胞定位预测 Fig. 6 The secondary structures and subcellular localization prediction of VvAGL11 and VvAGL15 protein
2.5 VvAGL11VvAGL15基因启动子顺式作用元件分析

表 3可见:VvAGL11VvAGL15的启动子元件可分为5个类型, 分别为光响应相关元件:ACE、AE-box、Box 4、Box Ⅰ、G-Box、GA-motif、GAG-motif、Ⅰ-box、LAMP-element、Sp1、TCCC-motif、GATA-motif等; 激素相关响应元件:ABRE、ERE、GARE-motif、P-box、TATC-box、TCA-element、TGACG-motif等; 胚乳表达响应元件:Skn-1_motif; 胁迫相关响应元件:ARE、Box-W1、HSE、TC-rich repeats等; 周期节律相关的元件:circadian等。其中光响应相关元件数量最多, 胁迫相关和激素相关响应元件的数量次之, 周期节律相关响应元件的数量最少。

表 3 VvAGL11VvAGL15基因启动子顺式作用元件分类及功能数量分析 Table 3 Promoter motif elements classification and function qualification analysis of VvAGL11 and VvAGL15
基因
Gene
光响应相关元件
Light-relatedelements
胁迫相关响应元件
Stress responsiveelements
胚乳表达响应元件
Endospermexpressionelements
周期节律相关元件
Circadian-relatedelements
激素相关响应元件
Hormone-related elements
脱落酸
Abscisic acid
乙烯
Ethylene
赤霉素
Gibberellin
水杨酸
Salicylic acid
茉莉酸甲酯
MeJA
VvAGL11 20 7 4 2 2 1 3 1 0
VvAGL15 21 4 5 1 0 0 2 1 2

研究还发现VvAGL11VvAGL15的激素响应元件中均含有赤霉素相关响应元件, 说明这2个基因可能响应赤霉素信号, 从而在赤霉素信号途径中发挥重要作用; 此外, 在2个基因启动子作用元件中也发现了与胚乳发育相关元件, 表明葡萄VvAGL11VvAGL15基因与胚乳的形成等生命活动密切相关, 且进一步表明2个基因功能的相似性。

2.6 VvAGL11VvAGL15应答GA3信号在葡萄果实胚发育过程中的表达分析

RT-qPCR结果(图 7图 8)表明, 葡萄VvAGL11VvAGL15在果实发育不同时期不同组织中的表达具有时空特异性。VvAGL11VvAGL15基因在果实硬核期和转色前1周以及VvAGL15基因在转色期时, 其种子内表达量均较高, 其余部位较低。表明VvAGL11VvAGL15基因均在果实种子区发挥着重要的作用。在果皮和果肉中, GA3处理能够上调VvAGL11VvAGL15基因在果实整个发育时期中的表达; 而在种子中, GA3处理下调其在整个发育时期的表达。结合GA3在葡萄果实种子发育中的作用, 可以推测VvAGL11VvAGL15应答GA3信号, 降低自身在葡萄种子区的表达, 从而影响种胚的正常发育, 形成无核果实。

图 7 ‘巨峰’葡萄果实VvAGL11基因的表达 Fig. 7 Expression level of VvAGL11 gene in'Kyoho'gape berry
图 8 ‘巨峰’葡萄果实VvAGL15基因的表达 Fig. 8 Expression level of VvAGL15 gene in'Kyoho'gape berry
3 讨论

赤霉素是植物生长发育过程中的主要激素, 也是开花、坐果及果实发育所必需的激素。赤霉素诱导葡萄无核化技术目前已被广泛应用于葡萄生产, 产生了很高的经济效益。生产上主要通过外源赤霉素来诱导葡萄无核化, 但到目前为止, 其分子机制尚不太清楚。因此, 探索植物应答赤霉素信号的分子调控机制对于开展无核葡萄分子设计育种具有重要意义。

MADS-box基因编码的蛋白质是一类数目庞大的转录因子家族, 在植物花的形态建成、胚珠、种子、叶片和根的发育过程中起到重要的调控作用[19-22]。本研究对MADS-box基因家族VvAGL11和VvAGL15蛋白序列分析表明, 其在不同物种中序列的同源性较高, 且均含有MADS-MEF2-like和K-box结构域, 与棉花[23]、苹果[24]、龙眼[25]等物种中克隆到的AGL11和AGL15的结构域相同, 且它们可能参与植物的胚发育进程[26]。但是, 植物胚发育是一个受多基因调控的复杂过程, 如拟南芥AtAGL15在胚胎发育中表达量达到高峰, 并且与其下游靶控基因DTA1 (downstream target of AGL151 )共同参与拟南芥胚胎发育的赤霉素调控途径[12]。抑制番茄SlAGL11 基因的表达能够产生无籽果实[10]。本研究中, VvAGL11VvAGL15在果实生长发育期的种子区表达量较高, 而GA3能够显著抑制其在种子区的表达量。此外, VvAGL11VvAGL15启动子作用元件中含有赤霉素响应元件及胚乳发育响应元件, 表明这2个基因可能响应赤霉素信号, 同时与胚乳发育相关。而前人研究发现胚乳停止发育可导致葡萄胚的败育[27], 结合GA3诱导葡萄无核化的现象, 我们推测, GA3可能通过下调其表达从而抑制其胚乳的正常发育, 形成无核果实, 这与番茄研究的结论一致[10], 但还有待进一步的生物学功能验证。

参考文献(References)
[1]
陈俊伟, 谢鸣, 吴江. 遗传工程无籽果实原理及其研究进展[J]. 浙江农业学报, 2003, 15(6): 365-371.
Chen J W, Xie M, Wu J. The principle of breeding of seedless fruit by genetic engineering and its study advance[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2003, 15(6): 365-371 (in Chinese with English abstract). DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2003.06.010
[2]
Yao J L, Dong Y H, Bret A M. Parthenocarpic apple fruit production conferred by transposon insertion mutations in a MADS-box transcription factor[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(3): 1306-1311. DOI:10.1073/pnas.98.3.1306
[3]
Singh D P, Jermakow A W, Swain S M. Gibberellins are required for seed development and pollen tube growth in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2002, 14(12): 3133-3147. DOI:10.1105/tpc.003046
[4]
崔梦杰, 王晨, 张文颖, 等. 无核葡萄研究进展[J]. 植物生理学报, 2017, 53(3): 317-330.
Cui M J, Wang C, Zhang W Y, et al. Progress in the study of seedless grapes[J]. Plant Physiology Journal, 2017, 53(3): 317-330 (in Chinese with English abstract).
[5]
孙其宝, 俞飞飞, 孙俊. 葡萄无核化研究进展[J]. 安徽农业科学, 2004, 32(2): 360-362.
Sun Q B, Yu F F, Sun J. Progress in the study of grapevine berry seedless[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2004, 32(2): 360-362 (in Chinese with English abstract). DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2004.02.090
[6]
肖祥希, 李明, 邱栋梁. 果实无核机理研究进展[J]. 经济林研究, 2009, 27(2): 104-110.
Xiao X X, Li M, Qiu D L. Research progress of seedless mechanism of fruits[J]. Nonwood Forest Research, 2009, 27(2): 104-110 (in Chinese with English abstract). DOI:10.3969/j.issn.1003-8981.2009.02.025
[7]
Alvarezbuylla E R, Liljegren S J, Pelaz S, et al. MADS-box gene evolution beyond flowers:expression in pollen, endosperm, guard cells, roots and trichomes[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2010, 24(4): 457-466.
[8]
Battaglia R, Brambilla V, Colombo L, et al. Functional analysis of MADS-box genes controlling ovule development in Arabidopsis using the ethanol-inducible alc gene-expression system[J]. Mechanisms of Development, 2006, 123(4): 267-276. DOI:10.1016/j.mod.2006.01.002
[9]
Becker A, Theissen G. The major clades of MADS-box genes and their role in the development and evolution of flowering plants[J]. Molecular Phylogenetics & Evolution, 2003, 29(3): 464-489.
[10]
Huang B, Routaboul J M, Liu M, et al. Overexpression of the class D MADS-box gene Sl-AGL11 impacts fleshy tissue differentiation and structure in tomato fruits[J]. Journal of Experimental Botany, 2017, 68(17): 4869-4884. DOI:10.1093/jxb/erx303
[11]
Ocarez N, Mejía N. Suppression of the D-class MADS-box AGL11 gene triggers seedlessness in fleshy fruits[J]. Plant Cell Reports, 2016, 35(1): 239. DOI:10.1007/s00299-015-1882-x
[12]
Wang H, Caruso L V, Downie A B, et al. The Embryo MADS domain protein AGAMOUS-Like 15 directly regulates expression of a gene encoding an enzyme involved in gibberellin metabolism[J]. Plant Cell, 2004, 16(5): 1206-1219. DOI:10.1105/tpc.021261
[13]
Zheng Y, Perry S E. Global identification of targets of the Arabidopsis MADS domain protein AGAMOUS-Like 15[J]. The Plant Cell, 2009, 21(9): 2563. DOI:10.1105/tpc.109.068890
[14]
王文举, 马治国. 赤霉素和链霉素及促生灵促进巨峰葡萄果粒增大和无核的试验[J]. 落叶果树, 2003, 35(4): 43-44.
Wang W J, Ma Z G. Test of gibberellin, streptomycin and tomatotone on promoting Kyoho grape berry enlargement and seedless[J]. Deciduous Fruits, 2003, 35(4): 43-44 (in Chinese with English abstract). DOI:10.3969/j.issn.1002-2910.2003.04.019
[15]
刘佳, 刘晓, 陈建. 四川地区赤霉素和链霉素处理对巨峰葡萄无核化及果实发育的影响[J]. 西南农业学报, 2011, 24(1): 220-224.
Liu J, Liu X, Chen J. Effect of GA3 and SM treatment on inducing seedless and berry growth of Kyoho grape in Sichuan area[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2011, 24(1): 220-224 (in Chinese with English abstract). DOI:10.3969/j.issn.1001-4829.2011.01.049
[16]
陈发河, 蔡慧农, 冯作山, 等. 葡萄浆果发育过程中激素水平的变化[J]. 植物生理与分子生物学学报, 2002, 28(5): 391-395.
Chen F H, Cai H N, Feng Z S, et al. Changes of hormone levels during the development of grape berries[J]. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 2002, 28(5): 391-395 (in Chinese with English abstract).
[17]
张彦苹, 王晨, 于华平, 等. 适于葡萄不同组织RNA提取方法的筛选[J]. 西北农业学报, 2010, 19(11): 135-140.
Zhang Y P, Wang C, Yu H P, et al. Screening of RNA extraction methods for various grapevine organs and tissues[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica, 2010, 19(11): 135-140 (in Chinese with English abstract).
[18]
Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408. DOI:10.1006/meth.2001.1262
[19]
Riechmann J L, Meyerowitz E M. Determination of floral organ identity by Arabidopsis MADS domain homeotic proteins AP1, AP3, PI, and AG is independent of their DNA-binding specificity[J]. Molecular Biology of the Cell, 1997, 8(7): 1243-1259. DOI:10.1091/mbc.8.7.1243
[20]
Folter S, Shchennikova A V, Franken J, et al. A Bsister MADS-box gene involved in ovule and seed development in petunia and Arabidopsis[J]. The Plant Journal, 2006, 47(6): 934-946. DOI:10.1111/tpj.2006.47.issue-6
[21]
Deng W, Chen G, Peng F, et al. Transparent testa16 plays multiple roles in plant development and is involved in lipid synthesis and embryo development in canola[J]. Plant Physiology, 2012, 160(2): 978-989. DOI:10.1104/pp.112.198713
[22]
Xu W, Fiume E, Coen O, et al. Endosperm and nucellus develop antagonistically in Arabidopsis seeds[J]. The Plant Cell, 2016, 28(6): 1343-1360. DOI:10.1105/tpc.16.00041
[23]
Yang Z, Li C, Wang Y, et al. GhAGL 15s , preferentially expressed during somatic embryogenesis, promote embryogenic callus formation in cotton(Gossypium hirsutum L.)[J]. Molecular Genetics & Genomics, 2014, 289(5): 873-883.
[24]
董庆龙, 冀志蕊, 迟福梅, 等. 苹果MADS-box转录因子的生物信息学及其在不同组织中的表达[J]. 中国农业科学, 2014, 47(6): 1151-1161.
Dong Q L, Ji Z R, Chi F M, et al. Bioinformatics of the MADS-Box transcription factor and their expression in different apple tissues[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(6): 1151-1161 (in Chinese with English abstract). DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.012
[25]
蔡英卿.龙眼体胚发生过程中SERK等胚性相关基因的克隆与表达分析[D].福州: 福建农林大学, 2011.
Cai Y Q. Cloning and epression of SERK and sme other somatic embryogenesis-related genes during somatic embryogenesis in Dimocarpus longan Lour[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2011(in Chinese with English abstract).
[26]
Parenicová L, De S F, Kieffer M, et al. Molecular and phylogenetic analyses of the complete MADS-box transcription factor family in Arabidopsis:new openings to the MADS world[J]. The Plant Cell, 2003, 15(7): 1538-1551. DOI:10.1105/tpc.011544
[27]
王飞.葡萄无核品种及其杂种胚败育机理与胚挽救技术研究[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2002.
Wang F. Mechanism of embryo abortion in stonespermic seedless grape and embryo rescue with seedless grape[D]. Yangling: Northwest A &F University, 2002(in Chinese with English abstract).