南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (2): 253-260   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201806006
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童月霞, 胡晓璇, 程宗明, 仲岩
TONG Yuexia, HU Xiaoxuan, CHENG Zongming, ZHONG Yan
苹果NBS-encoding基因对斑点落叶病菌侵染的表达响应
Expression of apple NBS-encoding genes in response to the infection of Alternaria blotch pathogen
南京农业大学学报, 2019, 42(2): 253-260
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(2): 253-260.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201806006

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收稿日期: 2018-06-08
苹果NBS-encoding基因对斑点落叶病菌侵染的表达响应
童月霞 , 胡晓璇 , 程宗明 , 仲岩     
南京农业大学园艺学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在分析苹果差异表达NBS-encoding基因的特征,挖掘在苹果斑点落叶病菌侵染过程中的潜在响应基因。[方法]通过苹果斑点落叶病菌侵染‘红星’后的RNA-seq数据筛选出差异表达的NBS-encoding基因,并利用ProtParam、Pfam、SMART等网站分析了其理化性质;利用R studio软件构建表达热图并分析其表达模式;利用FastTree 2软件构建苹果NBS-encoding基因家族的系统进化树,并利用MEGA 6.0软件计算差异表达的NBS-encoding基因所在系统进化支的Ka/Ks值,研究NBS-encoding基因在进化过程中受到的选择压力;利用Cytoscape 3.0软件构建共表达网络图,分析NBS-encoding基因之间的关联性。[结果]共筛选得到了19个差异表达NBS-encoding基因。表达模式分析表明,有3个基因(登录号为MDP0000259862、MDP0000304378和MDP0000292810)可能在响应苹果斑点落叶病的过程中起了关键作用。19个差异表达基因分布在系统进化树的15个进化支中,其中进化支10、12、14、15的平均Ka/Ks值均大于1,说明这些进化支中的基因受到正选择压力的作用,尤其是登录号为MDP0000210357、MDP0000751628、MDP0000147704和MDP0000372663的基因;而其余15个NBS-encoding基因的平均Ka/Ks值均小于1,说明它们受到纯化选择的作用。此外,有16个基因处于同一个共表达网络中,登录号为MDP0000210357、MDP0000240537和MDP0000291205的基因扮演着重要的角色。[结论]19个苹果NBS-encoding基因参与苹果斑点落叶病菌侵染后的响应过程,其中登录号为MDP0000259862、MDP0000304378、MDP0000292810、MDP0000210357、MDP0000240537和MDP0000291205的基因可作为候选基因进行苹果抗病品种选育。
关键词苹果斑点落叶病   NBS-encoding基因   表达模式   选择压力   共表达网络   
Expression of apple NBS-encoding genes in response to the infection of Alternaria blotch pathogen
TONG Yuexia, HU Xiaoxuan, CHENG Zongming, ZHONG Yan    
College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] This paper aimed to analyze the characters of differentially expressed NBS-encoding genes in 'Starking' and to explore the potential functional genes in the process of apple Alternaria blotch pathogen infection. [Methods] In this report, the differentially expressed NBS-encoding genes were obtained by screening RNA-seq data of 'Starking' infected by apple Alternaria blotch pathogen. In addition, the physico-chemical properties of these genes were analyzed using the websites of ProtParam, Pfam, SMART, etc.. The expression heat map was built by R studio software to analyze their expression patterns. The phylogenetic tree of apple NBS-encoding gene family was constructed by FastTree 2 software. The Ka/Ks ratios of these NBS-encoding genes were calculated by using MEGA 6.0 to study the selection pressure during the evolution process. At the same time, the co-expression network of the NBS-encoding genes was constructed by Cytoscape software. [Results] A total of 19 differentially expressed NBS-encoding genes were obtained based on the RNA-seq data. According to the expression profiles of these genes, we found that three genes(GenBank accession No. MDP0000259862, MDP0000304378 and MDP0000292810) might play a crucial role in response to the infection of apple Alternaria blotch pathogen. In addition, it was also found that the 19 NBS-encoding genes were distributed in 15 clades in the phylogenetic tree of all NBS-encoding genes. The average Ka/Ks ratios of clade 10, 12, 14, and 15 were all greater than 1, indicating that the genes of these clades were subjected to positive selection, especially genes of accession No. MDP0000210357, MDP0000751628, MDP0000147704 and MDP0000372663. However, the other 15 NBS-encoding genes with Ka/Ks values less than 1 were under purifying selection. Besides, there were 16 NBS-encoding genes in the same one co-expression network, in which genes of accession No. MDP0000210357, MDP0000240537 and MDP0000291205 played important parts in the co-expression network. [Conclusions] There were 19 apple NBS-encoding genes involved in response to the infection of apple Alternaria blotch pathogen, in which genes of accession No.MDP0000259862, MDP0000304378, MDP0000292810, MDP0000210357, MDP0000240537 and MDP0000291205 could be used as candidate genes in apple breeding resistant varieties.
Keywords: apple Alternaria blotch    NBS-encoding gene    expression pattern    selection pressure    co-expression network   

苹果(Malus domestica)是世界上栽培最广、产量最大的温带水果, 其果实具有丰富的营养成分。但在苹果生长过程中容易受到各种病原微生物(真菌、细菌、病毒等)及害虫的侵害, 造成树势减弱、果实减产等诸多问题, 从而给生产上带来巨大的经济损失[1]

苹果斑点落叶病(apple Alternaria blotch)又称褐纹病, 是由苹果链格孢菌(Alternaria alternaria f. sp. mali)侵染而引起的一种世界性分布的气传病害, 同时也是危害亚洲苹果产区最为严重的病害之一[2]。苹果斑点落叶病主要危害叶片、新梢及果实。20世纪70年代后期, 我国开始有关于苹果斑点落叶病的报道, 目前该病已成为我国苹果主产区三大病害之一[3]。此外, 国内外对于该病的研究集中于发病症状、防治方法、病原菌鉴定和种质资源评价等方面[4]

植物在抵御病原物侵染过程中进化出一系列防卫机制, 其中最关键的是抗病基因介导的抗病性。DeYoung等[5]研究认为最重要的抗病基因是具有核苷酸结合位点结构域(nucleotide-binding site, NBS)和富含亮氨酸重复结构域(leucine rich repeat, LRR)的一类基因, 即NBS-LRR类抗病基因, 它们通过编码抗病蛋白从而抵抗病原物的侵害。NBS-LRR类基因是分布最广和数量最大的一类抗性基因家族。根据N端结构域的不同, NBS-LRR蛋白可分为2个亚类:一类是TIR-NBS-LRR(TNL)蛋白, 其N末端具有白细胞介素受体(Toll/Interleukin-1 receptor)同源结构域; 另一类是non-TIR-NBS-LRR(non-TNL)蛋白, 其N端具有螺旋卷曲结构域(CC)或其他结构域[6]。近年来, 已经有相关研究报道NBS基因家族, 如拟南芥[7]等; NBS-encoding基因与植物抗病性间的关系, 如马铃薯晚疫病[8]和水稻稻瘟病[9]等; 果树NBS基因, 如刺梨抗白粉病相关NBS基因[10]等。但是, 由于苹果复杂的遗传背景[11], 在抗病基因方面的研究尚未取得实质性的进展。自从Baldi等[12]初次在苹果基因组中鉴定了30个NBS-LRR类的同源序列, 苹果抗病性与NBS-LRR基因的相关研究才逐渐展开。Calenge等[13]根据苹果NBS基因家族序列鉴定出了23个与抗病性相关的NBS基因。目前, 已发现苹果火疫病[14]和白粉病[15]的抗性基因位点均包含有NBS-LRR基因。

本研究根据苹果斑点落叶病菌侵染‘红星’后的转录组数据(RNA-seq), 筛选得出差异表达的NBS-encoding基因并对其进行分析, 包括基因的理化性质、分类、表达模式及共表达网络的构建, 并根据苹果NBS-encoding基因家族系统进化树计算差异表达的NBS-encoding基因的Ka/Ks值, 旨在为苹果NBS-encoding基因的抗病功能研究和苹果抗病分子育种工作提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 数据来源

数据来源为苹果品种‘红星’接种苹果斑点落叶病菌后的RNA-seq数据[16]

1.2 苹果NBS-encoding差异表达基因的筛选及其理化性质分析

根据RNA-seq数据筛选差异表达的NBS-encoding基因。分别以时间点0、12、18、36和72 h为对照, 以错误发现率(FDR)≤0.001为阈值[17](FDR值越低说明基因表达差异越显著), 筛选出各个样本间的差异表达基因(differentially expressed genes, DEG), 并对差异倍数(fold change, FC)(log2 FC≥2)进行评估。

用ProtParam(https://web.expasy.org/tools/protparam.html)分析各个差异表达的NBS-encoding蛋白的理化性质, 包括氨基酸数目、预测分子质量、等电点、对脂溶指数和总平均亲水性。利用Pfam(http://pfam.janelia.org/)分析验证所有NBS-encoding基因的NB-ARC结构域与LRR基序的存在, 并采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)蛋白基序分析提高LRR鉴定的准确性。最后使用Pfam和COILS(http://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html)验证NBS-encoding基因是否编码TIR和CC等基序, 从而对差异表达的NBS-encoding基因进行分类。

1.3 差异表达NBS-encoding基因的表达分析及其基因家族系统进化树的构建

差异表达NBS-encoding基因的表达水平用log2RPKM值来衡量[16](reads per kilobase of exon model per million mapped reads, RPKM, 即每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数)。利用R studio软件绘制表达量热图(heatmap)。

利用FastTree 2软件对苹果NBS-encoding基因家族[18]的NBS结构域序列构建系统进化树。在系统进化树中, 找到差异表达NBS-encoding基因所在的系统进化支, 并使用MEGA 6.0对各个进化支重新构建系统进化树。

1.4 同义突变率(Ks)和非同义突变率(Ka)的计算

使用MEGA 6.0软件计算系统进化支中各个基因的同义突变率(Ks)、非同义突变率(Ka)和Ka/Ks[19]。若Ka/Ks < 1, 说明基因受到负选择压力的作用; 若Ka/Ks=1, 说明基因受到中性选择的作用; 若Ka/Ks>1, 说明基因受到正选择压力的作用[20]

1.5 差异表达NBS-encoding基因的共表达网络构建

根据RPKM值, 使用IBM SPSS Statistics 19软件计算差异表达NBS-encoding基因的PCC(Pearson correlation coefficient, 皮尔森相关系数)值, 选取PCC>0.8且P < 0.05的基因对, 并使用Cytoscape 3.0软件构建其共表达网络图[21]

2 结果与分析 2.1 苹果NBS-encoding差异表达基因的确定及其理化性质分析

表 1可见:根据RNA-seq数据共筛选出19个差异表达的NBS-encoding基因, 分为5种类型, 分别为TIR-NBS-LRR、CC-NBS-LRR、X-NBS-LRR、CC-NBS和X-NBS。蛋白质预测结果显示, 基因登录号为MDP0000751628所编码的氨基酸数量最少, 只有181个, 其蛋白相对分子质量为20 084.25;基因登录号为MDP0000291205所编码的氨基酸数量最多, 为1 216个, 其蛋白相对分子质量为137 737.88。结构域预测表明除了登录号为MDP0000259862、MDP0000295195、MDP0000751628和MDP0000640906的基因外, 其他NBS-encoding基因都属于NBS-LRR基因家族。NBS-encoding基因所编码的蛋白理论等电点为5.11~9.02, 其中有3个NBS-encoding蛋白(基因登录号为MDP0000259862、MDP0000751628和MDP0000240537所编码的蛋白)为碱性蛋白, 其他均为酸性蛋白。NBS-encoding蛋白的对脂溶指数为86.02~105.26。NBS-encoding蛋白的总平均亲水性为-0.456~0.445, 其中只有基因登录号为MDP0000372663所编码的蛋白为疏水蛋白, 其他均为亲水蛋白。

表 1 19个苹果差异表达NBS-encoding基因的理化性质 Table 1 Physico-chemical properties of 19 differentially expressed apple NBS-encoding genes
基因登录号
Gene accession No.
类型
Type
氨基酸数量
Number ofamino acids
相对分子质量
Relative molecularweight
理论等电点
Theoretical pI
对脂溶指数
Aliphatic index
总平均亲水性
Grand average ofhydropathicity(GRAVY)
MDP0000304378 X-NBS-LRR 1 038 118 167.72 6.43 98.66 -0.221
MDP0000292810* X-NBS-LRR 947 106 956.85 5.91 102.98 -0.056
MDP0000259862* CC-NBS 429 48 363.98 7.66 101.72 -0.157
MDP0000710999* TIR-NBS-LRR 782 88 704.00 5.72 103.18 -0.172
MDP0000127009* X-NBS-LRR 1 154 130 039.94 5.78 100.39 -0.189
MDP0000641906* CC-NBS-LRR 1 163 132 061.39 6.24 98.99 -0.208
MDP0000144730 X-NBS-LRR 908 101 846.30 5.78 97.48 -0.145
MDP0000174796 CC-NBS-LRR 864 97 729.09 5.81 96.46 -0.256
MDP0000310092 CC-NBS-LRR 831 94 025.90 6.10 97.65 -0.128
MDP0000295195 CC-NBS 298 34 225.59 5.73 95.87 -0.456
MDP0000751628 X-NBS 181 20 084.25 9.02 93.20 -0.322
MDP0000306942 CC-NBS-LRR 1 132 128 950.90 6.31 94.15 -0.269
MDP0000210357 X-NBS-LRR 444 50 535.41 5.11 104.71 -0.017
MDP0000640906 X-NBS 330 37 048.29 5.30 95.18 -0.098
MDP0000372663 TIR-NBS-LRR 943 107 776.08 5.99 86.02 0.445
MDP0000147704 X-NBS-LRR 723 81 957.09 6.07 92.57 -0.386
MDP0000291205 X-NBS-LRR 1 216 137 737.88 5.98 105.26 -0.036
MDP0000240537 X-NBS-LRR 572 64 654.48 7.10 102.94 -0.128
MDP0000162375 X-NBS-LRR 808 91 595.03 6.71 103.42 -0.093
注:*数据来源于文献[22]。Data are derived from reference [22].
2.2 差异表达NBS-encoding基因的表达分析

图 1可见:根据表达模式的变化情况, 可将这19个基因分为3种表达模式:第1种, 在侵染初期的表达量均处于较高水平且一直保持上升趋势, 包括7个基因(登录号为MDP0000259862、MDP0000304378、MDP0000292810、MDP0000710999、MDP0000127009、MDP0000295195和MDP0000751628), 其中登录号为MDP0000259862、MDP0000304378和MDP0000292810的基因在后期持续高表达; 第2种, 表达量持续上调, 但一直处于低表达量水平, 包括8个基因(登录号为MDP0000210357、MDP0000640906、MDP0000162375、MDP0000291205、MDP0000147704、MDP0000240537、MDP0000306942和MDP0000372663);第3种, 表达量处于中间水平, 包括4个基因(登录号为MDP0000144730、MDP0000641906、MDP0000174796和MDP0000310092), 其中除了登录号为MDP0000641906的基因, 其他3个基因在前期表达量上调, 后期均有下调。

图 1 差异表达NBS-encoding基因在‘红星’接种苹果斑点落叶病菌过程中的表达热图 Fig. 1 Expression heatmap of differentially expressed NBS-encoding genes during the infection in'Starking'with apple Alternaria blotch pathogen RPKM:每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数Reads per kilobase of exon model per million mapped reads.
2.3 非同义突变率与同义突变率的比值分析

根据苹果NBS-encoding基因家族系统进化树, 将差异表达的NBS-encoding基因定位到了15个进化支中, 并对各进化支重新构建系统进化树(图 2), 最后计算出每个进化支中NBS-encoding基因的Ka/Ks值。进化支10、12、14和15的平均Ka/Ks值均大于1, 其中包括登录号为MDP0000210357、MDP0000751628、MDP0000147704和MDP0000372663的基因, 说明这些基因在进化过程中受到正选择压力的作用。进化支15的平均Ka/Ks值最大, 达到了2.24。而其余11个进化支的平均Ka/Ks值均小于1, 其中包括其他15个NBS-encoding基因, 表明这些进化支中的基因在进化过程中受到纯化选择的作用。

图 2 19个差异表达NBS-encoding基因的系统进化树 Fig. 2 Clades of 19 differentially expressed NBS-encoding genes 1)方框内基因为19个差异表达NBS-encoding基因; 2)括号内数值表示各进化支中基因的平均Ka/Ks值; 3)由于系统进化支8中Ka/Ks值无效, 因此没有标注。 1)The genes in the box are 19 differentially expressed NBS-encoding genes; 2)Bracketed values are average Ka/Ks ratios between the genes in each clade; 3)The Ka/Ks ratio of clade 8 is not shown because of the invalid ratio.
2.4 差异表达NBS-encoding基因的共表达网络预测

图 3可见:除了登录号为MDP0000310092、MDP0000306942和MDP0000640906的基因外, 其余16个基因之间存在一定的关联性。共表达网络图由3个不同的模块构成。第1个模块里共包含10个节点(登录号为MDP0000174796、MDP0000162375、MDP0000147704、MDP0000641906、MDP0000240537、MDP0000259862、MDP0000291205、MDP0000127009、MDP0000292810和MDP0000210357的基因)和34条边。第2个模块里包含3个节点(登录号为MDP0000372663、MDP0000295195和MDP0000304378的基因)和3条边。第3个模块中含有3个节点(登录号为MDP0000144730、MDP0000751628和MDP0000710999的基因)和2条边。每个节点都有不同数量的边, 从1个(登录号为MDP0000144730和MDP0000710999的基因)到9个(登录号为MDP0000210357的基因)不等。此外, 登录号为MDP0000210357的基因所在节点最大; 登录号为MDP0000240537和MDP0000291205的基因所在节点次之; 而登录号为MDP0000144730和MDP0000710999的基因所在节点最小。

图 3 19个差异表达NBS-encoding基因的共表达网络 Fig. 3 Co-expression network of 19 differentially expressed NBS-encoding genes 节点代表基因; 节点大小代表渡值的大小; 节点之间的边缘线代表基因共表达间的相关性。 Nodes represent genes, and node sizes represent the magnitude of the degree value. Edge lines among nodes represent the correlation between gene co-expression.
3 讨论

NBS类基因是植物中最普遍存在的抗病基因, 在植物抵御各种病原物侵染过程中发挥着重要作用。虽然关于NBS基因在抗病方面的研究已有不少报道, 如白粉病[15]、火疫病[14]等, 但对于苹果斑点落叶病的研究还鲜有报道。本研究根据RNA-seq数据共筛选出19个苹果差异表达NBS-encoding基因, 并对其理化性质以及表达模式进行分析, 同时构建共表达网络, 可为进一步探究苹果NBS-encoding基因家族在苹果斑点落叶病方面的功能提供理论依据, 同时为苹果的分子育种提供一定参考。

本研究根据苹果差异表达NBS-encoding基因在不同时间的表达热图可将这些基因分为3个表达模式。其中第1种表达模式中有3个基因(登录号为MDP0000259862、MDP0000304378和MDP0000292810), 其表达量在侵染后期一直保持高水平且不断上调, 可以在今后进行NBS-encoding基因响应苹果斑点落叶病的功能验证时, 对这3个基因予以重视。部分NBS-encoding基因在侵染过程中表达量发生不同程度变化, 说明它们可能参与响应苹果斑点落叶病的过程。根据宋霄等[1]的研究结果, MdNBS基因在抗病机制方面可能与SA和MeJA信号途径有关, 苹果轮纹病病原菌可诱导MdNBS-LRR基因的上调表达, 进一步说明MdNBS-LRR参与了苹果抗病防御反应。同样地, Arya等[23]的研究发现, 无论是苹果花叶病毒还是苹草缢管蚜(Rhopalosiphum insertum)侵染苹果叶片后, MdNBS70、MdNBS236和MdNBS275等基因的表达量均显著上调, 表明这些基因在植物抗病响应过程中具有一定的作用。此外, 在抗黄曲霉花生的果实组织中也发现了高表达的NBS-LRR基因(PnAG3)[24]

我们对选择压力研究后发现, 登录号为MDP0000210357、MDP0000751628、MDP0000147704和MDP0000372663的基因在进化过程中受到了正选择压力的作用, 而其余15个NBS-encoding基因受到纯化选择的作用。Li等[25]研究表明猕猴桃NBS-encoding基因在进化过程中大多数受到了纯化选择的作用, 但仍有部分基因受到正选择压力的作用; 这意味着纯化选择对于NBS-encoding基因的进化起着重要的作用。Zhong等[6, 26]发现, 5个蔷薇科物种(草莓、苹果、梨、桃和梅)及6个不同草莓品种中大部分的NBS-LRR基因都受到了纯化选择的作用。此外, Mondragón-Palomino等[27]也已证明拟南芥中植物抗病基因(NBS-LRR)基本都受到正选择的作用。由此说明, 正选择作用在植物NBS-encoding基因进化的过程中起着重要的作用。

共表达分析能识别和发现一些新的调节因子或未知的相互关系。处于共表达网络里同一个模块的基因对, 其表达模式相似, 如登录号为MDP0000259862和MDP0000292810的基因。Yin等[28]研究发现, 在不同组织以及不同年龄和不同基因型的根中, 吉林人参的NBS-encoding基因都是共同表达的, 并形成一个单一的共表达网络, 其中归类为应激和细胞死亡功能的NBS-encoding基因可能在植物对病原体的防御中发挥作用。Kugler等[29]研究表明, 处于共表达网络同一模块中的小麦枯萎病抗性基因具有相似的表达模式, 包括NBS-LRR基因、WRKY基因和UGT基因。此外, 也有研究通过对霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)侵染黄瓜[30]后的表达谱分析表明, 处于同一个共表达网络中的基因对病原体的反应是协同作用的。由此我们推测, 本文中处于共表达网络同一模块的NBS-encoding基因, 在一定程度上会共同表达以响应苹果斑点落叶病菌的侵染。

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