南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (2): 236-245   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201803041
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曾爱松, 李家仪, 李英, 宋立晓, 侯喜林, 严继勇
ZENG Aisong, LI Jiayi, LI Ying, SONG Lixiao, HOU Xilin, YAN Jiyong
结球甘蓝游离小孢子热激处理下差异表达基因分析
Exploring differentially expressed genes of isolated microspore under heat shock in cabbage
南京农业大学学报, 2019, 42(2): 236-245
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(2): 236-245.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201803041

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收稿日期: 2018-03-21
结球甘蓝游离小孢子热激处理下差异表达基因分析
曾爱松1 , 李家仪2 , 李英3 , 宋立晓1 , 侯喜林3 , 严继勇1     
1. 江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室, 江苏 南京 210014;
2. 中国农业大学生物学院, 北京 100094;
3. 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在探讨结球甘蓝游离小孢子培养早期体胚发生的分子机制,分析游离小孢子在热激处理下的基因表达谱。[方法]将易出胚结球甘蓝高代自交系611单核靠边期小孢子分别在体外32.5℃培养1 d(热激处理,E2)、体内正常生长1 d(对照组1,E3)及体外25℃培养1 d(对照组2,E5),利用转录组测序技术(RNA-Seq)对3个处理的小孢子文库进行差异基因表达谱分析,并鉴定热激处理下早期体胚发生的响应基因。[结果]将3个处理的小孢子UniGene表达量依次进行两两相比,即E2 vs E3、E2 vs E5以及E3 vs E5,分别鉴定出2 506、1 073和3 322个差异表达基因。基因本体(gene ontology,GO)聚类分析表明,热激处理下的差异表达基因显著富集到细胞组分中的细胞部件、细胞及细胞器;在分子功能中,这些基因在结合、催化活性及核酸结合转录因子活性中的比例最高;在生物过程中的细胞过程、代谢过程及刺激反应等类别中的比例也最高。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析显示,热激处理下的差异表达基因显著富集到植物激素信号转导、植物病原互作、淀粉和糖代谢、抗坏血酸代谢、苯丙氨酸代谢以及多糖降解等途径。进一步对抗坏血酸代谢途径相关基因进行分析,抗坏血酸过氧化物酶基因APX1APX2,半乳糖脱氢酶基因GalDH以及乙醛脱氢酶基因AD在体外32.5℃培养1 d后均显著上调表达。[结论]通过转录组学方法揭示了结球甘蓝游离小孢子在热激处理下基因组的表达变化,鉴定了可能与早期体胚发生相关的抗坏血酸代谢途径基因,为进一步研究甘蓝小孢子体胚发生的分子机制奠定了基础。
关键词结球甘蓝   热激处理   体胚发生   基因表达谱测序   小孢子培养   
Exploring differentially expressed genes of isolated microspore under heat shock in cabbage
ZENG Aisong1, LI Jiayi2, LI Ying3, SONG Lixiao1, HOU Xilin3, YAN Jiyong1    
1. Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014, China;
2. College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100094, China;
3. State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] In order to investigate the molecular mechanism of early somatic embryogenesis in isolated microspore culture(IMC) of cabbage, the gene expression profile of isolated microspores under heat shock was analyzed. [Methods] The microspore at late uninucleate stage of a high-responsive inbred line of cabbage 611 was cultured for 1 day at 32.5℃(heat shock treatment, E2), 1 day in vivo(control 1, E3), and 1 day at 25℃(control 2, E5). The differentially expressed genes(DEG) profiles of three microspore libraries were analyzed by transcriptome sequencing(RNA-Seq), and the response genes of early somatic embryogenesis under heat shock treatment were identified. [Results] The comparisons of UniGene expression of the isolated microspore among E2 vs E3, E2 vs E5, and E3 vs E5 indicated that 2 506, 1 073 and 3 322 DEG were identified. Gene ontology(GO) clustering analysis revealed that DEG under heat shock treatment was significantly enriched in cell part, cell and organelle in cell component, binding, catalytic activity and nucleic acid binding transcription factor activity in molecular function, cellular process, metabolic process and response to stimulus in biological processe, etc.. Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG) pathway analysis indicated that DEG was significantly involved in the multiple processes of plant hormone signal transduction, plant-pathogen interaction, starch and sucrose metabolism, ascorbate and aldarate metabolism, phenylpropanoid biosynthesis, and other glycan degradation, etc.. Furthermore, L-ascorbate peroxidase 1 gene(APX1), L-ascorbate peroxidase 2 gene(APX2), L-galactose dehydrogenase gene(GalDH) and aldehyde dehydrogenase(AD) gene which were related to ascorbate and aldarate metabolism were up-regulated significantly culturing 1 day at 32.5℃. The results showed that these genes might play an important role during embryogenesis in IMC. [Conclusions] The study revealed the changes of genome expression of isolated microspore of cabbage under heat shock treatment by transcriptome, and identified the ascorbic acid metabolic pathway genes that may be related to early somatic embryogenesis, which laid a foundation for further study on the molecular mechanism of microspore somatic embryogenesis in cabbage.
Keywords: cabbage    heat shock    somatic embryogenesis    genes expression profiling    isolated microspore culture   

近年来, 随着分子生物学的发展, 植物游离小孢子培养中体胚发生分子机制的研究取得了较大进展, 先后从甘蓝型油菜、烟草、大麦和小麦等作物中获得了多个小孢子体胚发生不同发育阶段的标记基因[1-3]。但到目前为止, 小孢子胚性分裂之前的研究仍然较少。究其原因, 第一:培养早期的小孢子群体, 在胁迫处理后, 绝大部分小孢子死亡; 而且, 存活小孢子中的大部分继续维持配子体途径。同时, 在培养早期, 死亡小孢子、配子体途径小孢子和孢子体途径小孢子的体积大小差异不如培养后期尤其形成类胚结构阶段差异明显, 使得胚性小孢子的富集存在困难。第二:前人的研究主要使用的是一些低通量的方法去鉴定感兴趣的转录本, 包括cDNA文库扫描[4]、表达序列标签测序[5-6]、候选基因的目标表达分析[7]以及传统和商业的DNA阵列(DNA arrays)技术[8-10]; 伴随体胚发生的早期分子事件的鉴定易被高丰度存在的花粉转录本所遮盖, 通过以上技术获得花粉和胚性小孢子之间差异表达基因存在困难。第三:已有的研究主要集中于不同的模式植物, 而每种作物的诱导又同时存在一个或多个处理, 比如高温胁迫、营养饥饿、渗透式胁迫等。这样使得从花粉发育到单倍体体胚发生转换的分子机制尚不清楚。

小孢子配子体发育方向是通过细胞核2次不对称分裂后发育成具有3个核的成熟花粉粒, 而要让小孢子发育成胚, 就要阻断或改变原有的配子体发育方向, 使小孢子获得胚性转向孢子体发育方向[11-13]。外界胁迫被认为是诱导小孢子获得胚性、从配子体转向孢子体发育途径的一个主要信号。小孢子胚性潜能获得过程即小孢子体胚发生的启动过程, 是孢子体发育途径成功启动的关键环节。目前比较常用的胁迫方式有低温预处理、高温热激预处理、饥饿预处理、秋水仙素预处理等。在芸薹属植物中, 热激预处理被作为大多数基因型诱导体胚发生的一个先决条件。

目前, 转录组测序技术(RNA-Seq)在分子生物学研究中的应用越来越普遍。与传统的差异基因表达研究方法相比, 利用高通量测序技术进行转录组测序能够在单核苷酸水平对物种的整体转录活动进行检测和分析, 基因定量更全面、准确、精细。因此, 本试验以易出胚的结球甘蓝高代自交系611为试材, 利用RNA-Seq技术对热激处理下结球甘蓝游离小孢子培养早期体胚发生在转录水平上的表达差异进行分析, 为深入探究结球甘蓝小孢子体胚发生启动的分子机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 供试材料

以易出胚结球甘蓝高代自交系611(平均每蕾产生78.2个胚)为供试材料, 种植于江苏省农业科学院蔬菜研究所试验基地。4月中旬开始取单核靠边期花蕾进行游离小孢子培养。

试验设3个处理:1)体外32.5 ℃培养1 d, 热激处理组(E2);2)体内正常生长1 d, 对照组1(E3);3)体外25 ℃培养1 d, 对照组2(E5)。对不同处理的小孢子悬浮液进行收集:E2和E5小孢子群体先经孔径48 μm的滤网过滤, 收集滤液; 将所得滤液经孔径24 μm的滤网过滤收集沉淀; 用新鲜的NLN-13培养基悬浮沉淀, 将悬浮液经150 g离心, 回收小孢子沉淀。E3小孢子群体先经孔径25 μm的滤网过滤, 收集沉淀; 用新鲜的NLN-13培养基悬浮沉淀, 然后经孔径45 μm的滤网过滤, 收集滤液, 经150 g离心, 回收小孢子沉淀。分别将收集得到的小孢子沉淀于液氮中迅速冷冻, 然后于-70 ℃冰箱保存备用。

1.2 总RNA提取

采用植物总RNA试剂盒(百泰克生物技术有限公司)提取小孢子总RNA。

1.3 转录组文库的构建和测序试验

试验流程按照Illumina公司提供的标准protocol进行, 包括样本制备和测序流程:1)用带有Oligo(dT)的磁珠富集RNA, 加入破碎缓冲液(fragmentation buffer)将mRNA打断成短片段, 以mRNA为模版, 用六碱基随机引物合成第1条cDNA链; 2)加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成第2条cDNA链; 3)经QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、3′加A并连接测序接头; 4)用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择; 5)PCR扩增, 建好的文库用Illumina HiSeqTM 2500进行测序。

1.4 信息分析流程

1) 对测序得到的原始reads(单端序列)过滤低质量和rRNA; 2)将reads序列与参考基因序列进行比对; 3)基因表达定量分析; 4)利用RPKM(reads per kilobase per million mapped reads, 即每一百万条序列中, 每个基因以1 000个碱基为单位, 比对上的reads个数)值来反映对应UniGene的表达丰度; 5)基于基因表达定量结果进行差异表达基因分析; 6)根据得到的差异表达基因进行功能注释。

1.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定

结合结球甘蓝基因组数据库(http://ocri-enomics.org/bolbase/components.htm), 用Primer Premier 5.0软件设计RT-qPCR引物(表 1), 以结球甘蓝actin基因作为内参基因。两步法荧光定量PCR扩增, 扩增程序为:95 ℃ 30 s, 循环1次; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 20 s, 循环40次, 72 ℃单点检测信号; 熔解程序为:95 ℃ 0 s, 65 ℃ 15 s, 95 ℃ 0 s, 连续检测信号。每个样品重复3次。采用2-ΔΔCT法对数据进行相对定量分析。

表 1 用于实时荧光定量PCR的引物 Table 1 Primers of cabbage genes for RT-qPCR analysis
甘蓝基因组序列编号Cabbage genome accession No. 引物序列(5′→3′) Primer sequences
Bol006522 GTGGGATCCACATTGCTCTT/CAGGGTGGAAAGGAATCTCA
Bol023090 CAAGAGAAAGCTCCGTGGTC/GTCATATGTCCCAGCCGAGT
Bol033832 GGGACGGTCGATGTGATACT/GACCCATTGCTAACGGAGAA
Bol037452 ATGCCAAGCTCAGCAATCTT/TTGTTGTGCAGGTCCATTGT
Bol037453 CTCTTACGCCGACTTGTTCC/TCTTTTCTCCCGCTAGACCA
2 结果与分析 2.1 结球甘蓝单核靠边期小孢子配子体和孢子体细胞学特征

图 1-a可知:单核靠边期是进行结球甘蓝游离小孢子培养的最适时期。在体内小孢子配子体发育途径中, 单核靠边期小孢子经历第1次有丝分裂前的间期后(图 1-b), 第1次不对称分裂后形成具有1个大的营养核和1个小的生殖核的二核细胞(图 1-c)。而在体外小孢子培养的孢子体途径中, 热激胁迫处理后获得胚性的单核靠边期小孢子经历对称分裂形成具有2个大小相等细胞核的二核小孢子(图 1-d)。

图 1 单核靠边期小孢子发育1 d后体内、体外细胞学特征 Fig. 1 Cytological characteristics of late vacuolate microspore after developing 1 d in vivo and in vitro a.单核靠边期Late vacuolate microspore; b.第1次分裂间期Interphase at pollen first mitosis; c.第1次不对称分裂后的二核小孢子Asymmetrically divided microspore with two unequal-size nuclei; d.第1次对称分裂后的二核小孢子Symmetrically divided microspore with two equal-size nuclei; e.单核靠边期小孢子群体Microspore group at the late uninucleate stage; f.体外32.5 ℃培养1 d Microspores after culturing 1 d in vitro at 32.5 ℃; g.体内正常生长1 d Microspores after developing 1 d in vivo.

本研究试验材料611, 小孢子发育同步性非常好。培养1 d后的小孢子群体是由多种发育状态组成的混合群体, 分别由死亡小孢子、未发育的单核靠边期小孢子、看不到细胞核的膨大小孢子和已发生第1次分裂的二核期小孢子组成(图 1-e)。在经32.5 ℃热激胁迫1 d后的小孢子群体中, 有活力的小孢子大部分已经完成了第1次分裂, 包括对称分裂和不对称分裂(图 1-f)。在25 ℃培养对照中, 小孢子的存活率要高于热激胁迫培养; 在其存活的小孢子中, 除了已完成第1次不对称分裂的二核小孢子外, 有相当一部分处于第1次有丝分裂前的间期, 其特征为看不到细胞核的膨大、圆形小孢子。在体内配子体途径中, 主要是由已完成第1次不对称分裂的二核小孢子, 以及部分处于第1次有丝分裂前间期的小孢子(图 1-g)。

2.2 结球甘蓝数字基因表达谱测序与质量评估

表 2可见:3个处理小孢子可用reads数与参考基因组的比对效率较高, 平均在70%以上; 平均CycleQ20为100.00%, 碱基Q30都在94%以上。表明测序及所选参考基因较好, 能够满足后续分析的需要。

表 2 结球甘蓝测序数据统计 Table 2 Output statistics of sequencing in cabbage
处理
Treatment
reads总数
Number ofraw reads
可用reads数
Number ofuse reads
比对上参考基因组的reads数量
Number of mapped readsin the reference genome
CycleQ20比例/%
CycleQ20percentage
G和C占总碱基比例/%
Ratio of G andC to total base
Q30比例/%
Q30 percentage
E2 9 753 496 6 065 577 4 201 390(69.27%) 100.00 46.36 95.17
E3 28 012 569 21 853 515 16 500 653(75.51%) 100.00 46.63 95.21
E5 28 672 495 19 976 007 14 955 772(74.87%) 100.00 46.85 94.93
注: 1) E2:体外32.5 ℃培养1 d, 热激处理组; E3:体内正常生长1 d, 对照组1;E5:体外25 ℃培养1 d, 对照组2。下同。
2) CycleQ20比例为测序质量评估的一个标准, 指的是平均质量值大于或等于20的Cycle所占的百分比; Q30比例指质量值大于或等于30的碱基所占的百分比。
Note: 1) Microspores after culturing 1 d at 32.5 ℃ in vitro, heat shock treatment; E3:Microspores after developing 1 d in vivo, control 1;E5:Microspores after culturing 1 d in vitro, control 2. The same as follows.
2) CycleQ20 percentage is a criterion for sequencing quality evaluation, which refers to the percentage of cycle whose average mass value is greater than or equal to 20, and Q30 percentage refers to the percentage of bases whose mass value is greater than or equal to 30.
2.3 热激处理下结球甘蓝差异基因表达分析

统计结果(表 3)表明:E2 vs E5处理间的差异表达基因数目最少, 表明不同温度的体外培养间差异表达基因较少; 而E2 vs E3、E3 vs E5由于体内和体外2种不同生长环境导致较多差异基因的表达, 其中E2和E5这2种体外培养与E3体内生长环境相比, 体外培养中大多数差异表达基因表现为上调表达。

表 3 处理间的差异表达基因数量的统计 Table 3 Statistics of differentially expressed genes(DEG)number between treatments
比较组合
Combination group
差异表达基因总数
Number of DEG
上调差异表达基因数量
Number of up-regulated DEG
下调差异表达基因数量
Number of down-regulated DEG
E2 vs E3 2 506 310 2 196
E2 vs E5 1 073 797 276
E3 vs E5 3 322 2 300 1 022
2.4 热激处理下结球甘蓝差异表达基因的GO聚类分析

E2 vs E3、E2 vs E5处理间差异表达基因GO分类统计结果见图 2图 3。结果显示:2个比较组合的差异表达基因在细胞组分、分子功能和生物过程3大功能分类中均分别包含了16、16和24个类别。2个比较组合中差异表达基因中含量最高的类别基本一致。其中, 在细胞组分中, 差异表达基因在细胞部分、细胞、细胞器以及膜中比例最高; 在分子功能中, 差异表达基因在结合、催化活性、核酸结合转录因子活性以及运输活性中比例最高; 在生物过程中, 差异表达基因在细胞过程、代谢过程、刺激反应以及生物调节中比例最高。

图 2 E2 vs E3差异表达基因的GO聚类分析 Fig. 2 GO clustering analysis of DEG in E2 vs E3 细胞组分Cellular component:A.细胞部分Cell part; B.细胞Cell; C.细胞器Organelle; D.膜Membrane; E.细胞器部分Organelle part; F.膜部分Membrane part; G.胞外区Extracellular region; H.大分子复合物Macromolecular complex; I.细胞连接Cell junction; J.膜包围内腔Membrane-enclosed lumen; K.细胞外区域部分Extracellular region part; L.细胞外基质Extracellular matrix; M.细胞核Nucleoid; N.细胞外基质部分Extracellular matrix part; O.病毒体Virion; P.病毒体部分Virion part.
分子功能Molecular function:A1.结合Binding; B1.催化活性Catalytic activity; C1.核酸结合转录因子活性Nucleic acid binding transcription factor activity; D1.运输活性Transporter activity; E1.结构分子活性Structural molecule activity; F1.电子载体活性Electron carrier activity; G1.酶调节活性Enzyme regulator activity; H1.分子传感器活性Molecular transducer activity; I1.抗氧化活性Antioxidant activity; J1.受体活性Receptor activity; K1.蛋白结合转录因子活性Protein binding transcription factor activity; L1.养分储存活性Nutrient reservoir activity; M1.金属伴侣活性Metallochaperone activity; N1.通道调节活性Channel regulator activity; O1.蛋白标签Protein tag; P1.转录调节因子活性Translation regulator activity.
生物过程Biological process:A2.细胞过程Cellular process; B2.代谢过程Metabolic process; C2.刺激反应Response to stimulus; D2.生物调节Biological regulation; E2.发育过程Developmental process; F2.定位Localization; G2.组织或生物起源细胞组件Cellular component organization or biogenesis; H2.定位建立Establishment of localization; I2.多细胞生物过程Multicellular organismal process; J2.繁殖Reproduction; K2.繁殖过程Reproductive process; L2.信号Signaling; M2.多生物体过程Multi-organism process; N2.生长Growth; O2.免疫系统过程Immune system process; P2.细胞增殖Cell proliferation; Q2.色素沉积Pigmentation; R2.有节奏的过程Rhythmic process; S2.死亡Death; T2.生物黏附Biological adhesion; U2.移动Locomotion; V2.病毒繁殖Viral reproduction; W2.细胞杀伤Cell killing; X2.碳利用Carbon utilization.
下同。The same as follows.
图 3 E2 vs E5差异表达基因的GO聚类分析 Fig. 3 GO clustering analysis of DEG in E2 vs E5
2.5 热激处理下结球甘蓝差异表达基因的KEGG通路分析

图 4表 4可见:在E2 vs E3的差异表达基因中, 其中显著富集的通路依次为植物-病原菌互作、半乳糖代谢、抗坏血酸代谢、氮代谢、苯丙氨酸代谢、果糖和甘露糖代谢以及淀粉和糖代谢。

图 4 E2 vs E3差异表达基因显著富集的KEGG通路分析 Fig. 4 Analysis of KEGG pathway with significant enrichment DEG in E2 vs E3 A.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢Alanine, aspartate and glutamate metabolism; B.亚麻酸代谢Alpha-linolenic acid metabolism; C.氨基糖和核苷酸糖代谢Amino sugar and nucleotide sugar metabolism; D.抗坏血酸代谢Ascorbate and aldarate metabolism; E.光合碳固定Carbon fixation in photosynthetic organisms; F.氰氨基酸代谢Cyanoamino acid metabolism; G.內吞作用Endocytosis; H.果糖和甘露糖代谢Fructose and mannose metabolism; I.半乳糖代谢Galactose metabolism; J.甘油脂代谢Glycerolipid metabolism; K.糖酵解/糖异生Glycolysis/gluconeogenesis; L.磷酸肌醇代谢Inositol phosphate metabolism; M.亚油酸代谢Linoleic acid metabolism; N.氮代谢Nitrogen metabolism; O.苯丙氨酸代谢Phenylalanine metabolism; P.苯丙烷类生物合成Phenylpropanoid biosynthesis; Q.植物激素信号转导Plant hormone signal transduction; R.植物-病原菌互作Plant-pathogen interaction; S.淀粉和蔗糖代谢Starch and sucrose metabolism; T.牛磺酸和亚牛磺酸代谢Taurine and hypotaurine metabolism.
Q-value为多重假设检验较正之后的P-value。Q-value is P-value after multiple hypothesis test correction.
表 4 E2 vs E3 KEGG通路显著富集的差异表达基因统计 Table 4 Statistics of DEG with significant enrichment in different KEGG pathways in E2 vs E3
调控途径
Pathway
KO编号
KO ID
基因数量
Number of DEG
占总差异基因的比例/%
Proportion of total DEG
植物激素信号转导Plant hormone signal transduction 04075 36 10.47
植物-病原菌互作Plant-pathogen interaction 04626 35 10.17
苯丙烷类生物合成Phenylpropanoid biosynthesis 00940 20 5.81
淀粉和蔗糖代谢Starch and sucrose metabolism 00500 20 5.81
内质网中的蛋白质加工Protein processing in endoplasmic reticulum 04141 19 5.52
糖酵解/糖异生Glycolysis/gluconeogenesis 00010 19 5.52
氨基糖和核苷酸糖代谢Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 00520 18 5.23
剪接体Spliceosome 03040 16 4.65
苯丙氨酸代谢Pheylalanine metabolism 00360 16 4.65
光合碳固定Carbon faxitation in photosynthetic organisms 00710 15 4.36
果糖和甘露糖代谢Fructose and mannose metaboism 00051 13 3.78
內吞作用Endocytosis 04144 12 3.49
氮代谢Nitrogen metabolism 00910 12 3.49
半乳糖代谢Galactose metabolism 00052 11 3.20
抗坏血酸代谢Ascorbate and aldarate metabolism 00053 11 3.20
磷酸肌醇代谢Inositol phosphate metabolism 00520 11 3.20
丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢Alanine, aspartate and glutamate metabolism 00250 11 3.20
半胱氨酸和蛋氨酸代谢Cysteine and methionine metabolism 00270 11 3.20
丙酮酸代谢Pyruvate metabolism 00620 11 3.20
嘌呤代谢Purine metabolism 00230 11 3.20

图 5表 5可见:在E2 vs E5的差异表达基因中, 其中显著富集的通路依次为氮代谢、植物-病原菌互作、内质网中的蛋白质加工、光合碳固定、其他聚糖降解、生物素代谢以及醚脂类代谢。

图 5 E2 vs E5差异表达基因显著富集的KEGG通路分析 Fig. 5 Analysis of KEGG pathway with significant enrichment DEG in E2 vs E5 A.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢Alanine, aspartate and glutamate metabolism; B.亚麻酸代谢Alpha-linolenic acid metabolism; C.抗坏血酸代谢Ascorbate and aldarate metabolism; D.生物素代谢Biotin metabolism; E.光合碳固定Carbon fixation in photosynthetic organisms; F.植物昼夜节律Circadian rhythm-plant; G.半胱氨酸和蛋氨酸代谢Cysteine and methionine metabolism; H.內吞作用Endocytosis; I.乙醚脂类代谢Ether lipid metabolism; J.脂肪酸代谢Fatty acid metabolism; K.赖氨酸生物合成Lysine biosynthesis; L.氮代谢Nitrogen metabolism; M.其他聚糖降解Other glycan degradation; N.过氧物酶体Peroxisome; O.植物-病原菌互作Plant-pathogen interaction; P.内质网中的卟啉加工Porphyrin processing in endoplasmic reticulum; Q.内质网中的蛋白质加工Protein processing in endoplasmic reticulum; R.丙酮酸代谢Pyruvate metabolism; S.硫代谢Sulfur metabolism; T.酪氨酸代谢Tyrosine metabolism.
表 5 E2 vs E5 KEGG通路显著富集的差异表达基因统计 Table 5 Statistics of DEG with significant enrichment in different KEGG pathways in E2 vs E5
调控途径
Pathway
KO编号
KO ID
基因数量
Number of DEG
占总差异基因的比例/%
Proportion of total DEG
植物-病原菌互作Plant-pathogen interaction 04626 18 8.82
内质网中的蛋白质加工Protein processing in endoplasmic reticulum 04141 14 8.24
核糖体Ribosome 03010 11 6.47
植物激素信号转导Plant hormone signal transduction 04075 11 6.47
光合碳固定Carbon faxitation in photosynthetic organisms 00710 10 5.88
丙酮酸代谢Pyruvate metabolism 00620 9 5.29
氧化磷酸化Oxidative phosphorylation 00190 8 4.71
氮代谢Nitrogen metabolism 00910 7 4.12
半胱氨酸和蛋氨酸代谢Cystenie and methionine metabolism 00270 7 4.12
淀粉和蔗糖代谢Starch and sucrose metabolism 00500 6 3.53
糖酵解/糖异生Glycolysis/gluconeogenesis 00010 6 3.53
內吞作用Endocytosis 04144 6 3.53
丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢Alanine, aspartate and glutamate metabolism 00250 6 3.53
抗坏血酸代谢Ascorbate and aldarate metabolism 00053 4 2.35
过氧化物酶体Peroxisome 04146 5 2.94
泛素介导的蛋白水解Ubiquitin mediated proteolysis 04120 5 2.94
苯丙烷类生物合成Phenylpropanoid biosynthesis 00940 5 2.94
剪接体Spliceosome 03040 5 2.94
卟啉和叶绿素代谢Porphyrin and chlorophyll metabolism 00860 4 2.35
脂肪酸代谢Fatty acid metabolism 00071 4 2.35
2.6 热激处理下结球甘蓝抗坏血酸代谢途径相关差异表达基因分析

测序结果显示在高温胁迫响应中, 抗坏血酸(AsA)代谢途径差异基因显著富集。由表 6可见:3个APX基因中, Bol006522和Bol023090分别属于APX1APX2基因, 在3个处理间表达水平显著差异, RPKM值均由大到小为E2、E5、E3;而3个APXT同源基因的表达量均在E3中表达量最高, 且差异较为显著。GalDHAD基因均为E2远高于E3和E5;MIOX1MIOX2分别在E3中无表达或较低表达; 而MIOX5在E3中有较高表达。GLDHAO在3个处理间的表达模式, 在体内与体外之间无规律性表现。

表 6 结球甘蓝AsA代谢途径关键基因表达模式 Table 6 Key gene expression models in AsA pathway in cabbage
基因Gene UniGene编号UniGene code 基因表达RPKM值RPKM value of gene expression 基因表达模式Gene expression model
E2 E3 E5 E2 vs E3 E2 vs E5 E3 vs E5
APX1 Bol006522 30.80 3.74 21.12
APX2 Bol023090 27.15 0.41 4.52
APXT Bol027553 7.37 38.84 7.11
Bol037452 1.76 13.65 0.18
Bol037453 0.85 14.12 0.50
GalDH Bol033832 99.69 19.92 20.39
AD Bol035154 165.42 40.30 52.80
MIOX1 Bol038050 16.43 0 35.72
MIOX2 Bol029773 164.24 54.93 199.11
MIOX5 Bol003764 9.56 96.62 10.30
GLDH Bol024090 83.30 81.10 22.29
AO Bol009901 82.88 164.94 337.96
Bol035219 16.51 0.40 52.80
Bol035765 3.16 8.15 2.83
注: APX:抗坏血酸过氧化物酶L-ascorbate peroxidase; GalDH:半乳糖脱氢酶L-galactose dehydrogenase; AD:乙醛脱氢酶Aldehyde dehydrogenase; MIOX:肌醇氧酶Inositol oxygenase; GLDH:L-半乳糖酸-1, 4-内酯脱氢酶L-galactono-1, 4-lactone dehydrogenase; AO:抗坏血酸氧化酶L-ascorbate oxidase. RPKM:每一百万条序列中, 每个基因以1 000个碱基为单位, 比对上的reads个数Reads per kilobase per million mapped reads; ↑:上调Up; ↓:下调Down.
2.7 RT-qPCR验证

为了验证数字基因表达谱数据的可靠性, 对5个差异表达明显的基因进行RT-qPCR检测。结果(图 6)发现:其表达模式与表达谱测序的结果趋势基本相同, 说明表达谱测序获得的信息具有较高的可靠性。

图 6 基于测序的部分差异表达基因的RT-qPCR验证 Fig. 6 The validation of part DEG based on sequencing by RT-qPCR
3 讨论

研究普遍认为, 游离小孢子体胚发生程序的建立是通过抑制配子体途径的发育来实现。影响小孢子体胚发生启动的基因主要包括小孢子对胁迫的细胞应答基因, 细胞结构的重排和分裂模式的变化基因, 抑制正常的花粉发育程序基因等。在大麦中, 通过对花粉进行饥饿和甘露醇胁迫可诱导体胚发生; 在花粉发育中主要是一些淀粉粒合成基因的表达, 而胚性小孢子淀粉粒合成基因表达下调, 糖和淀粉粒水解基因表达上调[9]。在花粉发育后期需要淀粉粒积累, 而在小孢子培养中淀粉粒的积累对体胚发育进程是有害的[14]。本研究中, 差异表达基因的GO聚类分析表明, 在细胞组分中, 差异表达基因在细胞核、细胞质膜和叶绿体3个类别中所占比例最高。这表明在小孢子胚性获得过程中, 大量细胞结构重排和分裂模式的基因表达发生了变化。在KEGG通路分析中, 半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、淀粉和糖代谢、多糖降解等影响淀粉合成的基因通路显著富集。其中, 在E2 vs E3的差异表达基因中, E2中大量淀粉粒合成基因表达下调, 糖和淀粉粒水解基因表达上调, 表明在体胚诱导期间花粉发育相关基因是下调的, 这与Pulido等[15]的研究结果相一致。

Maraschin等[9]率先对胚性小孢子标记基因的表达进行了研究, 通过对培养期间的小孢子群体表达谱与花粉群体表达谱比较, 发现了与蛋白水解作用、胁迫响应及程序性死亡抑制相关的转录本。Malik等[5]鉴定了大量甘蓝型油菜EST, 与已知的拟南芥胚胎表达基因有高度的序列相似性, 尤其是转录因子基因; 同时选取了24个基因利用RT-PCR在诱导和非诱导、种子发芽和其他孢子体发育的不同阶段进行鉴定, 结果表明, FUSCA3LEAFY COTYLEDON1(LEC1)、LEC2BABY BOOM(BBM)、WOX2WOX9以及ABSCISIC ACID INSENSITIVE3这些基因在单倍体胚和合子胚发育中的表达均可以被鉴定出来, 但是在花粉发育期间没有。本研究中, 多个已报道的体胚发生标记的相关基因在热激胁迫1 d后出现上调表达。

本研究GO聚类分析的生物学过程中, 氧化还原过程、过氧化氢反应、高强度光反应中差异表达基因所占比例较高, 表明在孢子体体胚发生期间, 高温处理诱发的过氧化等胁迫响应起着重要作用。抗坏血酸过氧化物酶(APX)是植物体内尤其是叶绿体中清除H2O2的关键酶, 在干旱、盐胁迫、低温、高温等逆境反应中起着关键作用[16-21]。在体外孢子体发育中, APX表达水平与胚再生能力之间存在正相关性, 蛋白质组数据也证实孢子体诱导期间过氧化物酶活性显著增加[5, 22-23]。本研究中, 胞质APX基因APX1APX2体内正常成长的表达均显著低于体外培养表达, 而且二者在体外32.5 ℃热激培养的表达量显著高于25 ℃培养, 说明体外培养环境显著诱导胞质APX的表达, 而热激胁迫又导致体外培养2种环境中的差异表达; APX在甘蓝小孢子不同处理条件下的差异表达, 以及培养基中添加抗坏血酸对体胚发生的正向诱导, 联合佐证了APX在小孢子培养中所起的作用[24-25]。同时本研究还发现叶绿体的3个APXT同源基因均在E3中表达量最高。以上分析表明, 在体内、体外2种培养环境中, 细胞内不同部位的APX的诱导表达产生了改变。预测APX1APX2基因对于甘蓝体胚发生诱导具有关键作用。GalDHAD基因在3个处理中的表达模式也表明其参与了甘蓝体胚发生的启动过程, 属于早期体胚发生应答基因。

在小孢子体胚发生胁迫过程中, 大量差异表达的基因富集在植物激素信号转导途径中, 如植物生长素、脱落酸和油菜素类固醇等激素相关基因都显著上调表达。激素调节及其信号转导在植物小孢子体胚发生过程中都起到重要作用, 其作用机制还有待进一步分析和验证。

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