文章信息
- 刘唱, 杨洋, 俞静, 李燕, 刘海龙, 张昌伟, 侯喜林, 李英
- LIU Chang, YANG Yang, YU Jing, LI Yan, LIU Hailong, ZHANG Changwei, HOU Xilin, LI Ying
- 不结球白菜BcCNL基因的克隆及功能分析
- Cloning and functional analysis of BcCNL gene in non-heading Chinese cabbage
- 南京农业大学学报, 2019, 42(2): 229-235
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(2): 229-235.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201803048
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文章历史
- 收稿日期: 2018-03-23
不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis)在生长过程中会受到多种病害的影响, 从而导致产量和品质下降[1-2]。霜霉菌主要危害不结球白菜的叶片, 使叶片萎蔫变黄, 严重时产生白色霜状霉层[3], 生产上主要使用农药进行防控, 但效果不明显且污染严重[4]。因此, 寻找抗病基因, 培育抗病品种是降低病害的最有效方法之一。
为了抑制微生物病原体的入侵, 植物已经发展了复杂而精确的防御机制以识别病原体攻击, 例如:病原相关分子模式(PAMP)-触发免疫(PTI)是植物抵抗病原体入侵的首要防线, 即通过质膜上的识别受体感知病原体的PAMP并最后诱导PTI反应[5], 但是, 有些病原体的效应子会巧妙躲避植物的PTI, 植物为了阻止这些病原体的入侵, 会通过抗病基因(R基因)来检测效应子, R基因通常能够编码受体蛋白质, 启动植物的抗病反应信号, 是植物抗病过程中的一个关键因子[6]。CC-NBS-LRR(coiled-coil-nucleotide binding-site-leucine-rich repeat, CNL)是高度保守的植物抗病蛋白家族, 其中卷曲螺旋结构域(CC)在植物固有免疫中发挥重要作用[7-8]。目前, CNL基因的功能已经在许多植物中报道, 如在水稻中, Pb1编码的CNL蛋白能够显著提高对稻瘟病的抗性[9], 在大麦中, CC结构域与WRKY转录因子相互作用提高对白粉病的抗性[10], 在四倍体和六倍体小麦中, Lr10介导对叶锈病的抗性需要2个不同的CNL基因[11], 在葡萄中VqCN基因的过表达增强了对霜霉病的抗性[12], 这为验证BcCNL基因在不结球白菜抗霜霉病的功能提供借鉴。
本试验利用同源克隆的方法在不结球白菜中获得了BcCNL基因, 对BcCNL基因进行生物信息学分析及亚细胞定位, 通过病毒诱导基因沉默(VIGS)方法研究该基因沉默后对霜霉病抗性的影响, 旨在深入研究BcCNL基因在不结球白菜抗霜霉病中的作用, 为培育抗霜霉病品种奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料及菌液收集植物材料为不结球白菜自交系‘苏州青’(抗病品种)和‘矮脚黄’(感病品种)。菌液收集及保存方法采用程永安等[13]的方法, 接种霜霉病菌方法采用刘克钧等[2]的方法。芜菁黄化花叶病毒质粒pTY由Antoine Bouteilly教授馈赠。
1.2 BcCNL基因的克隆BcCNL基因在大白菜数据库中的基因编号为Bra027866。以‘苏州青’叶片cDNA为模板, 采用同源克隆的方法, 用Primer Premier 5.0设计基因克隆引物BcCNL-F和BcCNL-R(表 1)。PCR反应体系为20 μL:cDNA模板1 μL, BcCNL-F和BcCNL-R各1μL, Ex Taq DNA polymerase(5 U · μL-1)1 μL, 10×Ex Taq Buffer(Mg2+ free)2 μL, dNTP Mixture(Each 2.5 mmol · L-1)2 μL, MgCl2(25 mmol · L-1)2 μL, ddH2O 10.8 μL。反应程序为:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 35个循环; 72 ℃ 10 min。PCR产物用10 g · L-1琼脂糖凝胶电泳进行检测, 使用凝胶提取试剂盒(CWBIO)回收目的片段, 然后连接至pMD18-T载体(TaKaRa), 将连接产物转化到大肠杆菌DH-5α中, 挑取阳性单克隆, 测序验证。
| 引物名称Primer name | 引物序列(5′→3′)Primer sequence |
| BcCNL-F/R | ATGTCTGGGGAACTTGTGTCATT/TTAAAATATTATATGCATGATTTCAACAGA |
| CNL-F/R | TCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGATGTCTGGGGAACTTGTGTCATT/GGATCCCGGGCCCGCGGTACCGTTG- TTAAAATATTATATGCATGATTTCAACAGA |
| CP-F/R | TCCACCCTCACCACCTTC/GGGACAGACCTCGCTAACT |
| qRT-F/R | GGGACGAAAGAAGGACGAGTG/CAGGCTTGTTAGGCGAGAAGG |
| Actin-F/R | CTCAGTCCAAAAGAGGTATTCT/GTAGAATGTGTGATGCCAGATC |
采用MEGA 5软件中的邻接法构建系统发育树, 修正参数Bootstrap设置为1 000次; 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库网站上分析BcCNL蛋白结构域, 利用DNAMAN 6.0软件翻译BcCNL基因编码的氨基酸序列, 并计算相对分子质量和等电点。
1.4 亚细胞定位表达载体的构建BcCNL与pEZS-NL-GFP的融合表达载体的构建采用同源重组的方法, 设计引物CNL-F和CNL-R(表 1)。重组质粒采用徐淑平等[14]的方法用金粉包埋。将包埋好的质粒用基因枪(1 000 psi)轰击进入洋葱内表皮细胞, 经16 h的黑暗培养后, 在激光共聚焦显微镜的白光下观察明场, 在蓝光激发光(488 nm)下观察荧光, 用300 g · L-1蔗糖溶液使其质壁分离。
1.5 病毒诱导基因沉默(VIGS)表达载体的构建pTY-BcCNL的载体构建方法主要参照杨学东等[15]的方法。BcCNL选取的40 bp序列为:5′-TTAAGGTACACCAGAGAATTGACGATGTAAAGGATCCACA-3′。由金斯瑞生物科技有限公司合成反向互补的序列80 bp。pTY载体用SnaBⅠ酶切后, 用T4连接酶与合成好的DNA片段过夜连接, 转化大肠杆菌, 挑取阳性单克隆, 测序验证。大量提取pTY-BcCNL质粒, 用金粉包埋后, 基因枪(1 000 psi)轰击转入到2片真叶的‘苏州青’中, 以轰击pTY作为对照, 20 d后可观察到发病症状。选取pTY载体中的外壳蛋白(coat protein, CP)基因片段设计特异引物, 进行PCR检测转基因植株[15]。
1.6 实时定量PCR用RNA Simple Total RNA Kit试剂盒(TIANGEN)提取总RNA。cDNA的合成方法采用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)。使用Beacon Designer 7设计荧光定量特异性引物, 其中qRT-F/R为BcCNL的特异性定量引物(表 1), 参照Xiao等[16]报道的Actin-F/R(Bra028615)引物序列, 反应体系参照SYBR Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)。相对表达量采用2-ΔΔCT法[17]分析。
2 结果与分析 2.1 BcCNL基因的克隆、序列及进化分析采用同源克隆的方法, 以不结球白菜‘苏州青’cDNA为模板, 克隆获得目的片段(图 1)。BcCNL基因含有2 790 bp的开放阅读框, 编码929个氨基酸, 相对分子质量为226.7, 等电点为2.7。系统进化树结果显示, 不结球白菜与野甘蓝的进化关系最近(图 2)。在NCBI网站上分析BcCNL蛋白二级结构域, 结果(图 3)显示:该蛋白属于RX-CC、NB-ARC和LRR-3超家族。
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图 1 BcCNL基因编码的核苷酸序列及氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide and amino acid sequences encoded by BcCNL gene |
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图 2 不结球白菜与其他物种中CNL蛋白的进化分析 Fig. 2 Evolutionary analysis of CNL proteins in non-heading Chinese cabbage and other species |
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图 3 BcCNL氨基酸序列的保守结构域 Fig. 3 Conserved domains of BcCNL amino acid sequences |
由图 4可见:GFP蛋白在整个细胞中都有表达, 而BcCNL-GFP融合蛋白主要在细胞膜上表达, 质壁分离结果进一步说明了BcCNL-GFP融合蛋白主要在细胞膜上表达。
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图 4 BcCNL蛋白的亚细胞定位分析 Fig. 4 Subcellular localization of BcCNL protein |
由图 5可见:BcCNL基因在接种霜霉菌后呈先上升后下降的趋势, 且在48 h达到最大值。‘苏州青’BcCNL基因的整体表达量显著高于‘矮脚黄’。
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图 5 不结球白菜接种霜霉菌后BcCNL基因的表达量 Fig. 5 Expression level of BcCNL gene after infected with downy mildew in non-heading Chinese cabbage |
由图 6可见:转入pTY-BcCNL或pTY的‘苏州青’叶片都出现黄色的斑点, 分别侵染霜霉菌5 d后发现, 转入pTY-BcCNL的‘苏州青’叶片的感病程度明显高于转入pTY的植株。用外壳蛋白(CP)特异引物检测发现转入空载pTY的植株中含有1条442 bp的条带, 而转入pTY-BcCNL的植株中含有1条522 bp的条带, 正常植株中没有(图 7)。正常植株中BcCNL在接种霜霉菌后48 h表达量最高。将转入pTY-BcCNL或pTY的植株接种霜霉菌48 h后, 对BcCNL进行实时荧光定量PCR检测, 结果(图 8)显示:转入pTY-BcCNL重组质粒的‘苏州青’中BcCNL基因的表达量与正常植株相比平均降低70%, 而转入pTY质粒的植株与正常植株相比BcCNL基因的表达量无显著差异。
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图 6 转入pTY或pTY-BcCNL的‘苏州青’接种霜霉菌5 d后的表型
Fig. 6 Phenotypes of'Suzhouqing'after transferred in plasmid pTY or pTY-BcCNL and after 5 days of infected with downy mildew
A、B:转入pTY的植株Plant transferred in plasmid pTY; C、D:转入pTY-BcCNL的植株Plant transferred in plasmid pTY-BcCNL; E、F:正常植株Normal plant; B、D、F:侵染霜霉菌5 d后的表型Plant phenotype after 5 days of infected with downy mildew. 箭头指不同处理植株接种霜霉菌后叶片发病程度。The arrows indicate the degree of disease in the leaves of different treated plants inoculated with downy mildew. |
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图 7 用CP引物进行PCR检测植株体内病毒质粒转录产物 Fig. 7 Detection of viral plasmid transcripts in plants by PCR with CP primers M:DL2000 marker; 1:转入pTY的植株Plant transferred in plasmid pTY; 2:转入pTY-BcCNL的植株Plant transferred in plasmid pTY-BcCNL; 3:正常植株Normal plant. |
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图 8 转入pTY-BcCNL或pTY后发病植株BcCNL的表达水平 Fig. 8 Expression level of BcCNL in the diseased plants after transferred in plasmid pTY-BcCNL or pTY CK:正常植株Normal plant; pTY:转入pTY的植株Plant transferred in plasmid pTY; pTY-BcCNL:转入pTY-BcCNL的植株Plant transferred in plasmid pTY-BcCNL. |
在植物抗病反应中, CNL产物作为免疫受体, 直接或间接感知病原体的存在并引发强烈的防御反应, 最终导致细胞死亡, 病原体进一步生长停止[18]。陈俏丽等[19]研究发现CNL蛋白的编码基因参与水稻品种‘大白谷’天然免疫反应, 从而在水稻抗线虫侵染过程中起到一定抗性作用。本研究中, 克隆得到的BcCNL基因中含有CNL结构域, 荧光定量PCR结果显示, BcCNL基因在接种前和接种霜霉菌后24 h的表达量较低, 而在48 h的表达量上调, 且抗病品种的表达量高于感病品种, 这与向日葵中CNL基因可显著增强对霜霉病抗性的结果一致[20]。说明在没有病原体感染的情况下, R基因以低水平表达, 然而, 这些基因在病原体感染后迅速诱导, 增强植株的抗病性[21]。本研究中, 在72和96 h时BcCNL基因的表达量降低, 说明此时植株免疫信号通路遭到破坏, 不能正常识别病原的分子模式, 促进R基因编码受体蛋白[22]。Zhang等[12]发现VqCN蛋白在烟草细胞中具有很强的膜定位信号, 且VqCN的过表达增强了葡萄对霜霉菌的抗性。本研究中, BcCNL蛋白定位于洋葱的细胞膜上, 推测BcCNL蛋白可能与VqCN具有相同的功能, 通过在细胞膜上发挥防御作用, 抵抗病原菌的入侵, 从而提高不结球白菜对霜霉病的抗性。
VIGS具有简单、快速的沉默基因, 不受植物种类限制, 只需部分序列信息就足以沉默1个基因等优点[23], 目前已经应用到许多植物中, 如:在拟南芥中采用VIGS的方法沉默PDS基因后, 导致植株叶绿素合成受阻, 叶片、茎和花萼出现明显的白化现象[24]; 在小麦中将Era1和Sal1沉默后的植株在水分胁迫的情况下与正常植株相比含水量增高, 并且在Era1沉默后能够促进种子的萌发[25]; 通过VIGS敲除PcSTPK后辣椒叶片坏死病变出现、叶面上疫霉增殖、孢子形成的增加, 均证明PcSTPK的沉默增加了辣椒疫霉感染的敏感性[26]。pTY载体主要由35S启动子及芜菁花叶病毒全基因组组成, 可以用质粒直接侵染植物, 操作简单, 沉默效果显著, 是目前应用最广泛的载体之一[24]。本研究将pTY-BcCNL转入‘苏州青’后, 发现BcCNL基因的表达量降低70%, 沉默效果与杨学东等[15]沉默BcPDS的效果基本一致, 这表明在‘苏州青’中BcCNL基因的表达得到了有效抑制。本研究发现, 沉默BcCNL基因的‘苏州青’对霜霉病的抗性明显低于未沉默植株, 这进一步说明BcCNL基因在不结球白菜抵抗霜霉病中起积极作用。在下一步的研究中, 我们将通过酵母双杂交技术筛选与BcCNL基因互作的上、下游基因并将其过表达载体转入不结球白菜中, 进一步明确该基因在抗霜霉病过程中发挥的作用。
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