不同添加剂对水稻秸秆青贮发酵品质和结构性碳水化合物组分的影响

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201803011

文章信息

赵金鹏, 赵杰, 李君风, 董志浩, 陈雷, 白云峰, 贾玉山, 邵涛

ZHAO Jinpeng, ZHAO Jie, LI Junfeng, DONG Zhihao, CHEN Lei, BAI Yunfeng, JIA Yushan, SHAO Tao

Effect of different additives on fermentation quality and structural carbohydrates compositions of rice straw silage

南京农业大学学报, 2019, 42(1): 152-159

Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(1): 152-159.

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201803011

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收稿日期: 2018-03-17

引用本文

赵金鹏, 赵杰, 李君风, 等. 不同添加剂对水稻秸秆青贮发酵品质和结构性碳水化合物组分的影响[J]. 南京农业大学学报, 2019, 42(1): 152-159.

ZHAO Jinpeng, ZHAO Jie, LI Junfeng, et al. Effect of different additives on fermentation quality and structural carbohydrates compositions of rice straw silage[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(1): 152-159. DOI: 10.7685/jnau.201803011

不同添加剂对水稻秸秆青贮发酵品质和结构性碳水化合物组分的影响

赵金鹏¹ , 赵杰¹ , 李君风¹ , 董志浩¹ , 陈雷¹ , 白云峰² , 贾玉山³ , 邵涛¹

1. 南京农业大学饲草调制加工与贮藏研究所, 江苏南京 210095;
2. 江苏省农业科学院循环农业研究中心, 江苏南京 210014;
3. 内蒙古农业大学农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室, 内蒙古呼和浩特 010018

收稿日期：2018-03-17

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（15）1003-3）；农业部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室资助项目

作者简介：赵金鹏, 硕士研究生

通信作者：邵涛, 教授, 研究方向为饲草调制加工与高效利用, E-mail:taoshaolan@163.com.

摘要：[目的]本文旨在评价甲酸、纤维素酶和乳酸菌对水稻秸秆青贮发酵品质和结构性碳水化合物降解的影响。[方法]试验设无添加对照组（CK）、甲酸添加（6 mL·kg^-1）组（F）、纤维素酶添加（0.5 g·kg^-1）组（C）、乳酸菌添加1×10⁶ CFU·g^-1组（L）和乳酸菌+纤维素酶组合添加组（CL），添加量以鲜质量计。水稻秸秆青贮6、15、30和60 d后采集样品，分析青贮饲料发酵品质和结构性碳水化合物的组分变化。[结果]与对照组相比，添加甲酸（F组）显著提高水溶性碳水化合物含量（P < 0.05），降低氨态氮/总氮值，但一定程度上抑制乳酸发酵；纤维素酶组对水稻秸秆青贮发酵品质具有一定的改善效果；添加乳酸菌L组显著提高乳酸含量和乳酸/乙酸值（P < 0.05），显著降低pH值、氨态氮/总氮值和乙酸含量（P < 0.05），明显改善水稻秸秆青贮发酵品质；相对于L组，CL组并没有进一步改善青贮发酵品质。整个青贮过程中，F组始终显示最低的纤维素和半纤维素含量（P < 0.05），C组和CL组纤维素和半纤维素含量显著低于对照组（P < 0.05），CL组纤维素和半纤维素含量又低于C组（P > 0.05）。[结论]甲酸对纤维素和半纤维素降解作用最为明显，乳酸菌和纤维素酶组合添加不但提高了发酵品质，还对纤维素和半纤维素具有较为明显的降解作用。

关键词：水稻秸秆添加剂发酵品质结构性碳水化合物

Effect of different additives on fermentation quality and structural carbohydrates compositions of rice straw silage

ZHAO Jinpeng¹, ZHAO Jie¹, LI Junfeng¹, DONG Zhihao¹, CHEN Lei¹, BAI Yunfeng², JIA Yushan³, SHAO Tao¹

1. Institute of Ensiling and Processing of Grass, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Circular Agriculture Research Center, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
3. Key Laboratory of Forage Cultivation, Processing and High Efficient Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China

Abstract: [Objectives] The objective of this study was to evaluate the effects of formic acid, cellulase and lactic acid bacteria on fermentation quality and structural carbohydrates degradation of rice straw silage. [Methods] The treatments were ensiled with:no additive control(CK); 6 mL·kg^-1 formic acid(F); 0.5 g·kg^-1 cellulase(C); 1×10⁶ CFU·g^-1 lactic acid bacteria(L); C+L(CL), based on fresh matter. The silos from each treatment were opened on 6, 15, 30 and 60 d of ensiling, and then the fermentation quality and structural carbohydrates compositions of rice straw silage were analyzed. [Results] Compared with the control silage, addition of formic acid significantly increased water soluble carbohydrate content(P < 0.05), and decreased ammonia nitrogen/total nitrogen(P < 0.05), but the lactic acid fermentation was inhibited. Rice straw added with cellulase had an improvement effect on silage quality. L treatment obviously improved the fermentation quality of rice straw silage as indicated by higher lactic acid content and lactic acid/acetic acid(P < 0.05), and lower pH, ammonia nitrogen/total nitrogen and acetic acid contents than those of the control silage(P < 0.05). Compared with L silage, CL treatment did not further improve the fermentation quality. F treatment showed the lowest cellulose and hemicellulose contents during ensiling(P < 0.05). C and CL treatment had lower cellulose and hemicellulose contents compared with CK(P < 0.05), and CL silage had lower hemicellulose and cellulose contents than C silage(P > 0.05). [Conclusions] The addition of formic acid was the most effective in degrading cellulose and hemicellulose, and cellulase combination of lactic acid bacteria not only improved fermentation quality, but also degraded cellulose and hemicellulose effectively.

Keywords: rice straw additives fermentation quality structural carbohydrates

中国长三角洲地区素以鱼米之乡著称, 水稻秸秆资源十分丰富, 但只有少部分作为粗饲料用于饲喂反刍家畜, 大部分未得到合理利用, 常被丢弃于田间, 甚至部分地区仍有焚烧秸秆的现象存在, 造成资源浪费和环境污染^[1]。随着我国畜牧业的快速发展, 粗饲料短缺问题日渐突出, 阻碍了畜牧业的可持续发展, 充分合理地利用秸秆饲料是缓解环境污染和粗饲料短缺的有效途径^[2]。水稻秸秆粗纤维含量高, 可消化养分含量低, 适口性差^[3], 不能满足家畜生产对营养物质的需求。因此, 将水稻秸秆调制成优质青贮饲料, 提高其营养价值和适口性, 对促进水稻秸秆饲料化利用具有十分重要的现实意义。

水稻秸秆水溶性碳水化合物含量低, 表面附着的乳酸菌数量少, 常规青贮很难调制出优质的青贮饲料^[4]。添加甲酸能够促进青贮早期pH值迅速下降, 抑制与呼吸作用相关的植物酶和好氧性微生物的活性^[5], 减少其对水溶性碳水化合物和蛋白质的消耗。也有研究报道, 添加甲酸对青贮饲料中的结构性碳水化合物具有一定的酸解作用, 能释放出更多的水溶性碳水化合物, 促进乳酸发酵, 改善青贮发酵品质^[6]。乳酸菌和纤维素酶作为生物型青贮添加剂已在青贮饲料生产中被广泛应用, 并取得了良好的效果。青贮过程中添加植物乳杆菌可以促进青贮早期乳酸快速发酵, 迅速降低pH值, 有效抑制有害微生物的活性, 减少营养物质的损失^[7-8]。纤维素酶可以降解结构性碳水化合物, 产生可溶性糖, 为乳酸菌提供额外的发酵底物, 促进乳酸产生, 同时还可以打破细胞壁结构, 促进瘤胃微生物对其的利用, 提高青贮饲料的消化率^[9-10]。有研究表明组合添加乳酸菌和纤维素酶比各自单独添加可进一步提高羊草的青贮发酵品质^[11]。

本研究旨在探讨添加甲酸、纤维素酶和乳酸菌对水稻秸秆青贮发酵品质和结构性碳水化合物降解的影响, 为调制优质水稻秸秆青贮饲料提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

水稻秸秆由江苏省农业科学院提供, 水稻于2016年5月种植于江苏省农业科学院试验地, 于2016年10月13日收获, 水稻秸秆为去除籽粒的茎秆。甲酸(分析纯级)购于国药集团化学试剂有限公司, 纯度88%(体积分数)。纤维素酶(江苏锐阳生物科技有限公司)是由木霉代谢产物制成的固体粉末, 酶活性为50 000 U·g^-1, 使用最适温度为50 ℃, 最适pH值为4.8。乳酸菌制剂(MTD 1)主要由植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)组成, 菌含量为1×10⁹ CFU·g^-1。

1.2 试验设计

试验采用完全随机区组设计, 设5个处理组:对照组(CK)、甲酸组(F)、纤维素酶组(C)、乳酸菌组(L)和乳酸菌+纤维素酶组(CL), 甲酸添加量为6 mL·kg^-1, 纤维素酶添加量为0.5 g·kg^-1, 乳酸菌制剂添加水平为1×10⁶ CFU·g^-1, 均以鲜物质(fresh matter, FM)为基础。分别青贮6、15、30和60 d后打开实验室青贮窖取样分析, 每个处理及每个青贮时间点5个重复。

1.3 试验方法 1.3.1 青贮饲料的调制

将水稻秸秆切成1~2 cm左右, 按试验设计量将甲酸、纤维素酶和乳酸菌均匀喷洒在水稻秸秆上, 充分混匀, 装填至体积为5 L的实验室青贮窖(塑料容器)中, 人工压实后盖上内外盖, 并缠上胶带, 在室温条件下保存。

1.3.2 样品处理

实验室青贮窖打开后, 取出全部青贮饲料将其混和均匀, 称取200 g放入1 L的广口三角瓶中, 加入600 mL去离子水, 浸提24 h(4 ℃), 然后通过2层纱布和定性滤纸过滤, 得到的滤液即为青贮饲料的浸提液, -20 ℃冷冻冰箱保存待测。浸提液用于测定pH值和氨态氮、乳酸、挥发性脂肪酸和乙醇含量。将剩余青贮饲料收集烘干, 测定干物质、水溶性碳水化合物、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维以及酸性洗涤木质素含量。

1.3.3 测定指标及分析方法

将原料和青贮饲料于65 ℃烘箱中烘60 h以上至恒质量, 测定干物质(dry matter, DM)含量; pH值用pH计测定(HANNA pH 211型); 采用盐酸-氢氧化钠滴定法测定缓冲能(buffering capacity, BC)^[12]; 采用蒽酮-硫酸比色法测定水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)含量^[13]; 采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮(ammonia nitrogen, AN)含量^[12]; 使用TM2300型凯氏定氮仪(Kjeltec)测定粗蛋白(crude protein, CP)含量; 采用ANKOM²⁰⁰半自动纤维分析仪(美国ANKOM科技公司)测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)和酸性洗涤木质素(acid detergent lignin, ADL)含量。测定NDF时需加入耐高温α淀粉酶和亚硫酸钠, 纤维素含量由ADF减去ADL计算得出。半纤维素含量由NDF减去ADF计算得出。用高效液相色谱仪(安捷伦1260型)测定乳酸、乙醇和挥发性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)含量, 配备示差检测器和Carbomix^® H-NP5色谱柱(美国赛分科技有限公司), 流动相为2.5 mmol·L^-1 H₂SO₄, 流速0.5 mL·min^-1, 温度55 ℃。分别选用MRS(de Man, Rogosa, Sharpe)琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基对乳酸菌和酵母菌进行培养计数, 30 ℃恒温培养3~4 d^[13]。V-score值计算公式^[14]:V-score=Y_N+Y_A+Y_B。根据V-score评价体系标准^[14], 青贮饲料发酵品质被划分为3个等级:优等(V-score≥80)、中等(60≤V-score＜80)和差等(V-score＜60)。V-score评价变量因素见表 1。

表 1 青贮饲料V-score评价变量因素 Table 1 V-score evaluation for silage

项目 Items	X变量及取值范围/% Variable and range of X	Y因变量 Dependent variable of Y
氨态氮/总氮Ammonia nitrogen/total nitrogen(X_N)	X_N≤5 5＜X_N≤10 10＜X_N≤20 X_N＞20	Y_N=50 Y_N=60-2 Y_N=80-4 X_N Y_N=0
乙酸+丙酸含量Acetic acid+propionic acid content(X_A)	X_A≤0.2 0.2＜X_A≤1.5 X_A＞1.5	Y_A=10 Y_A=(150-100 X_A)/13 Y_A=0
丁酸含量Butyric acid(X_B)	0≤X_B≤0.5 X_B＞0.5	Y_B=40-80 X_B Y_B=0

表选项

1.4 数据处理与统计

采用SAS 8.2软件对试验数据进行单因子方差分析(ANOVA), 并用Tukey’s方法对处理间和青贮时间的平均数进行多重比较(P < 0.05)。

2 结果与分析 2.1 水稻秸秆化学成分和微生物组成

水稻秸秆干物质含量以鲜质量计为418 g·kg^-1, 粗蛋白含量以干物质量计为61.2 g·kg^-1, 水溶性碳水化合物含量为62.3 g·kg^-1, 缓冲能为39.7 mEq·kg^-1。中性洗涤纤维含量以干物质量计为597 g·kg^-1, 酸性洗涤纤维含量为371 g·kg^-1, 酸性洗涤木质素含量为54.4 g·kg^-1, 纤维素含量为316 g·kg^-1, 半纤维素含量为226 g·kg^-1。乳酸菌数量以鲜质量计小于1×10⁵ CFU·g^-1, 酵母菌数大于1×10⁴ CFU·g^-1。

2.2 添加剂对青贮过程中pH值和干物质、乳酸、乙酸、丁酸含量及乳酸/乙酸、V-score值的影响

如表 2所示:青贮过程中各组干物质含量逐渐下降, 其中F组的干物质含量始终显著高于其他各组(P < 0.05), 其他各组间差异不显著(P > 0.05)。

表 2 添加剂对水稻秸秆青贮过程中pH值和干物质、乳酸、乙酸、丁酸含量及乳酸/乙酸、V-score值的影响 Table 2 Effect of additives on pH, the contents of dry matter, lactic acid, acetic acid, butyric acid and LA/AA, V-score during ensiling of rice straw

测定项目 Items	处理 Treatments	青贮时间/d Ensiling time
测定项目 Items	处理 Treatments	6	15	30	60
干物质含量/(g·kg^-1) Dry matter content	CK	327.00±4.17^Ba	328.00±2.73^Ba	320.00±8.63^Ba	318.00±0.38^Ba
	F	406.00±4.09^Aa	409.00±6.56^Aa	392.00±5.52^Aa	386.00±8.52^Aa
	C	337.00±4.12^Ba	331.00±6.50^Ba	321.00±3.89^Ba	320.00±1.66^Ba
	L	344.00±5.50^Ba	339.00±1.54^Bab	332.00±6.18^Bab	324.00±3.25^Bb
	CL	330.00±6.34^Ba	329.00±1.81^Ba	323.00±0.27^Ba	322.00±1.40^Ba
pH值 pH value	CK	5.23±0.09^Aa	4.53±0.03^Ab	4.57±0.02^Ab	4.78±0.12^Ab
	F	4.24±0.04^Ca	4.28±0.01^Ba	4.33±0.03^Ba	4.30±0.03^BCa
	C	4.52±0.04^Ba	4.32±0.06^Ba	3.96±0.03^Cb	4.47±0.10^ABa
	L	4.14±0.01^Ca	3.91±0.01^Cb	3.81±0.01^Cc	4.15±0.04^BCa
	CL	4.17±0.03^Ca	3.96±0.03^Cbc	3.79±0.07^Cc	4.11±0.02^Cab
乳酸含量/(g·kg^-1) Lactic acid	CK	16.20±1.92^Bc	27.90±1.53^Bb	57.80±2.95^Ba	22.80±2.78^BCbc
	F	1.13±0.41^Cb	1.05±0.07^Cb	4.15±1.68^Cb	17.00±1.27^Ca
	C	22.80±3.77^Bb	49.80±9.24^ABab	63.70±3.80^Ba	32.90±3.81^Bb
	L	51.10±2.48^Abc	64.10±5.45^Ab	87.80±5.17^Aa	45.30±1.23^Ac
	CL	39.90±2.69^Ac	62.20±1.89^Ab	87.10±4.46^Aa	48.70±3.09^Abc
乙酸含量/(g·kg^-1) Acetic acid content	CK	8.40±0.15^Ad	14.00±0.46^Ac	22.40±0.15^Ab	25.80±0.33^Aa
	F	1.96±0.03^Dc	2.50±0.43^Dbc	4.41±0.45^Da	3.78±0.32^Dab
	C	7.70±0.71^ABb	13.00±0.36^Ab	20.20±1.64^ABa	21.20±1.55^Ba
	L	5.88±0.28^Cc	10.90±0.62^Bbc	12.90±1.17^Cab	15.20±0.94^Ca
	CL	6.20±0.40^BCc	9.00±0.23^Cb	16.40±0.43^BCa	18.10±0.77^BCa
丁酸含量/(g·kg^-1) Butyric acid content	CK	—	0.36±0.21	1.99±0.10	1.51±0.24
	F	—	—	—	—
	C	—	—	1.05±0.08	1.55±0.28
	L	—	—	—	—
	CL	—	—	—	—
乳酸/乙酸 Lactic acid/acetic acid	CK	1.93±0.23^Ca	1.99±0.10^CDa	2.58±0.12^Ba	0.88±0.12^Cb
	F	0.57±0.20^Db	0.44±0.08^Db	1.02±0.50^Cb	4.55±0.47^Aa
	C	2.95±0.30^Cab	3.83±0.71^BCa	3.18±0.24^Bab	1.60±0.31^BCb
	L	8.69±0.10^Aa	5.90±0.69^ABb	6.85±0.36^Aab	2.91±0.23^Bc
	CL	6.44±0.21^Bab	6.93±0.39^Aa	5.31±0.32^Ab	2.70±0.23^Bc
V-score	CK	77.40±1.35^Ca	68.50±3.00^Da	55.30±1.68^Cb	45.40±3.03^Cb
	F	100.00±0.00^Aa	100.00±0.00^Aa	97.20±1.16^Aa	96.00±1.45^Aa
	C	89.70±3.49^Ba	79.40±0.87^Cb	76.70±2.40^Bb	71.80±1.48^Bb
	L	96.90±0.97^ABa	92.90±0.42^Bab	92.50±0.43^Aab	88.00±2.15^Ab
	CL	97.80±0.23^Aa	96.60±1.11^Aba	92.30±0.87^Ab	88.40±1.07^Ab
注:1)CK.无添加对照Control; F.添加甲酸6 mL·kg^-1 Formic acid added 6 mL·kg^-1; C.添加纤维素酶0.5 g·kg^-1 Cellulase added 0.5 g·kg^-1; L.添加乳酸菌1×10⁶ CFU·g^-1 Lactobacillus plantarum added 1×10⁶ CFU·g^-1; CL.添加纤维素酶和乳酸菌Cellulase and Lactobacillus plantarum added. 2)不同小写字母表示相同处理不同青贮时间之间差异显著(P < 0.05);不同大写字母表示相同青贮时间不同处理间差异显著(P < 0.05)。Values with different lowercase letters show significant differences among ensiling days in the same treatment(P < 0.05). Values with different capital letters show significant differences among treatments in the same ensiling day(P < 0.05).下同。The same as below.

表选项

整个青贮过程中各添加剂组pH值均始终显著低于CK组(P < 0.05)。但C组在60 d与CK组差异不显著(P > 0.05), CK组pH值始终在4.50以上, F组pH值在整个青贮过程中无变化, 保持在4.30左右, L和CL组在青贮6 d已降至4.20以下, 青贮30 d时降至最低, 分别为3.81和3.79, 之后显著上升(P < 0.05)。

青贮过程中, 各组乳酸含量均随着青贮时间的延长逐渐上升, 青贮30 d达到峰值, 之后显著(P < 0.05)下降, 但F组在青贮前30 d仅检测出少量的乳酸, 之后显著上升(P < 0.05)。整个青贮过程中, F组始终显示最低的乳酸含量(P < 0.05), C组乳酸含量高于或显著高于CK组(P < 0.05), L和CL组乳酸含量始终显著高于CK和C组(P < 0.05), L和CL组间差异不显著(P > 0.05)。

各组乙酸含量随着青贮的进行均呈上升趋势。青贮过程中F、L和CL组乙酸含量显著低于CK组(P < 0.05), C组略低于CK组, F组始终显示最低的乙酸含量(P < 0.05)。L和CL组乳酸/乙酸值始终显著高于CK组(P < 0.05), C组略高于CK组, F组青贮30 d期间显著低于CK组(P < 0.05), 但青贮60 d F组较其他各组显著上升(P < 0.05)。CK、C、L和CL组在青贮结束时乳酸/乙酸值均有不同程度的下降。除CK和C组青贮30 d后检测到极少量的丁酸外, 其他各组均未检测到。

整个青贮期间各添加剂组的V-score值始终显著高于CK组(P < 0.05)。根据V-score评价体系标准, 青贮结束时F、L和CL组的发酵品质均为优等(80.0以上), C组为中等(71.8), 而CK组的发酵品质为差等(45.4)。

2.3 添加剂对水稻秸秆青贮过程中氨态氮/总氮、乙醇和水溶性碳水化合物含量的影响

如表 3所示:随着青贮时间的延长, 各组乙醇含量虽有波动, 但总体上呈上升趋势。整个青贮过程中F、L和CL组的乙醇含量低于(P > 0.05)或显著低于(P < 0.05)CK和C组, 其中F组乙醇含量最低。

表 3 添加剂对水稻秸秆青贮过程中氨态氮/总氮、乙醇和水溶性碳水化合物含量的影响 Table 3 Effect of additives on ammonia nitrogen/total nitrogen, ethanol and water soluble carbohydrate contents during ensiling

测定项目 Items	处理 Treatments	青贮时间/d Ensiling time
测定项目 Items	处理 Treatments	6	15	30	60
乙醇含量/(g·kg^-1) Ethanol content	CK	12.30±0.89^Ab	13.40±1.99^Ab	21.40±0.79^Aa	20.40±0.51^Aa
	F	3.21±0.15^Cb	5.33±0.51^Ca	6.15±0.26^Ca	5.35±0.24^Ca
	C	10.60±0.71^Ab	12.70±1.52^ABb	21.50±1.02^Aa	19.70±0.45^Aa
	L	5.81±1.34^BCc	7.72±0.28^BCbc	11.80±0.83^Ba	11.00±0.52^Bab
	CL	9.15±0.47^ABa	8.06±0.41^ABCa	9.86±0.53^Ba	9.74±0.69^Ba
氨态氮/总氮(g·kg^-1) Ammonia nitrogen/total nitrogen	CK	130.00±3.47^Ab	136.00±7.08^Ab	164.00±4.00^Aab	198.00±15.12^Aa
	F	33.70±0.59^Dc	46.10±2.13^Cbc	63.90±5.78^Cab	70.30±7.27^Ca
	C	93.20±12.33^Bb	115.00±2.17^Aab	118.00±4.91^Bab	126.00±3.16^Ba
	L	65.30±4.84^BCb	78.90±2.61^Bab	79.00±1.00^Cab	95.10±8.25^BCa
	CL	60.60±1.42^CDb	63.10±5.81^BCb	75.70±3.81^Cab	92.80±4.91^BCa
水溶性碳水化合物含量/(g·kg^-1) Water soluble carbohydrate content	CK	11.00±0.55^Ba	7.91±0.05^Bb	5.92±0.34^Bc	5.41±0.20^Bc
	F	45.70±3.24^Aa	27.90±2.53^Ab	26.60±3.51^Ab	31.70±3.25^Aab
	C	11.90±0.52^Ba	7.53±0.16^Bb	6.73±0.17^Bb	6.32±0.14^Bb
	L	11.81±0.97^Ba	8.52±0.17^Bb	8.08±0.32^Bb	7.08±0.13^Bb
	CL	13.41±1.39^Ba	9.40±0.17^Bb	8.10±0.06^Bb	7.47±0.31^Bb

表选项

整个青贮期间各组的氨态氮/总氮值逐渐升高。各添加剂组始终显著低于CK组(P < 0.05), 青贮6 d CK组的氨态氮/总氮已高达130 g·kg^-1, C组青贮15 d达到100 g·kg^-1以上, 而F、L和CL组始终低于100 g·kg^-1, 且在青贮60 d后F、L和CL组的仅为CK组的一半。

青贮期间总体上各组水溶性碳水化合物含量呈下降趋势。整个青贮过程中各添加剂处理组水溶性碳水化合物含量始终高于CK组(P > 0.05), 其中F组始终显著高于其他各组(P < 0.05)。

2.4 添加剂对水稻秸秆青贮过程中结构性碳水化合物含量的影响

如表 4所示:整个青贮过程中各组中性洗涤纤维含量除个别有波动外, 总体呈上升趋势。各添加剂组中性洗涤纤维含量始终显著低于CK组(P < 0.05)。各组酸性洗涤纤维含量均随青贮时间的延长呈上升趋势, 各添加剂组酸性洗涤纤维含量始终显著低于CK组(P < 0.05), 其中F和CL组青贮15 d后又显著低于C和L组(P < 0.05)。各组酸性洗涤木质素含量除个别有波动外, 均随着青贮时间的延长总体呈上升趋势。青贮60 d, F和CL组酸性洗涤木质素含量显著高于L和CK组(P < 0.05), 但与C组差异不显著(P > 0.05)。

表 4 添加剂对水稻秸秆青贮过程中结构性碳水化合物组分含量的影响 Table 4 Effect of additives on structural carbohydrates composition contents during ensiling of rice straw

测定项目 Items	处理 Treatments	青贮时间/d Ensiling time
测定项目 Items	处理 Treatments	6	15	30	60
中性洗涤纤维含量/(g·kg^-1) Neutral detergent fiber content	CK	661.0±2.38^Aa	673.0±2.61^Aa	682.0±2.66^Aa	691.0±2.42^Aa
	F	633.0±1.46^Bb	630.0±2.38^Cb	630.0±0.68^Cb	644.0±1.63^Ba
	C	626.0±1.10^Bb	646.0±1.24^Ba	651.0±1.47^Ba	652.0±3.31^Ba
	L	636.0±1.28^Bb	648.0±1.14^Ba	650.0±2.23^Ba	657.0±1.26^Ba
	CL	627.0±1.33^Bb	638.0±1.88^BCab	637.0±2.27^BCab	642.0±2.25^Ba
酸性洗涤纤维含量/(g·kg^-1) Acid detergent fiber content	CK	409.0±1.23^Ab	416.0±0.92^Aab	419.0±4.66^Aab	425.0±1.75^Aa
	F	389.0±2.95^Bb	400.0±1.08^Bab	392.0±1.28^Cb	408.0±1.62^Ca
	C	392.0±2.44^Bb	407.0±1.90^Ba	407.0±1.44^Ba	414.0±2.17^Ba
	L	389.0±3.82^Bb	409.0±1.12^Ba	409.0±1.80^Ba	418.0±2.57^Ba
	CL	392.0±1.72^Bc	405.0±1.52^Bab	400.0±1.16^Cb	408.0±1.25^Ca
酸性洗涤木质素含量/(g·kg^-1) Acid detergent lignin content	CK	51.3±1.69^Ba	50.0±0.15^Ba	51.4±1.26^Ba	57.7±2.29^Ba
	F	53.1±1.25^ABb	61.0±1.71^Aab	59.6±1.77^ABab	71.5±1.80^Aa
	C	56.2±1.96^ABb	54.8±1.04^ABb	59.2±1.13^ABab	65.8±2.79^ABa
	L	50.1±1.30^Ba	51.0±1.62^Ba	57.7±1.19^ABa	56.5±0.41^Ba
	CL	60.6±1.07^Abc	56.5±0.85^ABc	65.1±1.74^Aab	69.4±1.45^Aa
半纤维素含量/(g·kg^-1) Hemicellulose content	CK	253.0±6.02^Aa	257.0±4.91^Aa	264.0±0.45^Aa	266.0±9.89^Aa
	F	243.0±0.61^ABa	230.0±1.92^Bc	238.0±0.99^Bab	234.0±2.47^Bbc
	C	234.0±2.66^Ba	239.0±2.71^Ba	244.0±2.73^Ba	238.0±1.72^Ba
	L	247.0±0.46^ABa	239.0±2.95^Ba	241.0±2.28^Ba	239.0±2.46^Ba
	CL	235.0±3.95^Ba	233.0±0.73^Ba	237.0±7.02^Ba	236.0±1.26^Ba
纤维素含量/(g·kg^-1) Cellulose content	CK	357.0±2.74^Aa	366.0±0.96^Aa	367.0±5.62^Aa	369.0±3.00^Aa
	F	331.0±1.30^Ba	339.0±2.94^Ca	333.0±3.40^Da	337.0±1.05^Ba
	C	336.0±1.28^Bb	352.0±2.86^Ba	348.0±1.43^BCab	348.0±4.38^Bab
	L	340.0±6.12^ABb	358.0±3.91^ABa	351.0±1.05^Bab	362.0±2.83^Aa
	CL	336.0±2.78^Bc	349.0±0.67^BCa	335.0±1.11^CDb	339.0±0.65^Bbc

表选项

整个青贮过程中, 各添加剂组半纤维素含量低于CK组, 其中C和CL组始终显著(P < 0.05)低于CK组, F和L组在青贮6 d后始终显著低于CK组(P < 0.05)。整个青贮过程中, 各添加剂组纤维素含量低于CK组, 其中F、C和CL组纤维素含量始终显著低于CK组(P < 0.05), F组显示最低的纤维素含量, CL组次之。

3 讨论 3.1 添加剂对水稻秸秆青贮过程中发酵品质的影响

本试验中甲酸添加组干物质含量显著高于其他组, 主要是由于甲酸的添加, 使青贮原料形成酸性环境, 保持较低的pH值, 从而抑制微生物的活性, 减少营养物质的损失^[14]。

青贮前30 d, 由于甲酸的存在, 其在抑制有害微生物的同时, 对乳酸菌的活性也产生抑制, 导致甲酸添加组只有少量的乳酸、乙酸和乙醇生成, 而随着时间的延长, 甲酸对乳酸菌的抑制作用逐渐减弱, 使甲酸添加组在青贮60 d时乳酸含量显著升高。荣辉等^[15]研究了不同水平甲酸对象草青贮发酵品质的影响, 结果表明低添加量甲酸的抑菌作用会随着青贮时间的延长逐渐减弱, 使青贮后期乳酸含量逐渐增加, pH值降低。整个青贮过程中纤维素酶添加组乳酸含量始终高于对照组, pH值显著低于对照组, 这是由于添加纤维素酶降解青贮饲料的部分纤维素, 释放出葡萄糖, 为乳酸菌提供额外的发酵底物^[16], 一定程度上促进乳酸发酵, 但由于水稻秸秆表面附着乳酸菌数量较少(＜10⁵ CFU·g^-1), 且活性不强, 即使补充额外的发酵底物, 也不能较大程度改善青贮发酵品质^[17]。此外相对其他各添加组, 纤维素酶添加组乙酸含量较多, 这是由于青贮过程中半纤维素降解较多, 释放出较多戊糖, 其可被异型乳酸菌发酵生成乙酸^[5]。青贮过程中乳酸菌添加组和乳酸菌和纤维素酶组合添加组乳酸含量显著高于对照组, 且pH值始终处于优质青贮饲料要求范围(＜4.20)^[18], 添加乳酸菌制剂明显改善水稻秸秆青贮发酵品质, 说明本试验中添加乳酸菌对改善青贮发酵品质效果优于添加酶制剂。同时乳酸菌添加组和乳酸菌和纤维素酶组合添加组乙酸含量显著低于对照组, 乳酸/乙酸值又显著高于对照组, 表明这2组在青贮过程中乳酸发酵以同质型乳酸发酵为主。这是由于本试验所使用乳酸菌制剂为植物乳杆菌, 是同型发酵乳酸菌, 利用底物广泛, 产酸和耐酸能力强^[8], 因此促进了同型乳酸发酵。Guo等^[19]研究表明, 添加植物乳杆菌明显改善了玉米和青稞秸秆混合青贮的发酵品质, 增加乳酸含量, 降低pH值和乙酸含量。

青贮30 d后, 除甲酸添加组外其他各组的乳酸含量下降, 乙酸含量逐渐上升, 这可能是由于青贮后期对pH值有较强耐受能力的异型发酵乳酸菌开始占主导地位, 异型发酵乳酸菌可以将水溶性碳水化合物代谢为乳酸和乙酸, 同时也可将乳酸代谢为乙酸^[5], 导致青贮30 d后pH值上升, 乳酸/乙酸值下降。

Yuan等^[20]报道指出优质青贮饲料氨态氮/总氮值应小于100 g·kg^-1。本试验中对照组氨态氮/总氮值在6 d已高达130 g·kg^-1, 纤维素酶添加组氨态氮/总氮虽然显著低于对照组, 但在青贮15 d氨态氮/总氮值超过100 g·kg^-1, 说明对照和纤维素酶添加组均发生较大程度的蛋白质降解。添加甲酸和乳酸菌分别直接或间接促进青贮饲料酸性环境的快速形成, 降低pH值, 进而抑制青贮初期植物蛋白酶和青贮过程中有害微生物对蛋白质的降解, 减少氨态氮的生成, 因此甲酸添加组、乳酸菌添加组以及乳酸菌和纤维素酶组合添加组的氨态氮/总氮值始终低于100 g·kg^-1。Desta等^[21]的研究结果显示, 象草青贮过程中, pH值的快速降低可以有效抑制青贮饲料蛋白质的降解, 从而降低氨态氮的含量。整个青贮过程中, 甲酸添加组水溶性碳水化合物含量显著高于其他组, 这主要是由于甲酸的快速酸化作用, 迅速降低pH值, 抑制青贮初期植物的呼吸作用和有害微生物的活性, 减少水溶性碳水化合物的损失, 这与Zhang等^[22]的研究结果一致。

3.2 添加剂对水稻秸秆青贮过程中结构性碳水化合物的影响

青贮过程中各组中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素和半纤维素含量逐渐升高, 这可能是由于青贮过程中随着有机物质的降解消耗, 相对提高了结构性碳水化合物各组分的含量。

不同的青贮添加剂降解结构性碳水化合物的作用机制不同^[19]。甲酸通过快速酸化青贮原料, 直接降低pH值, 进而酸解青贮饲料中部分纤维素和半纤维素, 释放水溶性碳水化合物。Desta等^[21]研究表明, 添加甲酸显著降低象草青贮饲料纤维素和半纤维素的含量, 显著增加水溶性碳水化合物含量。本试验整个青贮过程中甲酸添加组显示最低的半纤维素和纤维素含量及最高的水溶性碳水化合物含量, 尤其是青贮6 d后与对照组相比差异显著, 说明整个青贮过程中甲酸对结构性碳水化合物酸解作用的确存在。

乳酸菌添加组青贮6 d后半纤维素含量始终显著低于对照组, 但纤维素含量仅仅在青贮30 d时显著低于对照组, 水溶性碳水化合物含量略高于对照组, 这可能是由于添加乳酸菌制剂促进乳酸发酵, 乳酸的积累导致部分纤维素和半纤维素通过酸解作用被降解为水溶性碳水化合物。但乳酸与甲酸相比属弱酸, 其对结构性碳水化合物的降解程度低于甲酸。Yahaya等^[23]报道, 鸭茅青贮过程中随着乳酸等有机酸的积累, 结构性碳水化合物组分发生变化, 部分纤维素和半纤维素被酸解, 增加水溶性碳水化合物的含量。甲酸的酸性较强, 且是在青贮原料中加入, 酸解作用从青贮早期便开始一直持续至青贮结束, 而乳酸菌添加组乳酸等有机酸是逐渐积累的, 酸解作用主要发生在青贮后期。

纤维素酶能够通过酶解作用直接将青贮饲料中纤维素和半纤维素降解为水溶性碳水化合物, 导致本试验中加酶组(纤维素酶及其组合添加组)纤维素和半纤维素含量显著低于对照组, 但水溶性碳水化合物含量略高于对照组, 这是由于纤维素酶降解结构性碳水化合物释放水溶性碳水化合物的同时, 乳酸菌也在利用水溶性碳水化合物, 这从2组乳酸含量高于对照组得到了很好的印证。Stokes等^[24]报道酶和乳酸菌组合添加到全株玉米青贮中显著降低了中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量, 但并没有明显增加水溶性碳水化合物含量。酶制剂对于结构性碳水化合物的降解受到最适pH值的影响^[10]。一般来说, 对于结构性碳水化合物的酶解作用主要发生在青贮前期, 因为青贮前期pH值还没降到抑制酶活性的水平^[5]。本试验所使用纤维素酶的最适pH值为4.8, 青贮6 d后纤维素酶添加组和乳酸菌和纤维素酶组合添加组pH值分别降至4.52和4.17, 因此认为青贮后期纤维素酶的活性受到了一定的抑制。乳酸菌和纤维素酶组合添加组半纤维素和纤维素含量低于纤维素酶组, 表明组合添加有更多的半纤维素和纤维素被降解, 这可能是由于青贮过程中该组有更多的乳酸等有机酸生成, 对结构性碳水化合物的降解一部分是来自于酸解作用^[25]。

综上所述, 本试验添加甲酸能快速酸化水稻秸秆, 抑制有害微生物的活性, 减少青贮过程中水溶性碳水化合物损失和蛋白质的降解, 并对结构性碳水化合物具有明显的降解作用。添加乳酸菌明显改善了水稻秸秆青贮发酵品质, 乳酸菌和纤维素酶组合添加不仅提高青贮发酵品质, 而且对纤维素和半纤维素具有较明显的降解作用。

参考文献(References)

[1]	汪营, 张义鹏, 刘天义, 等. 体外发酵技术研究秸秆粗饲料营养价值及降解特性[J]. 畜牧与兽医, 2016, 48(12): 24-29. Wang Y, Zhang Y P, Liu T Y, et al. Evaluation of the nutritive value and dynamic digestibility characteristics of roughage forage by in vitro fermentation[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2016, 48(12): 24-29 (in Chinese with English abstract).

[2]	李蓓蓓, 李秋凤, 曹玉凤, 等. 玉米秸秆青贮饲料和谷草组合效应的研究[J]. 畜牧与兽医, 2017, 49(6): 32-38. Li B B, Li Q F, Cao Y F, et al. Associative effects study between corn straw silage and millet straw[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2017, 49(6): 32-38 (in Chinese with English abstract).

[3]	原现军, 闻爱友, 郭刚, 等. 添加酶制剂对西藏地区青稞秸秆和黑麦草混合青贮效果的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2013, 44(8): 1269-1276. Yuan X J, Wen A Y, Guo G, et al. Effect of adding cornzyme on fermentation and nutritive quality of mixed silage of hullessbarley straw and perennial ryegrass in Tibet[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2013, 44(8): 1269-1276 (in Chinese with English abstract).

[4]	Cai Y M. Development of lactic acid bacteria inoculant for whole crop rice silage in Japan[C]//Proceedings of the International Symposium on Production and Utilization of Whole Crop Rice for Feed, 2006: 85-89. https://www.researchgate.net/publication/317820271_Development_of_a_new_lactic_acid_bacterial_inoculant_for_fresh_rice_straw_silage

[5]	McDonald P, Henderson A R, Heron S J E. The Biochemistry of Silage[M]. Aberystwyth: Cambrian Printers Ltd., 1991.

[6]	Jaakkola S, Huhtanen P, Hissa K. The effect of cell wall degrading enzymes or formic acid on fermentation quality and on digestion of grass silage by cattle[J]. Grass and Forage Science, 2010, 46(1): 75-87.

[7]	肖慎华, 原现军, 董志浩, 等. 添加乳酸菌制剂和糖蜜对箭筈豌豆和苇状羊茅混合青贮发酵品质的影响[J]. 南京农业大学学报, 2016, 39(6): 1017-1022. Xiao S H, Yuan X J, Dong Z H, et al. Effects of inoculant and molasses additives on fermentation quality of mixed silages of tall fescue(Festuca arundinacea Schreb.)and common vetch(Vicia sativa L.)[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(6): 1017-1022 (in Chinese with English abstract). DOI:10.7685/jnau.201607038

[8]	朱春娟, 原现军, 董志浩, 等. 添加剂对饲料型四倍体刺槐青贮发酵品质和体外消化率的影响[J]. 南京农业大学学报, 2017, 40(4): 725-731. Zhu C J, Yuan X J, Dong Z H, et al. Effect of additives on fermentation quality and in vitro digestibility of tetraploid black locust(Robinia pseudoacacia L.)silage[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(4): 725-731 (in Chinese with English abstract). DOI:10.7685/jnau.201612012

[9]	王奇, 余成群, 李志华, 等. 添加酶和乳酸菌制剂对西藏苇状羊茅和箭筈豌豆混合青贮发酵品质的影响[J]. 草业学报, 2012, 21(4): 186-191. Wang Q, Yu C Q, Li Z H, et al. Effect of adding coenzyme and lactic acid bacteria on fermentation quality of mixed silages of tall fescue(Festuca arundinacea)and common vetch(Vicia sativa)in Tibet[J]. Acta Prataculture Sinica, 2012, 21(4): 186-191 (in Chinese with English abstract).

[10]	Kung L, Carmean B R, Tung R S. Microbial inoculation or cellulase enzyme treatment of barley and vetch silage harvested at three maturities[J]. Journal of Dairy Science, 1990, 73(5): 1304-1311. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(90)78796-6

[11]	Zhang Q, Yu Z, Yang H, et al. The effects of stage of growth and additives with or without cellulase on fermentation and in vitro degradation characteristics of Leymus chinensis silage[J]. Grass and Forage Science, 2016, 71(4): 595-606. DOI:10.1111/gfs.2016.71.issue-4

[12]	原现军, 余成群, 夏坤, 等. 添加青稞酒糟对西藏箭筈豌豆与苇状羊茅混合青贮发酵品质的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2012, 43(9): 1408-1414. Yuan X J, Yu C Q, Xia K, et al. Effect of adding wet hullessbarley distillers, grains on fermentation quality of common vetch(Vicia sativa)and tall fescue(Festuca arundinacea)in Tibet[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2012, 43(9): 1408-1414 (in Chinese with English abstract).

[13]	董志浩, 原现军, 闻爱友, 等. 添加乳酸菌和发酵底物对桑叶青贮发酵品质的影响[J]. 草业学报, 2016, 25(6): 167-174. Dong Z H, Yuan X J, Wen A Y, et al. Effect of lactic acid bacteria and fermentation substrates on the quality of mulberry(Morus alba)leaf silage[J]. Acta Prataculture Sinica, 2016, 25(6): 167-174 (in Chinese with English abstract).

[14]	Liu Q H, Shao T, Bai Y F. The effect of fibrolytic enzyme, Lactobacillus plantarum and two food antioxidants on the fermentation quality, alpha-tocopherol and beta-carotene of high moisture napier grass silage ensiled at different temperatures[J]. Animal Feed Science and Technology, 2016, 221: 1-11. DOI:10.1016/j.anifeedsci.2016.08.020

[15]	荣辉, 陈杰, 余成群, 等. 添加甲酸对象草青贮发酵品质的影响[J]. 草地学报, 2012, 20(6): 1105-1111. Rong H, Chen J, Yu C Q, et al. Effect of adding formic acid on fermentation quality of Napier grass[J]. Acta Agrestia Sinica, 2012, 20(6): 1105-1111 (in Chinese with English abstract).

[16]	Stokes M R. Effects of an enzyme mixture, an inoculant, and their interaction on silage fermentation and dairy production1[J]. Journal of Dairy Science, 1992, 75(3): 764-773. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(92)77814-X

[17]	Liu W J, Pang H L, Zhang H P, et al. Biodiversity of lactic acid bacteria[M]//Pang H L, Cai Y M. Lactic Acid Bacteria. Dordrecht: Springer, 2014: 103-203.

[18]	原现军, 王奇, 李志华, 等. 添加糖蜜对青稞秸秆和多年生黑麦草混合青贮发酵品质及营养价值的影响[J]. 草业学报, 2013, 22(3): 116-123. Yuan X J, Wang Q, Li Z H, et al. Effect of molasses addition on fermentation and nutritive quality of mixed silage of hulless barley straw and perennial ryegrass in Tibet[J]. Acta Prataculture Sinica, 2013, 22(3): 116-123 (in Chinese with English abstract).

[19]	Guo G, Yuan X J, Li L X, et al. Effects of fibrolytic enzymes, molasses and lactic acid bacteria on fermentation quality of mixed silage of corn and hulless-barely straw in the Tibetan Plateau[J]. Grassland Science, 2014, 60(4): 240-246. DOI:10.1111/grs.2014.60.issue-4

[20]	Yuan X, Yu C, Shimojo M, et al. Improvement of fermentation and nutritive quality of straw-grass silage by inclusion of wet hulless-barley distillers' grains in Tibet[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2012, 25(4): 479. DOI:10.5713/ajas.2011.11435

[21]	Desta S T, Yuan X J, Li J F, et al. Ensiling characteristics, structural and nonstructural carbohydrate composition and enzymatic digestibility of Napier grass ensiled with additives[J]. Bioresource Technology, 2016, 221: 447-454. DOI:10.1016/j.biortech.2016.09.068

[22]	Zhang Q, Yang H, Yu Z. Effects of sucrose, formic acid and lactic acid bacteria inoculant on quality, in vitro rumen digestibility and fermentability of drooping wild ryegrass(Elymus nutans Griseb.)silage[J]. Journal of Animal and Feed Sciences, 2017, 26(1): 26-32.

[23]	Yahaya M S, Kawai M, Takahashi J, et al. The effects of different moisture content and ensiling time on silo degradation of structural carbohydrate of orchardgrass[J]. Asian Australasian Journal of Animal Sciences, 2002, 15(2): 1-14.

[24]	Stokes M R, Chen J. Effects of an enzyme-inoculant mixture on the course of fermentation of corn silage 1[J]. Journal of Dairy Science, 1994, 77(11): 3401-3409. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(94)77282-9

[25]	Baytok E, Aksu T, Karsli M A, et al. The effects of formic acid, molasses and inoculant as silage additives on corn silage composition and ruminal fermentation characteristics in sheep[J]. Turkish Journal of Veterinary & Animal Sciences, 2014, 29(2): 469-474.