南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (1): 102-110   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201804025
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罗兴, 冯海超, 夏丽明, 张瑞福, 余光辉, 沈其荣, 张楠
LUO Xing, FENG Haichao, XIA Liming, ZHANG Ruifu, YU Guanghui, SHEN Qirong, ZHANG Nan
根际促生解淀粉芽胞杆菌SQR9对香蕉根系分泌物响应的转录组分析
Transcriptomic profiling of plant growth-promoting rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9 in response to banana root exudates
南京农业大学学报, 2019, 42(1): 102-110
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(1): 102-110.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201804025

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收稿日期: 2018-04-13
根际促生解淀粉芽胞杆菌SQR9对香蕉根系分泌物响应的转录组分析
罗兴 , 冯海超 , 夏丽明 , 张瑞福 , 余光辉 , 沈其荣 , 张楠     
南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物协同创新中心/教育部资源节约型肥料工程技术研究中心, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在阐明根系分泌物介导的植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)与宿主的互作机制。[方法]利用Illumina高通量测序技术研究促生解淀粉芽胞杆菌SQR9在体外振荡培养条件下对香蕉根系分泌物的转录响应特征,对显著差异表达基因的直系同源基因进行同源蛋白簇(COG)分析。通过Real-time PCR验证部分转录组测序结果,并研究分泌物代表性组分对部分差异基因表达的影响。[结果]香蕉根系分泌物可显著促进菌株SQR9在1/2 MSgg培养基中的生长。转录组测序结果表明:根系分泌物处理6 h后菌株SQR9中共有764个基因的表达发生了显著变化,占其基因总数的18.7%,其中上调与下调基因数量分别为485和279。Real-time PCR验证获得的基因表达差异趋势与转录组测序结果一致,证明其结果可信。菌株SQR9中受根系分泌物显著调控的差异基因主要属于碳水化合物转运与代谢、氨基酸转运与代谢、能量产生与转化、转录调控、信号转导和细胞运动等;此外,与促生/生防活性物质合成相关的部分功能基因也被分泌物所诱导。根系分泌物中的葡萄糖、木糖、赤藓糖醇和硬脂酸可诱导SQR9中部分代表性差异基因的表达,但整体的转录组调控现象是分泌物中不同组分共同作用的结果。[结论]香蕉根系分泌物可促进菌株SQR9的生长代谢、信号响应、根际趋化和活性物质合成,这些都有利于SQR9在香蕉根际的存活定殖和促生/生防功能发挥,有助于其与香蕉合作关系的建立。
关键词植物根际促生菌   解淀粉芽胞杆菌SQR9   香蕉根系分泌物   转录组   
Transcriptomic profiling of plant growth-promoting rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9 in response to banana root exudates
LUO Xing, FENG Haichao, XIA Liming, ZHANG Ruifu, YU Guanghui, SHEN Qirong, ZHANG Nan    
Jiangsu Provincial Key Lab of Solid Organic Waste Utilization/Jiangsu Collaborative Innovation Center of Solid Organic Wastes/Educational Ministry Engineering Center of Resource-saving fertilizers, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The purpose of this paper is to illustrate the mechanisms involved in root exudates-mediated interactions between hosts and plant growth-promoting rhizobacteria(PGPR). [Methods] The transcriptional profiling of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens SQR9 towards banana root exudates was analyzed by Illumina high-throughput transcriptome sequencing, genes with significantly different expression level in response to root exudates were examined by clusters of orthologous groups of proteins(COG) analysis. Real-time PCR was performed for validating partial of the sequencing results, as well as investigating the effects of the representative components in root exudates on the expression of several significant genes in SQR9. [Results] Banana root exudates significantly stimulate the growth of SQR9 in 1/2 MSgg medium. Transcriptome analysis indicated after treatment with root exudates by 6 h, 764 genes of SQR9 were detected to be significantly regulated, which covered 18.7% of the whole genome of SQR9 and included 485 of up-regulated genes while 279 down-regulated. Real-time PCR validation showed that the expression patterns of the selected genes were in accordance with the results of transcriptional profiling analysis, suggesting that the transcriptome data was reliable. Genes that significantly regulated by root exudates mainly belonged to carbohydrate transport and metabolism, amino acid transport and metabolism, energy production and conversion, transcription, signal transduction mechanisms, and cell motility. Additionally, partial of the genes involved in biosynthesis of functional compounds relating to plant growth-promotion/biocontrol were also activated by root exudates. Glucose, xylose, erythritol, and stearic acid in root exudates could induce the expression of several representative significant genes in SQR9, while the overall regulation in response to root exudates revealed in transcriptomic profiling was the results of interaction among different components in root exudates. [Conclusions] In conclusion, banana root exudates can stimulate the growth and metabolism, signal response, rhizosphere chemotaxis, and biosynthesis of functional compounds of strain SQR9, which will facilitate its survival, root colonization, and exertion of growth-promotion/biocontrol, as well as establishment of the symbiosis between SQR9 and banana.
Keywords: plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR)    Bacillus amyloliquefaciens SQR9    banana root exudates    transcriptome   

植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是一类能在植物根际存活定殖, 并具有促进植物生长或/及防控土传病害能力的一类有益微生物[1]。近年来, PGPR菌株因其环境友好、安全无毒等优点作为微生物肥料在农业生产中逐渐得到广泛应用, 在促进作物生长及防控土传病害等方面取得了良好的效果[2-3]。PGPR菌株在植物根际的成功定殖是其充分发挥促生与生防功能的保障, 深入了解菌株-植物之间的根际互作机制对于指导PGPR菌株的合理施用具有重要意义。研究发现根系分泌物是介导植物与根际微生物互作的重要媒介。如类黄酮类物质是诱导经典的豆科作物-根瘤菌共生关系建立的重要信号分子[4], 而独脚金内酯是促进丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)菌丝分支的信号[5]。对于其他根际微生物, 氨基酸和小分子有机酸(如苹果酸、柠檬酸等)可诱导有益假单胞菌向植物根表的趋化和定殖[6-7], 而苹果酸可增强枯草芽胞杆菌的生物膜形成能力和根表定殖能力[8-9]

近年来, 高通量分子生物学方法的成熟为研究微生物对根系分泌物响应的表达谱创造了便利条件。与传统的基因芯片或建库等方法比较, 高通量测序具有覆盖度高、通量大、周期短等优点, 可以更加全面和准确地反映目标菌株的基因表达情况[10]。Balsanelli等[11]利用转录组测序发现根际益生菌Herbaspirillum seropedicae在玉米根际定殖初期细胞中与氮代谢和聚羟基丁酸酯储存相关的基因表达量较高, 而定殖后的细胞其与多糖和外膜蛋白合成的相关基因表达发生了显著变化。Yi等[12]通过RNA-Seq发现马铃薯内生细菌相比非内生菌, 其对根系分泌物的响应更加明显, 而主要的差异表达基因涉及有机底物代谢、氧化还原、膜转运蛋白等。

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9是1株分离自黄瓜根际的PGPR菌株, 在盆栽和大田试验中有效促进植物生长和防控土传病害, 其与腐熟堆肥制成的生物有机肥已在农业生产中广泛应用[13]。香蕉是我国重要的经济作物, 由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, FOC)引起的香蕉枯萎病是制约香蕉产业的重要限制因子。菌株SQR9在对峙试验中能有效抑制FOC, 且在水培和土培试验中发现SQR9能有效定殖于香蕉根表[14]。本研究拟通过高通量转录组测序技术研究菌株SQR9对香蕉根系分泌物短期响应的基因表达谱变化, 以期进一步探明菌株SQR9与香蕉根系互作的分子机制。

1 材料与方法 1.1 试验材料

'巴西香牙蕉’(Musa AAA Cavendish cv. Brazil, 低抗香蕉枯萎病品种)组培苗, 由海南万钟实业有限公司提供。组培苗移栽至石英砂中后置于28 ℃光照培养箱中培养, 定期浇灌1/2的Hoagland营养液, 幼苗生长至3~4片真叶完全展开后待用。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心, CGMCC菌株编号5808。

Killing Buffer:Tris-HCl 20 mmol·L-1(pH7.5), 氯化镁5 mmol·L-1, 叠氮化钠20 mmol·L-1, 过滤除菌。LB培养基:蛋白胨10 g, 酵母粉5 g, NaCl 10 g, 琼脂25 g, 蒸馏水1 000 mL, pH7.0。MSgg培养基:磷酸钾缓冲液5 mmol·L-1(pH7.0), 3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)溶液100 mmol·L-1(pH7.0), 氯化镁2 mmol·L-1, 氯化钙700 μmol·L-1, 氯化锰50 μmol·L-1, 氯化铁50 μmol·L-1, 氯化锌1 μmol·L-1, 硫胺2 μmol·L-1, 甘油0.5%(体积分数), 谷氨酸5 g·L-1, 色氨酸50 μg·mL-1, 苯丙氨酸50 μg·mL-1。RNAwait:非冻型组织RNA保存液(购自北京索莱宝科技有限公司), 样品浸入其中置于4 ℃可保存4周, 期间RNA稳定不降解。其他试剂均进口分装或国产分析纯。

1.2 香蕉根系分泌物的收集

将香蕉幼苗从石英砂中轻轻取出, 用双蒸水仔细冲洗根部残留的石英砂。用棉花包裹植株茎部置于含有50 mL 1/2的Hoagland营养液的三角瓶中, 在28 ℃光照培养箱中培养3 d后, 取出幼苗, 用去离子水洗净根上的残留培养液。将每株幼苗移入1个盛有50 mL去离子水的三角瓶中, 使根系完全浸没。将三角瓶放入光照培养箱中, 28 ℃培养24 h, 其中光照16 h。共收集20株幼苗的根系分泌物, 收集完成后取出香蕉苗, 将1 000 mL收集液超滤除去根系碎片, 冷冻干燥后溶于20 mL超纯水, -70 ℃下保存待用。

1.3 香蕉根系分泌物对菌株SQR9生长的影响

LB培养基接种活化后的菌株SQR9, 37 ℃、170 r·min-1培养至对数中期(D600=1.0), 发酵液离心后, 将菌体重新悬浮在等体积的1/2 MSgg培养基中。按照1%(体积分数)的接种量接种于装有3 mL 1/2 MSgg培养基的试管中, 处理组添加60 μL浓缩的香蕉根系分泌物, 对照组添加60 μL无菌水。37 ℃、170 r·min-1培养4、6和8 h后, 测定各处理的菌液D600值, 每处理设置4个重复。

1.4 菌株SQR9对香蕉根系分泌物响应的转录组分析

共设置对照(CK)和添加香蕉根系分泌物(RE)2个处理。样品准备方法同1.3节, 37 ℃、170 r·min-1培养菌株SQR9 6 h后, 测定各试管中菌悬液的D600值, 除去明显生长异常的试管后, 每个处理分别合并收集菌悬液。CK和RE处理各收集15根试管的菌悬液(即每个样品包含约45 mL的菌悬液), 向每个样品中加入22.5 mL预冷的Killing Buffer快速杀死细胞并抑制转录。混合均匀后将菌悬液于4 ℃、5 000 r·min-1离心3 min, 浓缩并重新悬浮于1 mL RNAwait保存液, 4 ℃过夜处理。次日, 将2个菌悬液样品保存于干冰中, 送至国家人类基因组南方中心进行RNA提取、定量和Illumina测序。转录组数据与已知的SQR9全基因组序列进行比对, 统计每个基因中分别来自每个样品的序列数目, 转换成RPM(reads per million reads)值。最后, 利用DEGseq程序包中的MARS(MA-plot-based method with random sampling model)模型, 计算每个基因在2组样品中的表达丰度差异, 当基因的样本间差异结果同时满足以下3项条件时, 认定为具有显著性差异:表达差异倍数(fold change)≥2, 伪发现率(FDR, q value) < 0.001, 且该基因在至少1个处理中的RPM值≥10。同源蛋白簇(clusters of orthologous groups of proteins, COG)是基于蛋白质功能的相似性对蛋白进行分类[15]。因此, 本文对锚定参考基因组上的具有显著差异的基因进行蛋白功能分类统计, 探究差异表达基因的功能。同时, 选取COG分类中属于碳水化合物转运与代谢、氨基酸转运与代谢、能量产生与转化、转录、信号转导、细胞运动、次级代谢产物合成、转运与代谢或仅具预测功能类别的部分代表性差异基因, 用于后续热图绘制, 绘图利用MeV(Multi experiment viewer 4.8.1)软件完成。

1.5 转录组数据的Real-time PCR验证

选取部分基因通过Real-time PCR对转录组结果进行验证。留取1.4节中用于委托公司进行转录组测序的少量菌悬液样品, 用RNA提取试剂盒(Axygen)分别提取CK和RE处理的菌体RNA。利用反转录试剂盒(TaKaRa)进行反转录, 得到的cDNA采用核酸定量仪Thermo Scientific NANODROP 1000(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)进行定量。Real-time PCR靶标基因和所用引物见表 1。采用SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa), 扩增仪为ABI(Applied BIO systems)PRISM® 7500 Real-time PCR System。反应体系为20 μL, 包括:SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10 μL, 正、反向引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL, ROX reference dye Ⅱ(50×)0.4 μL, DNA 2 μL, ddH2O 6.8 μL。反应程序:95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 30个循环; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min; 95 ℃ 15 s。每个样品设3个重复, 以无菌水代替模板DNA为阴性对照。实时监测并记录荧光信号的变化。

表 1 本研究中所用的引物 Table 1 Primers used in this study
引物名称
Primers name
引物序列(5'→3')
Primer sequences
recA-F AAAAAACAAAGTCGCTCCTCCG
recA-R CGATATCCAGTTCAGTTCCAAG
sigW-F GGCAATGTTCACGAAGCGGAAG
sigW-R GCGGTCAATGGTCAGGTTGGT
comP-F AGGAGCCTTGCCAGTTAGAGGT
comP-R TGGATACCGCCTTGACCAGACC
kinC-F CATCACCTTTACCGCCGTCACA
kinC-R GCTTTCTGCTCGCTGTCCTTCA
ybgH-F TAAGTTCACGACCACCAT
ybgH-R GGGCAACTATTATTACGG
pyrP-F GGTGCTGAGTAAAGTCGT
pyrP-R GAGCAGGAAGGAAACG
ytmK-F TTGGCATTTGACAGCA
ytmK-R ACGGCATTGAGGACTT
mcpB-F GCAGGCGGAAGCGGTTGTAA
mcpB-R GCACTTCTTCGGCTACCACTGA
gapA-F GCACTTCTTCGGCTACCACTGA
gapA-R CTATGCGTGTGCCGACTCCAA
mlnB-F TCCTGTAAGCCGCCGTCCATT
mlnB-R TCAGACCGTTCAGCAGCATCCT
ysnE-F GCACAGCAAGGGTGGTTTGAAG
ysnE-F AGCCGAGCAGGATGCCGTTT
rapA-F CCCACTTAGAACTTGC
rapA-R AAATAGAATGCGGAAG
sigF-F ACATCCTCCGCATCAA
sigF-R GGAACCGTCAAAGTATCA
hag-F GCGGCTAACGACACGAACACT
hag-R CAGGTCAGTTGCTGTGCCATCA
1.6 香蕉根系分泌物中主要组分对菌株SQR9中部分差异基因表达的影响

利用Real-time PCR研究外源添加香蕉根系分泌物中主要组分对菌株SQR9中部分差异表达基因转录的影响。分泌物组分选择依据冯海超[16]的报道, 最终选取葡萄糖、木糖、赤藓糖醇和硬脂酸为供试物质。按照1.3节的方法制备菌株SQR9的菌悬液(D600=1.0), 按照1%的接种量接种于装有3 mL 1/2 MSgg培养基的试管中, 处理组分别添加葡萄糖、木糖、赤藓糖醇和硬脂酸至终浓度为1 mmol·L-1, 37 ℃、170 r·min-1培养6 h后, 按照1.5节所述方法提取菌体RNA, 完成反转录并通过Real-time PCR比较各处理候选基因sigWcomPkinCmcpBhaggapAmlnBysnE的表达差异, 所用引物见表 1

1.7 数据统计与分析

数据采用Excel 2013处理。采用SPSS 19.0软件进行t检验。

2 结果与分析 2.1 香蕉根系分泌物对菌株SQR9生长的影响

在1/2 MSgg培养基中添加浓缩的香蕉根系分泌物后可显著促进菌株SQR9的生长, 其中促进效果在接种后6 h最为明显, 增幅与对照相比达到29.4%(图 1)。推测根系分泌物中碳、氮源或其他物质对菌株SQR9的生长起到了诱导和刺激作用。

图 1 香蕉根系分泌物对菌株SQR9在1/2 MSgg培养基中生长的影响 Fig. 1 Effects of banana root exudates on the growth of strain SQR9 in 1/2 MSgg medium**P < 0.01.
2.2 菌株SQR9对香蕉根系分泌物响应的转录组测序分析

对照(CK)和添加60 μL浓缩香蕉根系分泌物(RE)处理组高通量测序结果(图 2)表明:所得序列平均长度约为100 bp, 每个样品reads数目都在1 000万条左右, 则每个样品的总信息量约为1 G。采用Illumina自带软件包对测序reads进行低质量值碱基及接头序列的去除。获得的Clean reads与菌株SQR9的全基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/cp006890)比对后得到的有效序列占总序列的比例为65%以上, 满足后续数据分析的要求。通过软件分析菌株SQR9中所有基因在2个处理间的表达量差异, 以明确外源添加浓缩香蕉根系分泌物对SQR9基因表达的影响。经软件分析后共筛选到764个差异基因, 约占SQR9基因总数的18.7%;其中RE处理与CK相比表达显著上调的基因有485个(11.9%), 显著下调的基因有279个(6.8%)。

图 2 菌株SQR9在香蕉根系分泌物处理和CK中所有基因的表达差异 Fig. 2 Scatter diagram of gene expression in strain SQR9 in control and banana root exudates treatment RPM:每百万reads中来自某基因的reads数。红色散点为添加香蕉根系分泌物后显著上调的基因; 蓝色散点为2个样品之间差异不显著的基因; 绿色散点为添加分泌物后显著下调的基因。 RPM:Reads per million reads. Red scatters are the genes that are significantly up-regulated after adding banana root exudates, blue scatters are the genes that have no significant difference between two samples, and green scatters are the genes that are significantly down-regulated after adding banana root exudates.
2.3 菌株SQR9对香蕉根系分泌物响应的转录组结果的Real-time PCR验证

分别提取CK和RE处理组剩余少量菌悬液样品的RNA, 进行反转录后通过定量PCR验证部分差异表达基因的表达情况。结果(表 2)表明:定量PCR获得的基因表达倍数差异普遍高于转录组测序, 但二者趋势非常吻合, 说明本次转录组测序获得结果可靠度较高。

表 2 转录组测序与定量PCR部分基因的表达差异倍数 Table 2 Fold changes of differentially expressed genes obtained by Illumina RNA-Seq and Real-time PCR
基因Gene 基因差异倍数(log2)Fold changes of genes expression(log2)
转录组测序RNA-Seq 定量PCR Real-time PCR
ybgH -2.12 4.52±0.36
rapA 1.20 2.14±0.35
pyrP 3.50 4.86±0.61
sigF -1.14 -3.18±0.41
gapA 2.44 2.21±0.17
comP 1.32 2.94±0.28
ytmK -11.70 -8.27±0.57
2.4 菌株SQR9响应香蕉根系分泌物后差异表达基因的同源蛋白簇(COG)分析

对SQR9转录组测序中锚定到各自基因组上的reads进行COG功能分类(图 3)。从整体上看, 具有COG分类的差异表达基因总数为582个, 占全部差异表达基因数量的76.2%, 其中COG功能明确的差异表达基因数量总数为459个, 约占全部差异表达基因数量的60.1%。对不同COG分类的差异表达基因进行数量统计发现, 较多的已知功能差异表达基因属于代谢(metabolism)大类, 约占所有具有COG分类差异基因的47.8%, 其中主要属于氨基酸转运与代谢(12.0%)、能量产生与转化(8.4%)、碳水化合物转运与代谢(7.2%)3个分类。另有6个COG分类的差异表达基因数量也比较多, 分别是与转录调控(7.6%)、信号转导(4.5%)、细胞壁/膜/被膜生物合成(4.5%)和翻译后修饰/蛋白周转/分子伴侣(4.5%)相关的基因。此外, 具有COG分类的差异表达基因中还包括相当数量的只具有预测功能(12.2%)和功能未知(8.9%)的基因。

图 3 菌株SQR9中被香蕉根系分泌物显著调控的差异基因的同源蛋白簇(COG)统计 Fig. 3 Distribution in various clusters of orthologous groups of proteins(COG)annotation of genes altered by banana root exudates in strain SQR9

对比各COG功能明确分类中上调与下调基因的比例后发现, 转录调控、复制、重组和修复、防御机制、信号转导、细胞壁/膜/被膜生物合成、细胞运动性、核酸转运与代谢和次级代谢产物合成、转运与代谢等分类中上调基因总数是下调基因总数的3倍以上, 特别是复制、重组和修复、细胞运动和次级代谢产物合成等类别绝大部分差异基因均为上调基因(图 4), 表明细胞的相关生理过程在根系分泌物的诱导作用下变得更加活跃。另一方面, 显著下调的基因类群主要属于翻译后修饰/蛋白周转/分子伴侣和无机离子转运与代谢(图 4), 说明细胞中该类基因在添加根系分泌物后受到抑制。此外, 其他类别中上调和下调基因在数量上较为均衡, 说明菌株SQR9中的相关基因对根系分泌物中的物质产生了不同的响应, 从而及时适应变化的环境并逐步发挥功能。

图 4 对照和香蕉根系分泌物处理组SQR9中差异表达基因的COG功能分类 Fig. 4 Distribution of differentially expressed genes in COG functional categories between control and banana root exudates treatments in strain SQR9
2.5 响应香蕉根系分泌物后菌株SQR9差异表达基因的分析

图 5可知:在信息存储和进程(information storage and processing)大类中, 转录调控方面共有44个基因被显著调控, 其中34个基因显著上调, 10个基因显著下调。代表性的基因主要包括一些RNA聚合酶的sigma因子, 如sigWsigMsigEsigF等。

图 5 菌株SQR9中响应香蕉根系分泌物的代表性差异表达基因 Fig. 5 Heatmap of representative genes in strain SQR9 that significantly regulated by banana root exudates 每个基因的颜色代表其在根系分泌物处理与对照的表达倍数差异。A.碳水化合物转运与代谢; B.氨基酸转运与代谢; C.能量产生与转化; D.转录; E.信号转导; F.细胞运动; G.次级代谢产物合成、转运与分解代谢; H.仅具预测功能。 The color bar indicates the ratio of expression level of each gene between the presence of root exudates and its absence. A. Carbohydrate transport and metabolism; B. Amino acid transport and metabolism; C. Energy production and conversion; D. Transcription; E. Signal transduction; F. Cell motility; G. Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; H. General function prediction only.

在细胞过程与信号(cellular processes and signaling)大类中, 信号转导中共有26个基因对根系分泌物有明显响应, 其中20个基因表达显著上调, 代表性基因包括编码调控芽胞形成与生物膜形成的组氨酸激酶的kinC(上调), 编码芽胞杆菌群体感应因子AI-2的luxS(下调)和编码介导芽胞杆菌细胞感受态形成与脂肽类抗生素surfactin合成的两组分调控系统的comAcomP(上调)等(图 5-E)。细胞运动共有21个基因被显著调控, 其中20个为上调, 主要包括编码鞭毛不同组分的相关基因。如:motB(编码鞭毛马达)、fliF(鞭毛M环)、fliD(鞭毛挂钩)和hag(鞭毛蛋白)等。另外, 还涉及趋化受体蛋白相关基因(mcpCmcpAmcpB), 以上基因均为显著上调(图 5-F)。

代谢(metabolism)大类中, 能量产生与转化类别中共有49个基因被显著调控, 上、下调基因数量分别为22、27。其中, 参与三羧酸循环的基因citA(编码柠檬酸合酶)、citB(乌头酸水合酶)、pdhApdhC(均为丙酮酸脱氢酶)大多数为上调, 参与糖异生作用的pckA(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)也为上调。碳水化合物转运与代谢类别中共有42个差异表达基因, 其中28个为显著上调基因。参与糖酵解的gapA/gapB(3-磷酸甘油醛脱氢酶基因)、eno(磷酸丙酮酸水合酶基因)、tpiA(磷酸丙糖异构酶基因)和pgk(磷酸甘油酸激酶基因)均为上调。氨基酸转运与代谢类别中共有70个基因被显著调控, 其中大部分(46个)为下调。ddpB(编码寡肽转运透性酶基因)和ytmN(胱氨酸ABC转运蛋白基因)下调倍数都在600倍以上, 而编码甘氨酸ABC转运蛋白的opuAA和亚精胺合成酶的speE则为上调。次级代谢产物合成、转运与代谢类别共有14个基因表达发生显著变化, 其中12个基因为上调, 主要包括合成聚酮类抗生素macrolactin的相关基因(mlnBmlnC)以及合成新型脂肪酸抗生素的相关基因(图 5-G)。

在无明显特征(poorly characterized)大类中, 仅具预测功能类别中共有71个基因表达差异显著, 上调与下调基因分别为34和37。其中, 负责生长素吲哚乙酸(IAA)合成的ysnE表达显著上调, 而与细胞自溶有关的ysbA则显著下调(图 5-H)。

2.6 香蕉根系分泌物中主要组分对菌株SQR9中部分差异基因表达影响的定量PCR分析

在前述转录组测序的基础上, 为进一步探究香蕉根系分泌物中调控菌株SQR9基因表达的主要组分, 选取分泌物中各主要类别(糖类、糖醇、有机酸等)的代表性组分, 包括葡萄糖、木糖、赤藓糖醇和硬脂酸[16], 处理菌株SQR9后通过定量PCR研究代表性差异基因的表达情况(图 6)。结果表明:葡萄糖对gapA(编码参与糖酵解的3-磷酸甘油醛脱氢酶)有一定抑制作用。木糖可上调mcpB(编码趋化受体蛋白)、mlnBysnE(介导IAA合成)的表达, 而sigW(编码RNA聚合酶的sigma因子)、hag(编码鞭毛蛋白)和gapA下调表达。赤藓糖醇能显著激活mcpBysnE, 对comP(介导芽胞杆菌细胞感受态形成和脂肽类抗生素surfactin合成)也有一定诱导作用, 但同时抑制了sigWgapAmlnB的表达。硬脂酸上调comPmcpBmlnBysnE基因的表达, 同时下调kinCsigWhaggapA基因的表达。

图 6 4种香蕉根系分泌物主要组分对解淀粉芽胞杆菌SQR9部分差异基因表达影响的定量分析 Fig. 6 Quantification analysis of differential gene expression in B.amyloliquefaciens SQR9 treated with four main components of banana root exudates
3 讨论

根系分泌物是介导植物-微生物根际互作的重要媒介[17], 关于不同植物与PGPR菌株之间的根际互作机制一直是生命科学研究领域的热点[18]。近年来, 基于深度测序技术的RNA-Seq的兴起与发展为研究微生物的转录组和表达谱创造了便利的条件[12, 19]。本研究利用Illumina高通量测序技术研究了SQR9在体外振荡培养条件下对香蕉根系分泌物的转录响应特征。结果表明, 菌株SQR9中被根系分泌物调控的主要基因类群包括代谢、转录调控、信号转导和细胞壁/膜/被膜生物合成等。其中代谢大类中的差异表达基因主要属于碳水化合物转运与代谢、氨基酸转运与代谢以及能量产生与转化3类, 均是微生物基础代谢中的关键基因。上述基因被香蕉根系分泌物诱导显著上调, 说明分泌物中的糖类及氨基酸组分诱导相关代谢途径基因的表达, 刺激了细胞代谢, 与香蕉根系分泌物能显著促进菌株SQR9在1/2 MSgg培养基中生长的现象相吻合。Zhang等[19]也发现玉米根系分泌物可增强SQR9的生物膜形成, 且处理24 h后SQR9中与物质代谢相关基因的表达量发生了显著上调。其他以不同作物根系分泌物和菌株进行的研究也都发现了类似的现象[12, 20]。植物将自身耗费能量合成的部分光合产物以根系分泌物的形式释放到根际环境中, 是一种吸引土壤中有益微生物群落向植物根际趋化并在根表定殖的"筹码", 从而与土壤微生物建立互利共生的合作关系。在这些物质存在的条件下, 土壤微生物相关的代谢基因势必会发生变化。

根系分泌物不仅可为根际微生物提供碳源与能量, 其中的很多低浓度的物质还可作为信号分子调控微生物的生理行为。如类黄酮类物质、独脚金内酯和小分子有机酸分别是启动根瘤菌、菌根真菌和根际芽胞杆菌与对应宿主互作关系建立的重要信号分子[4-5, 9]。本试验中菌株SQR9在与香蕉根系分泌物短时间接触(6 h)后, 其26个与信号转导相关的基因表达发生了显著变化, 包括调控芽胞形成和生物膜形成的组氨酸激酶的kinC(上调)[21]、编码芽胞杆菌AI-2群感因子的luxS(下调), 以及编码介导芽胞杆菌细胞感受态形成与脂肽类抗生素surfactin合成的两组分调控系统的comPA(上调)[22]等。上述基因的表达调控有助于菌株SQR9形成生物膜和合成拮抗物质, 从而有助于其更好地适应根际环境并定殖于作物根表[23-24]。前人的研究也发现植物根系分泌物能够影响不同根际微生物的信号转导系统从而调控下游信号行为, 如Mwita等[25]发现玉米根系分泌物激活了根际促生芽胞杆菌B.atrophaeus UCMB-5137的全局性两组分调控系统DegSU, 后者则进一步调控细胞的群体感应、胞外基质分泌和生物膜形成等行为。

本研究还发现香蕉根系分泌物可诱导菌株SQR9中大量与细胞运动相关基因的表达, 包括编码鞭毛不同组分蛋白和不同趋化受体蛋白的基因。其他学者也报道了根系分泌物可上调不同根际细菌中与趋化和运动相关基因的表达[19], 特别是在较短时间处理的条件下, 这些基因的表达有利于菌体细胞增强运动性并向植物根系游动, 为后续的根表定殖做好充分准备[14]

另外, 在与PGPR发挥促生/生防功能相关的活性物质合成基因方面, 菌株SQR9中合成拮抗同种细菌的新型脂肪酸类抗生素的pks4基因簇、合成抗真菌聚酮类抗生素macrolactin的mln基因簇, 以及与生长素IAA合成相关的ysnE基因均被香蕉根系分泌物显著上调[26]。该现象说明宿主植物可以通过根系分泌物诱导根际有益菌产生促生物质和拮抗物质, 从而有利于自身生长, 并预先启动抵御机制, 减少根系被病原菌侵染的概率。

在菌株SQR9响应香蕉根系分泌物的转录组分析基础上, 试图探究分泌物中影响SQR9基因表达的主要组分。结合冯海超[16]的研究结果, 选取香蕉根系分泌物的葡萄糖、木糖、赤藓糖醇和硬脂酸作为供试信号, Real-time PCR结果表明部分物质对靶标基因有一定诱导作用, 如编码趋化受体蛋白的mcpB和负责IAA合成的ysnE可被这4种物质诱导上调, 同时, 根系分泌物中的另一主要组分色氨酸作为IAA合成的重要底物, 也能显著上调ysnE的表达[27], 木糖和硬脂酸还可诱导mlnB的表达。部分转录组测序中受根系分泌物显著诱导的基因(sigWgapA等)也表现出下调趋势, 推测可能是根系分泌物中的其他组分发挥了诱导作用。整体上, 香蕉根系分泌物调控菌株SQR9的基因表达是其中各种不同组分相互作用的结果。

综上所述, 本研究发现香蕉根系分泌物可显著促进菌株SQR9在1/2 MSgg培养基中的生长, SQR9中与细胞代谢、信号转导、趋化运动和促生/拮抗活性物质合成方面的基因表达均被诱导, 说明香蕉根系分泌物可刺激菌株SQR9的生长代谢、根际趋化和活性物质合成, 这些都有利于SQR9在香蕉根际的存活定殖和促生/生防功能发挥, 有助于其与香蕉合作关系的建立。

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