文章信息
- 叶珂祯, 王宗秀, 陈熙, 张炜
- YE Kezhen, WANG Zongxiu, CHEN Xi, ZHANG Wei
- 单壁碳纳米管对莱茵衣藻光合产氢的影响
- Effects of single-walled carbon nanotubes on photosynthetic hydrogen production in Chlamydomonas reinhardtii
- 南京农业大学学报, 2019, 42(1): 94-101
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(1): 94-101.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201804018
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文章历史
- 收稿日期: 2018-04-10
随着化石燃料如煤炭和石油储量逐渐枯竭, 寻找可替代的新型能源迫在眉睫。氢气作为一种新型能源, 因安全、清洁、高效优势, 其已成为研究和开发的焦点。已知绿藻如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)在缺氧条件下能够表达[Fe-Fe]氢化酶, 该酶催化水光解产生的电子与质子结合从而产生氢气[1-2]。然而, 在衣藻正常生长条件下, 氢化酶受到光合作用副产物氧气的抑制, 因此产氢过程只能维持极短时间[3]。为达到在衣藻中持续产氢的目的, 目前主要采取内、外2种策略。外部策略主要是调节培养基中营养元素的含量。研究发现, 缺硫会缩短衣藻光系统Ⅱ(PSⅡ)核心蛋白的周转, 降低PSⅡ的活性, 在氧气消耗保持稳定的前提下逐渐耗尽培养液中的氧气, 这样的无氧状态可以诱导细胞内氢化酶表达。在持续光照前提下, 氢化酶接受来自光解和淀粉降解的电子, 将质子还原为氢, 从而维持氢气的产生可达数天[4]。内部策略则是通过调控光合作用相关蛋白的表达从而影响光合产氢。例如:莱茵衣藻高效产氢突变体Stm6Glc4T7, 其捕光天线复合物LHCBM1/2/3的含量适度降低, 可以减少光合放氧量, 促进诱导氢化酶表达, 较快建立产氢条件[5]。该突变体与野生型衣藻相比其产氢量提高10倍以上[6]。衣藻突变体Stm6中, 围绕光系统Ⅰ(PSⅠ)的环式电子传递被抑制, 从而增加了由PSⅠ传递到铁氧还原蛋白(Fd)的电子含量, 使产氢量提高约9倍[7]。此外, 有研究表明过表达Fd也能明显提高莱茵衣藻产氢量[8]。
纳米材料具有独特的吸收光谱和良好的导电性, 是构建人工光合体系常用的材料。Liu等[9]利用无机纳米线形成的半导体网格, 可以在不借助其他电子载体的情况下实现水的光解。Svedruži Ac'等[10]将金属型单壁碳纳米管(m-SWCNT)和半导体型单壁碳纳米管(s-SWCNT)按一定的比例混合后, 利用超声喷雾的方法喷涂在碳纤维布上形成网络结构, 对比分析证明, 氢化酶固定在m-SWCNT网络上其活性提高10倍以上。这些研究表明, 在单壁碳纳米管和氢化酶之间传递电子是可行的。除了上述人工体系, 将纳米材料导入生物体系也常用于提高光合效率。为了将单壁碳纳米管有效导入细胞, 可对其进行共价和非共价修饰。Liu等[11]观察到SWCNT/FITC和SWCNT/DNA复合物均可高效进入烟草悬浮细胞中, 且组装有SWCNT/FITC和SWCNT/DNA的烟草悬浮细胞, 其细胞形态、细胞质流动性和增殖速度均正常。Giraldo等[12]研究证明经ssDNA(AT)15或壳聚糖修饰后的单壁碳纳米管(SWCNT)能进入拟南芥叶绿体内, 而定位在叶绿体的SWCNT显著提高了叶片的光合作用效率, 最大电子传递速率提高了30%。
本研究对单壁碳纳米管进行了单链DNA包裹, 并将包裹前、后的单壁碳纳米管分别与莱茵衣藻共培养, 研究其对衣藻生长、光合作用及光合产氢的影响, 以期为利用藻类进行高效产氢提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料单壁碳纳米管(SWCNT, 直径0.8~1.2 nm, 长度100~1 000 nm, 催化剂Fe含量小于35%)由高压一氧化碳法(HiPco)制备, 购自南京先丰纳米材料科技有限公司。ssDNA(AT)15由通用生物系统(安徽)有限公司合成。莱茵衣藻GY-D55(Chlamydomonas reinhardtii)购自上海光语生物科技有限公司。
1.2 ssDNA/SWCNT的制备制备方法参照文献[13-17], 将ssDNA(AT)15用超纯水配置成1 mg·mL-1。称取1 mg SWCNT加入到1 mL ssDNA溶液中, 冰浴超声2 h, 12 000 r·min-1离心2 h去除未结合的SWCNT。将上清液置于超滤离心管(截留蛋白相对分子质量为100×103)4 500 r·min-1离心15 min, 以除去游离的ssDNA。ssDNA/SWCNT经冷冻干燥后, 4 ℃避光保存备用。
1.3 透射电子显微镜观察取SWCNT和ssDNA/SWCNT加入到纯水中, 超声处理5 min, 滴于碳支持膜铜网, 在室温下进行干燥, 透射电子显微镜(Hitachi H7650, 日本Hitachi公司)在100 kV加速电压下观察, 使用CCD相机记录图像。
1.4 紫外-可见光谱测定使用BIOMATE 3S紫外-可见光核酸蛋白分析仪检测SWCNT和ssDNA/SWCNT在200~800 nm的吸光值。
1.5 拉曼光谱分析使用拉曼光谱仪(InVia, 英国Renishaw公司)检测SWCNT和ssDNA/SWCNT的纯度以及管壁残缺情况。激光器波长514 nm; 光栅类型为1 800 l·mm-1; 光谱范围为100~4 000 nm。
1.6 Zeta电位测定将浓度为0.1 mg·mL-1的ssDNA/SWCNT和SWCNT分别进行超声处理并在室温下静置5 d后, 使用Zeta电位仪(Zetasizer Nano ZS90, 英国Malvern Panalytical公司)分别测定SWCNT和ssDNA/SWCNT溶液体系的Zeta电位。
1.7 莱茵衣藻与ssDNA/SWCNT和SWCNT共培养莱茵衣藻GY-D55培养在TAP培养基中。将纯化的单克隆藻株接种于液体培养基进行培养, 条件为:温度(25±2)℃, 光/暗培养时间14 h/10 h, 光照强度60 μmol·m-2·s-1, 培养周期7 d[18]。将ssDNA/SWCNT和SWCNT悬浮于超纯水中, 超声处理使其分散后配制浓度为10和50 μg·mL-1的悬浮液。在无菌条件下, 取培养至对数生长期的莱茵衣藻, 离心收集藻体, 以5×105 mL-1的细胞数分别加至上述碳纳米管悬浮液中, 随后将其放置在光照培养箱中进行常规培养[19-20]。
1.8 ssDNA/SWCNT和SWCNT对莱茵衣藻生长的影响2种形态SWCNT与莱茵衣藻共孵育后, 每隔24 h取藻液进行叶绿素含量的测定[21]。使用光学显微镜观察莱茵衣藻的生长状况, 并使用相机拍照记录。
1.9 ssDNA/SWCNT和SWCNT在莱茵衣藻中的分布2种形态SWCNT(10 μg·mL-1)与莱茵衣藻共培养6 d后, 离心去除多余的碳纳米管。用PBS(pH7.2)清洗3次, 2.5%戊二醛4 ℃固定过夜, 电镜制样后在透射电子显微镜(Hitachi H7650, 日本Hitachi公司)下观察。
1.10 ssDNA/SWCNT和SWCNT对莱茵衣藻光合产氢的影响将衣藻培养在含10 μg·mL-1ssDNA/SWCNT或SWCNT的TAP培养基中至对数生长中期, 离心收集藻细胞, 用TAP缺硫培养基(TAP-S)洗涤3次, 悬浮后测定叶绿素含量。藻液按照每瓶0.5 mg叶绿素的浓度分装至产气培养瓶中, 密闭黑暗处理24 h, 随后将藻液放置于30 μmol·m-2·s-1光照强度下进行持续光照。微量进样针抽取产气瓶上方的气体, 立即打入气相色谱仪(GC7900, 上海天美科学仪器有限公司)测定氢气含量[22]。
1.11 ssDNA/SWCNT和SWCNT对莱茵衣藻光合作用的影响取产氢培养1、3和7 d的衣藻细胞3 mL, 加入液相氧电极仪(Chlorolab-2, 英国Hansatech)反应杯中, 黑暗处理5 min后测定反应杯中溶解氧的消耗速率, 然后向反应杯中加60 μL 0.5 mol·L-1 NaHCO3, 测定30 μmol·m-2·s-1光照强度下的光合放氧情况, 反应体系温度为25 ℃[23]。利用浮游植物分类荧光仪(PHYTO-PAM, 德国Walz公司)测定叶绿素荧光参数。将衣藻与ssDNA/SWCNT或SWCNT共培养至对数生长中期后进行缺硫处理, 取产氢培养1、3和7 d的藻液, 暗适应5 min后测定Fo和Fm, 并计算PSⅡ光化学量子产量[Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm]和最大相对电子传递速率(ETRmax)[24-25]。
1.12 数据的统计与分析每个试验至少重复3次, 每组设置3个重复。所有试验数据均使用平均值±标准差(x±SD)表示。利用SPSS 16.0统计软件中的单因素方差分析(one way ANOVA)对试验结果进行方差分析和差异显著性检验。
2 结果与分析 2.1 SWCNT和ssDNA/SWCNT的理化性质比较对单壁碳纳米管进行单链DNA修饰后, 透射电子显微镜观察其超微结构, 结果显示修饰前、后2种SWCNT结构存在较大差异:SWCNT为多层重叠结构, 且存在黑色无定型碳颗粒, 为SWCNT制备时残留的杂质。经ssDNA修饰的SWCNT呈单层均匀分布, 无定型碳颗粒较少(图 1-A)。拉曼光谱分析证明SWCNT呈现几个特征峰(图 1-B):不规则峰(D band:1 350 cm-1), 石墨烯峰(G band:1 580 cm-1), G'峰(2 700 cm-1), 径向呼吸模式峰(RBM band, Radical breathing mode, < 300 cm-1)[26]。ssDNA/SWCNT的ID/IG值(0.151)小于SWCNT的ID/IG值(0.287), 说明ssDNA修饰能减少无定形碳等杂质, 提高SWCNT的纯度。
紫外-可见光谱分析显示:ssDNA/SWCNT在260 nm处存在紫外吸收峰, 证明SWCNT已被ssDNA包裹(图 2-A)。将2种纳米管悬浮在纯水中, ssDNA/SWCNT能在室温下稳定悬浮5 d以上, 而SWCNT在30 min内全部沉降到离心管底部(图 2-B)。与此现象一致, ssDNA/SWCNT在水中的Zeta电位为(-56.66±0.14)mV(pH5.71), 而SWCNT的Zeta电位为(-12.54±2.11)mV(pH5.51)。根据文献[26], Zeta电位绝对值大于30 mV的水溶液体系具有良好的稳定性。这说明SWCNT在水溶液中易团聚沉降, 而ssDNA修饰提高了SWCNT在水溶液中的稳定性和分散性。
2.2 SWCNT和ssDNA/SWCNT对莱茵衣藻生长的影响莱茵衣藻GY-D55在TAP液体培养基中培养, 培养全程与ssDNA/SWCNT或SWCNT共同孵育, 每隔24 h测定叶绿素含量。如图 3-A所示, 衣藻在接种后4 d进入对数生长后期(平台期), 使用不同浓度(10和50 μg·mL-1)的ssDNA/SWCNT或SWCNT分别处理莱茵衣藻后, 对其生长均具有轻微抑制作用, 但ssDNA/SWCNT的抑制作用小于SWCNT。通过光学显微镜观察, ssDNA/SWCNT(10 μg·mL-1)处理衣藻细胞后, 细胞形态正常, 而SWCNT处理会使衣藻细胞聚集成团(图 3-B)。上述结果表明, DNA包裹前、后的单壁碳纳米管对莱茵衣藻细胞仅具有低毒性, 不会显著影响衣藻的正常生长。
为了探究ssDNA/SWCNT和SWCNT能否进入莱茵衣藻细胞, 我们分别将ssDNA/SWCNT、SWCNT与莱茵衣藻共培养6 d, 洗涤后利用透射电镜观察纳米管的分布。从图 4可见:在细胞内没有观察到SWCNT的分布, 而ssDNA/SWCNT能够穿过细胞壁, 定位于细胞壁和细胞膜间隙。这一结果也提示, SWCNT可能通过附着在莱茵衣藻细胞表面, 从而引起细胞聚集成团, 而ssDNA/SWCNT能够穿过细胞壁, 因此不会在细胞表面附着, 也不会引起细胞聚集(图 3-B)。
2.3 单壁碳纳米管对莱茵衣藻光合产氢的影响将ssDNA/SWCNT和SWCNT分别加入莱茵衣藻培养体系, 共培养至对数生长中期, 随后进行密闭缺硫培养。如图 5所示, 对照组和处理组均从密闭缺硫培养3 d开始产氢, 至13 d处理组产氢量达到390 μL·mg-1。与对照相比, 添加ssDNA/SWCNT或SWCNT均可增加莱茵衣藻的产氢量, 但SWCNT的效果更加明显, 在7 d对照组产氢量为50 μL·mg-1, SWCNT处理组产氢量为260 μL·mg-1。
为了探明DNA包裹前、后的SWCNT影响莱茵衣藻光合产氢的原因, 我们分析了上述产氢条件下, 纳米材料添加前、后莱茵衣藻光系统Ⅱ(PSⅡ)活性及电子传递速率。如图 6所示, 缺硫密闭的条件影响了衣藻PSⅡ活性, 其光化学量子产量仅为0.7, 这也是诱导产氢的前提条件。DNA包裹前、后的SWCNT进一步降低了PSⅡ的光化学量子产量(Fv/Fm)和最大电子传递速率(ETRmax)。与这一结果(图 6)相一致, DNA包裹前、后的SWCNT均导致衣藻呼吸耗氧速率显著大于对照, 而净光合速率进一步下降(图 7)。
上述结果证明, DNA包裹前、后的SWCNT可以通过抑制PSⅡ活性, 导致细胞减少光合放氧的同时提高呼吸耗氧速率, 诱导衣藻细胞加快建立缺氧状态, 从而提高产氢量。
3 讨论莱茵衣藻光合产氢进入实际应用的关键, 是在现有基础上进一步提高产氢效率。在维持呼吸耗氧的前提下抑制PSⅡ活性从而建立缺氧环境, 是诱导氢化酶表达进而催化产氢的重要策略。因此, 如何快速建立缺氧条件以及在缺氧环境中增加流向氢化酶的电子数量已成为研究者关注的焦点[11]。目前, 除了缺硫处理, 针对PSⅡ亚基抑制表达的正向或反向遗传学方法是影响PSⅡ活性的常用方法。另外, 在降低PSⅡ活性以维持低氧环境的常规条件下, 通过直接或间接途径增加流向氢化酶的电子数量也是提高产氢效率的策略。单壁碳纳米管(SWCNT)因其优异的可见光吸收谱和激发光电子的能力, 在开发为氢化酶电子供体方面极具潜力[12]。已有的报道主要集中在体外构建产氢体系, 将SWCNT引入衣藻细胞内观察其对光合产氢的影响尚未见报道。本研究对商品化HiPco SWCNT进行单链DNA修饰, 并对其理化性质进行了表征。结果显示单链DNA包裹不仅能去除SWCNT样品在合成过程中残留的无定型碳颗粒杂质, 而且提高了SWCNT的纯度。这种修饰方法能促进SWCNT在溶液中呈现单一离散, 改变未经修饰的SWCNT在溶液中迅速团聚并沉降的特性。研究表明对纳米材料进行化学修饰能增加其稳定性和分散性, 这是减少或避免纳米材料自身毒性的重要手段[27-28]。因此, 这种高度分散的ssDNA/SWCNT有可能作为载体传递药物或小分子物质, 在生物和医学领域具备广泛的应用价值。
许多研究报道了碳纳米管对藻类的毒害作用[29], 以具有生物相容性的表面活性剂或聚合物对碳纳米管进行功能化修饰可以增强其分散性和减弱其毒性[30-31]。我们的试验结果证明SWCNT对莱茵衣藻仅具有低毒性, 会轻微抑制衣藻的生长。电镜结果显示SWCNT不能进入衣藻细胞, 因此可能由于吸附在细胞表面而导致后者聚集成团, 但这样的聚集在共培养后期逐渐消失(结果未列出), 因此并没有显著影响衣藻的生长。已有研究证明经ssDNA包裹且直径较小的碳纳米管可以穿过细胞屏障[32-33], 我们的研究也证实对单壁碳纳米管进行ssDNA包裹后, ssDNA/SWCNT复合物高度的分散性有助于其穿过细胞壁。但出乎意料的是, 进入衣藻细胞的ssDNA/SWCNT虽然不会引起细胞聚集成团, 但依然表现出对细胞生长的轻微抑制作用。这些结果证明, SWCNT对莱茵衣藻细胞存在低毒性, 而且这种低毒性与SWCNT是否被修饰、是否进入细胞无关。
已有报道证明, SWCNT经ssDNA(AT)15修饰后能进入拟南芥叶片叶绿体内, 并显著提高拟南芥叶片的光合活性[12]。我们的研究证明在莱茵衣藻中, SWCNT和ssDNA/SWCNT均导致缺硫培养条件下衣藻PSⅡ活性下降、呼吸速率增加、净光合速率下降, 这与SWCNT和ssDNA/SWCNT轻微抑制莱茵衣藻生长是一致的。这一系列影响造成光合产氢速率显著提升:ssDNA/SWCNT组与对照相比最大可提高约2倍, SWCNT组与对照相比产氢量最大提高了5倍。上述结果也提示, ssDNA/SWCNT对高等植物和莱茵衣藻光合作用的影响并不相同, 这可能与它们在两者细胞中的定位不同有关。虽然未经修饰的SWCNT能显著促进光合产氢, 但它在水溶液中的不稳定性也导致产氢量不稳定。如何改进化学修饰方法, 在不影响其促进产氢作用的前提下提高SWCNT的分散性将是后续研究的重点。
致谢: 本研究在中国科学院南京地理与湖泊研究所仪器中心测定氢气含量。
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