南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (1): 51-58   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201802034
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朱胜琪, 徐德宝, 王永鑫, 冯凯, 刘洁霞, 仇亮, 熊爱生
ZHU Shengqi, XU Debao, WANG Yongxin, FENG Kai, LIU Jiexia, QIU Liang, XIONG Aisheng
水芹咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆与表达特性分析
Cloning and expression characteristics analysis of caffeoyl-CoA O-methyltransferase gene in Oenanthe javanica
南京农业大学学报, 2019, 42(1): 51-58
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(1): 51-58.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201802034

文章历史

收稿日期: 2018-02-28
水芹咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆与表达特性分析
朱胜琪 , 徐德宝 , 王永鑫 , 冯凯 , 刘洁霞 , 仇亮 , 熊爱生     
南京农业大学园艺学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在研究水芹咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(OjCCoAOMT)的序列及其表达特性,了解该基因在水芹木质素代谢中的作用。[方法]利用RT-PCR技术从水芹中克隆OjCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的序列进行分析,并利用实时荧光定量PCR技术研究该基因在水芹不同组织以及不同贮藏条件下的表达。[结果]序列分析结果表明:OjCCoAOMT基因包含1个长度为726 bp的开放阅读框(ORF),编码241个氨基酸,蛋白相对分子质量为27.111×103,理论等电点为5.38。OjCCoAOMT蛋白属于疏水性蛋白,无序化比例为12.45%,空间结构主要由8个α-螺旋和7个β-折叠组成。多重比对与系统树分析结果表明:OjCCoAOMT蛋白与同科植物欧芹的进化关系最近。实时荧光定量PCR显示,在‘八卦洲水芹’和‘南选八卦洲紫水芹’的叶片及叶柄中OjCCoAOMT基因的表达量差异显著。在室温(25℃)、低温(4℃)和室温黑暗(25℃)3种贮藏条件下OjCCoAOMT基因表达量差异较大,低温(4℃)下表达量最高。2个品种的基因表达量也具有显著差异。[结论]OjCCoAOMT蛋白有较高的保守性。OjCCoAOMT基因在水芹中的表达具有明显的组织特异性和材料差异性,同时在低温(4℃)条件下表达量最高。
关键词水芹   OjCCoAOMT基因   序列分析   多重比对   表达分析   
Cloning and expression characteristics analysis of caffeoyl-CoA O-methyltransferase gene in Oenanthe javanica
ZHU Shengqi, XU Debao, WANG Yongxin, FENG Kai, LIU Jiexia, QIU Liang, XIONG Aisheng    
College of Horticulture/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The study aimed to investigate the sequence and expression characteristics of caffeoyl-CoA O-methyltransferase gene in Oenanthe javanica(OjCCoAOMT) and to understand its role in lignin metabolism. [Methods] The OjCCoAOMT gene was cloned from O.javanica using RT-PCR technique. The bioinformatics methods were used to analyze putative amino acid sequence and RT-qPCR method was used to study the expression profiles of OjCCoAOMT gene in different tissues of O.javanica and under different storage conditions. [Results] Sequence analysis result showed that OjCCoAOMT gene contained an open reading frame(ORF) with length of 726 bp, encoded 241 amino acids. The relative molecular mass of OjCCoAOMT protein was 27.111×103. Theoretical isoelectric point was 5.38. The protein belonged to hydrophobic protein and the ratio of its unordered sequence was 12.45%. Tertiary structure of OjCCoAOMT protein mainly consisted of eight α-helix and seven β-sheet. The analysis results of multiple alignment and phylogenetic tree showed that OjCCoAOMT had the nearest phylogeny with CCoAOMT protein from the same family species Petroselinum crispum. RT-qPCR analysis showed that the expression profiles of OjCCoAOMT gene were significantly different in different tissues(leaf blade and petiole) of 'Baguazhoushuiqin' and 'Nanxuanbaguazhouzishuiqin'. The expression levels of OjCCoAOMT gene were different under various storage conditions, such as room temperature(25℃), low temperature(4℃) and darkness at room temperature(25℃). The expression level was peak at 4℃. Moreover, significant differences also existed between two varieties. [Conclusions] OjCCoAOMT protein has high conservation. The relative expression level of OjCCoAOMT gene has tissue and material specialties under different treatments. Moreover, OjCCoAOMT gene has high expression level under the treatment of 4℃.
Keywords: Oenanthe javanica    OjCCoAOMT gene    sequence analysis    multiple alignment    expression analysis   

水芹(Oenanthe javanica)是伞形科(Apiaceae)水芹属多年生水生草本植物[1], 富含多种维生素、脂肪、碳水化合物、粗纤维以及钙、磷、铁等矿质营养。水芹病虫害较少, 适应性较强、产量高, 目前在我国长江流域及其以南地区栽培较多。不同贮藏条件对水芹品质影响明显, 室温(25 ℃)条件下的水芹失水萎蔫速度快, 短时间内商品价值损失严重。低温(4 ℃)条件与室温相比, 可以显著延长水芹贮藏期, 这与低温能够抑制蔬菜呼吸、减少蒸腾、抑制各代谢过程中间酶的活性有关[2]。避光(黑暗)贮藏多用于茎菜类(如马铃薯、洋葱、芋头等)蔬菜, 主要是为了延长蔬菜休眠、防止茎块发芽产生有毒物质。对于水芹这样以嫩叶和叶柄为主要食用器官的叶菜类蔬菜, 黑暗贮藏也具有一定的保鲜效果。

木质素是维管植物细胞壁的重要组分之一[3], 作为一种复杂的苯丙烷单体聚合物, 它可以将植物细胞壁中的纤维素和半纤维素紧密黏合在一起, 并起到填充作用[4]; 还可以疏导组织的水分运输, 提高细胞的运输能力[5]。在双子叶植物中, 愈创木基-紫丁香基木质素(G-S木质素)主要由愈创木基单体和紫丁香基单体聚合形成[6]。随着植物的生长发育, 木质素含量的增加也会对蔬菜的口感和营养品质产生一定的影响。咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是调控植物中G型木质素合成的1个关键酶, 与木质素合成中芳香环上羟基的甲基化有关[7]。CCoAOMT能将咖啡酰辅酶A甲基化成阿魏酰辅酶A[8]。自从Kuhnl等[9]和Pakusch等[10]在欧芹(Petroselinum crispum)和胡萝卜(Daucus carota)的细胞悬浮液中发现CCoAOMT以来, CCoAOMT基因已在多种植物中被克隆得到[11-16]。但其在木质素合成代谢中的作用研究起步较晚, 因此伞形科植物CCoAOMT基因功能报道较少。

'南选八卦洲紫水芹’是南京'八卦洲水芹’的自发突变体, 由本实验室获得并保存, 其叶柄由于花青素积累而呈紫色[17]。本研究选用'南选八卦洲紫水芹’和'八卦洲水芹’2个品种, 利用RT-PCR技术克隆CCoAOMT基因, 并用生物信息学方法对获得的序列进行分析, 同时选取室温(25 ℃)、低温(4 ℃)和室温黑暗(25 ℃)3种常见的贮藏方式, 通过实时荧光定量PCR技术, 检测OjCCoAOMT基因在不同组织以及不同贮藏条件下的表达情况, 以了解该基因在水芹木质素代谢中的作用, 为改良水芹品质提供研究基础。

1 材料与方法 1.1 材料

于2017年5月将'八卦洲水芹’和'南选八卦洲紫水芹’种植于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室。生长条件为:25 ℃光照12 h, 20 ℃黑暗12 h, 光照强度300 μmol·m-2·s-1。待植株长至第45天, 从2种水芹中各选取3株长势一致的植株作为重复, 采集每株顶部第3~4片叶的叶片和叶柄, 用锡纸包裹后, 液氮速冻, 保存于-80 ℃冰箱。待长至第65天, 2个品种水芹由茎基部进行采摘, 各选取3株高度为50 cm、鲜绿、无病虫害、粗细基本一致的植株。将每个品种的3株水芹分别放置于室温(25 ℃)、低温(4 ℃)和室温黑暗(25 ℃)条件下, 处理时间为0、1、2和3 d, 每天同一时段剪取生长位置一致的叶片和叶柄, 液氮速冻, 保存于-80 ℃冰箱。

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α保存于本实验室; pMD19-T质粒载体、TaKaRa Ex Taq Mix、SYBR Premix Ex Taq试剂盒、Prime Script RT reagent Kit和DL2000 Marker等均购自宝生物工程(大连)有限公司; Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司; RNA Simple Total RNA Kit购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 水芹总RNA的提取与cDNA的合成

利用RNA Simple Total RNA Kit提取水芹样品总RNA, 检测总RNA浓度, 并按照Prime Script RT reagent Kit说明书将总RNA反转录成cDNA。

1.3 水芹OjCCoAOMT基因的克隆

根据本课题组的水芹转录组数据[18], 检索得到编码水芹OjCCoAOMT蛋白的基因序列, 根据该基因序列设计1对特异引物, 正向引物序列为5'-ATGGCTCCTAATGGTGAATC-3', 反向为5'-TCAGCTGATACGGCGACATA-3'。以水芹cDNA为模板进行目的基因(即'八卦洲水芹’OjCCoAOMT基因)片段的PCR扩增。扩增体系总体积10.0 μL:cDNA模板1.0 μL, TaKaRa Ex Taq Mix 5.0 μL, ddH2O 3.0 μL, 0.10 μmol·L-1正、反向引物各0.5 μL。扩增条件为:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 80 s, 共34个循环; 72 ℃ 10 min。将反应所得产物用质量浓度12 g·L-1琼脂糖凝胶进行电泳分离, 切取含目的片段的胶块, 采用Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收产物连接到pMD19-T质粒载体上, 并转化至大肠杆菌DH5α中。转化菌液检测后送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序鉴定。

1.4 序列分析

采用BioXM 2.6软件对克隆获得的水芹OjCCoAOMT基因片段进行核苷酸和氨基酸序列分析; 采用DNAMAN 6.0软件进行氨基酸序列的亲水性和疏水性分析; 在NCBI网站上采用BLASTp程序对氨基酸序列进行保守域预测及同源性分析; 不同物种CCoAOMT蛋白的氨基酸组成及理化性质分析均在ExPASy(http://www.expasy.org)上完成[19]; 采用MEGA 5.2软件绘制系统进化树; 利用SWISS-MODEL软件对目的基因OjCCoAOMT编码的氨基酸序列进行空间建模分析[20]

1.5 实时荧光定量PCR和基因表达分析

实时荧光定量PCR试验操作步骤按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书进行, 数据处理采用iQTM 5软件完成。根据克隆获得的OjCCoAOMT基因序列, 利用Primer Premier 6软件设计1对荧光定量PCR引物, 正向:5'-ATCTAAACATTCAGAAGTTGGGC-3', 反向:5'-TGGCGGTGACATCTCTAAGC-3'。以水芹的actin基因作为荧光定量数据处理的内参基因, 正向:5'-CTGGATTCTGGTGATGGT-3', 反向:5'-GCAGTTGTTGTGAAGGAG-3'[21]。扩增体系总体积20 μL:cDNA模板2.0 μL, SYBR Premix Ex Taq 10 μL, ddH2O 7.2 μL, 0.10 μmol·L-1正、反向荧光定量引物各0.4 μL。扩增条件为:95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 共40个循环。每个样本设3次生物学重复。基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCT方法[22]。采用Microsoft Excel 2007和SPSS 20.0进行数据分析。

2 结果与分析 2.1 水芹OjCCoAOMT基因的克隆及序列分析

以'八卦洲水芹’叶片cDNA为模板, 扩增获得长约750 bp的特异片段, 命名为OjCCoAOMT基因。测序结果(图 1)显示, OjCCoAOMT基因包含1个长度为726 bp的开放阅读框(ORF), 编码241个氨基酸。OjCCoAOMT蛋白在第80位至160位氨基酸间含有1个保守的AdoMet_MTases结构域(图 2), 该蛋白属于AdoMet_MTases超级家族。

图 1 水芹OjCCoAOMT基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide sequence of OjCCoAOMT gene in Oenanthe javanica and its encoded amino acids sequence *表示终止密码子。*represents the stop codon.
图 2 水芹OjCCoAOMT蛋白的保守域预测结果 Fig. 2 Prediction result of conserved domain of OjCCoAOMT protein in O.javanica

利用DNAMAN 6.0软件进行蛋白亲、疏水性分析, 结果显示:OjCCoAOMT氨基酸中位于第159位的天冬氨酸亲水性最强, 位于第66位的丝氨酸、第115位的亮氨酸和第227位的甲硫氨酸疏水性最强。总体来看, 在OjCCoAOMT蛋白中, 疏水性氨基酸多于亲水性氨基酸, 据此推测该蛋白属于疏水性蛋白。OjCCoAOMT蛋白序列折叠无序化分析显示, 整个基因区段中有1个区域无序, 共含有30个氨基酸, 无序化比例为12.45%(图 3)。

图 3 水芹OjCCoAOMT折叠状态分析 Fig. 3 Analysis of the folding state of OjCCoAOMT in O.javanica a.氨基酸折叠指数Fold index of amino acidꎻb.氨基酸序列Amino acid sequence.下划线标注的为无序状态的氨基酸ꎮ Underlined amino acids are disordered.
2.2 水芹OjCCoAOMT蛋白与其他物种的比较 2.2.1 氨基酸序列同源性分析

对水芹OjCCoAOMT进行BLASTp同源性检索, 并与其他植物进行比对, 结果(图 4)表明, 水芹OjCCoAOMT蛋白与欧芹(P28034.1)、大阿米芹(AAT40111.1)、珙桐树(AQY61711.1)、向日葵(XP_021989010.1)、羊乳(BAE48788)、川桑(XP_010107916)、马铃薯(NP_001305508.1)、构树(AAT37172.1)、茶树(AGR51164.1)、烟草(NP_001311999.1)、美洲山杨(Q43095.1)、赤桉(ACY66929.1)、番茄(NP_001307032.1)和辣椒(PHT90368.1)具有较高的相似度, 平均达到87.64%, 说明CCoAOMT蛋白具有高度保守性。

图 4 水芹与其他物种CCoAOMT蛋白氨基酸序列的多重比对 Fig. 4 The multiple alignment of amino acids sequences of CCoAOMT protein in O.javanica and other species
2.2.2 蛋白质理化性质及氨基酸组成分析

表 1可见:CCoAOMT蛋白氨基酸数量为240~261, 水芹与欧芹、大阿米芹的氨基酸数量相等; 相对分子质量为(27.043~29.257)×103, 理论等电点为5.17~5.51, 变幅不大; 酸性氨基酸比例为20%~23%, 碱性氨基酸比例差异很小, 为13%~14%;脂肪族氨基酸含量为23%~26%, 明显高于芳香族氨基酸; 总平均亲水性为-0.276~-0.181。

表 1 水芹及其他物种CCoAOMT蛋白的氨基酸组成及理化性质比较 Table 1 Comparison on compositions of amino acids and physical and chemical property ofCCoAOMT protein in O.javanica and other species
物种
Species
氨基酸数量
Number ofamino acids
相对分子质量/103
Relativemolecular mass
理论等电点
Theoretical pI
比例/% Percentage 总平均亲水性
Grand average ofhydropathicity
AC BA AR AL
水芹Oenanthe javanica 241 27.111 5.38 20 14 8 26 -0.181
欧芹Petroselinum crispum 241 27.096 5.39 21 14 9 24 -0.220
大阿米芹 Ammi majus 241 27.043 5.29 21 13 9 24 -0.233
茶树Camellia sinensis 245 27.554 5.39 22 14 8 24 -0.216
向日葵Helianthus annuus 261 29.257 5.21 22 13 8 24 -0.243
番茄Solanum lycopersicum 242 27.290 5.17 22 13 9 24 -0.242
马铃薯Solanum tuberosum 242 27.262 5.29 22 13 9 24 -0.245
辣椒Capsicum annuum 242 27.232 5.30 22 13 9 24 -0.232
烟草Nicotiana tabacum 240 27.170 5.42 22 14 8 26 -0.208
羊乳Codonopsis lanceolata 247 27.799 5.29 22 13 9 23 -0.276
川桑Morus notabilis 247 27.895 5.41 22 14 9 25 -0.262
构树Broussonetia papyrifera 247 27.733 5.31 22 13 9 24 -0.245
美洲山杨Populus tremuloides 247 27.867 5.30 23 13 9 24 -0.257
珙桐树Davidia involucrata 247 27.753 5.51 22 13 8 24 -0.247
赤桉Eucalyptus camaldulensis 247 27.777 5.40 22 13 8 25 -0.215
注:AC:酸性氨基酸Acidic amino acids; BA:碱性氨基酸Basic amino acids; AR:芳香族氨基酸Aromatic amino acids; AL:脂肪族氨基酸Aliphatic amino acids.
2.2.3 系统进化分析

图 5可见:这15种植物被分成2支:隶属于伞形科、山茶科、菊科和茄科的9种植物聚为一支, 隶属于桔梗科、桑科、杨柳科、蓝果树科和桃金娘科的6种植物聚为另一支。其中, 同属于伞形科的水芹、欧芹和大阿米芹, 同属于茄科的番茄、马铃薯和辣椒以及同属于桑科的川桑和构树都在同一分支中, 说明同科的植物具有较近的亲缘关系; 水芹与欧芹进化关系最近, 其次是大阿米芹、茶树和向日葵; 水芹与珙桐树和赤桉进化关系最远。

图 5 水芹及其他植物CCoAOMT蛋白的系统进化树 Fig. 5 Phylogenetic tree of CCoAOMT protein in O.javanica and other species
2.3 水芹OjCCoAOMT蛋白三级结构的预测及分析

通过SWISS-MODEL软件对水芹OjCCoAOMT蛋白的三级结构进行预测及分析, 并对其蛋白序列进行同源建模。结果显示:该蛋白与紫花苜蓿(Medicago satwa)CCoAoMT蛋白三级结构的一致性达85.4%, 其中水芹OjCCoAOMT蛋白结构主要由8个α-螺旋和7个β-折叠组成(图 6)。

图 6 水芹OjCCoAOMT蛋白的三级结构 Fig. 6 Tertiary structure of OjCCoAOMTprotein in O.javanica
2.4 水芹OjCCoAOMT基因在不同组织及贮藏条件下的表达特性分析 2.4.1 在不同组织中的表达差异

图 7可见:在2个水芹品种叶片和叶柄中均能检测到OjCCoAOMT基因的表达, 且叶片中表达量较高。'南选八卦洲紫水芹’叶柄中的表达量是'八卦洲水芹’的3.31倍, 具有明显的材料差异性。'八卦洲水芹’叶片中OjCCoAOMT基因的表达量是叶柄中的4.17倍, 具有明显的组织特异性。'南选八卦洲紫水芹’叶片中该基因的表达量与叶柄中的基本相当, 无显著差异。

图 7 OjCCoAOMT基因在水芹不同组织中的相对表达水平 Fig. 7 Relative expression level of OjCCoAOMT genein different tissues of O.javanica 不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as follows.
2.4.2 不同贮藏条件下的表达差异

图 8可见:3种贮藏条件下OjCCoAOMT基因的表达量较对照均有显著变化, 其中4 ℃低温条件下表达量变化最大, 室温条件下变化最小。室温条件(25 ℃)下, '八卦洲水芹’叶片和'南选八卦洲紫水芹’叶柄中基因表达量均呈先升后降再升的趋势, 其中处理1 d时达到峰值。低温条件(4 ℃)下, 2个水芹品种叶片中的表达量均在3 d时达到峰值。叶柄中表达量的峰值'八卦洲水芹’出现在处理2 d时, '南选八卦洲紫水芹’出现在1 d时, 分别为对照的9.19倍和5.63倍。室温黑暗条件下, '八卦洲水芹’叶片以及'南选八卦洲紫水芹’叶柄中的表达量变化均不明显。'南选八卦洲紫水芹’叶片和'八卦洲水芹’叶柄中基因表达量峰值分别出现在3和2 d时, 分别为对照的5.48倍和5.97倍。

图 8 不同贮藏条件下水芹叶片和叶柄中OjCCoAOMT基因的相对表达水平 Fig. 8 Relative expression level of OjCCoAOMT gene under different storage conditionsin leaf blade and petiole of O.javanica A. '八卦洲水芹’叶片Leaf blade of 'Baguazhoushuiqin’; B. '南选八卦洲紫水芹’叶片Leaf blade of 'Nanxuanbaguazhouzishuiqin’; C. '八卦洲水芹’叶柄Petiole of 'Baguazhoushuiqin’; D. '南选八卦洲紫水芹’叶柄Petiole of 'Nanxuanbaguazhouzishuiqin’.
3 讨论

木质素对植物的生长发育具有非常重要的作用, 它能够形成纤维素并组成细胞壁, 从而增强植物的韧性和机械强度, 提高植物的抗逆性[23]。植物的木质素合成途径十分复杂, 受多种酶的综合调控[24]。CCoAOMT亚家族是O-甲基转移酶(OMT)基因家族的主要成员, 可以参与调控植物G-S木质素的含量及G木质素单体与S木质素单体的比例[4]CCoAOMT基因的功能与植物细胞壁的发育有关, 已有研究发现在转反义CCoAOMT基因植物中木质素含量得到一定程度的抑制, 且G/S木质素比例降低[25]

本研究结果显示, OjCCoAOMT基因在不同组织中均能表达, 但其相对表达量存在明显差异。CCoAOMT基因在不同植物组织中的表达情况有很多类似的报道, 如PsCCoAOMT基因在木奈的小果中表达量最低[26]; DLCCoAOMT基因在龙眼根、茎、叶中均有表达, 其中根和茎中的表达量较多, 叶中较少[15]; 棉花的GhCCoAOMT2基因在茎部的表达量最高[27]。本试验中, OjCCoAOMT基因在水芹中的表达具有组织特异性, 这可能与水芹叶片、叶柄等组织木质素代谢不同有关。本研究发现, 该基因在4 ℃低温贮藏条件下表达量显著增加并且变化最大, 室温条件下表达量虽有增加但变化最小。4 ℃条件下采后水芹在处理期内一直保持良好的商品性, 处理3 d时依然颜色鲜绿、香味浓郁, 与室温3 d时失水萎蔫、褐变黄化的水芹形成鲜明的对比, 同时也优于黑暗条件下3 d时颜色加深、叶片微卷的情况。同时, 2个水芹品种对不同贮藏条件的响应也有差异, 说明该基因在响应外界环境方面存在品种特异性。研究表明, CCoAOMT能够响应逆境胁迫, 即当植物体在受到各种生物和非生物胁迫时, 会诱导CCoAOMT基因的表达, 以抵抗各种不利环境条件[28]。水芹OjCCoAOMT基因在低温中的上调表达可能与通过调节木质素代谢过程增强植株抗逆性或者发挥其他作用有关, 具体机制尚需要进一步深入研究。

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