南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (1): 1-5   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201809100
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乔露露, 赵弘巍, 牛冬冬
QIAO Lulu, ZHAO Hongwei, NIU Dongdong
寄主与病原物互作中小RNA转运机制及应用
Research and application of small RNA transport mechanism in the interaction between host and pathogen
南京农业大学学报, 2019, 42(1): 1-5
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(1): 1-5.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201809100

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收稿日期: 2018-09-20
寄主与病原物互作中小RNA转运机制及应用
乔露露 , 赵弘巍 , 牛冬冬     
南京农业大学植物保护学院, 江苏 南京 210095
摘要:灰霉病菌与拟南芥互作中会分泌小RNA进入植物细胞,通过与拟南芥Argonaute 1(AGO1)蛋白相结合,利用寄主的RNA干扰(RNA interference,RNAi)机制沉默寄主的免疫相关基因,从而抑制拟南芥的免疫反应。相反,寄主也会将小RNA转移到病原菌中,从而抑制病原菌的致病力。最近研究发现拟南芥可以通过类似于外泌体的胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)将小RNA分泌到真菌细胞中。这些含有寄主小RNA的胞外囊泡在侵染部位积累并被真菌细胞吸收,并转运寄主小RNA诱导沉默真菌关键的致病因子,降低灰霉病菌的致病力。因此,在与病原菌的相互进化中,拟南芥通过外泌体介导的跨界RNA干扰抑制病原菌的侵染。本综述回顾了在多种植物-病原物互作体系中开展的小RNA穿梭转运研究,总结了可能的转运机制,讨论了以跨界RNA干扰技术为基础研发的新型环境友好型"RNA杀菌剂"的可靠性和局限性,对于读者了解新型作物病害防治技术具有重要意义。
关键词灰霉病菌   拟南芥   免疫反应   胞外囊泡   小RNA   寄主诱导基因沉默   
Research and application of small RNA transport mechanism in the interaction between host and pathogen
QIAO Lulu, ZHAO Hongwei, NIU Dongdong    
College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Previous studies have found that during the interaction between Botrytis cinerea(Bc) and Arabidopsis thaliana, fungi can transfer small RNA(sRNA) into Arabidopsis plant cells, and these Bc-sRNA hijack the host RNA interference(RNAi) machinery by binding to Arabidopsis Argonaute 1(AGO1) and selectively silencing host immunity genes, affecting Arabidopsis immune response. Conversely, hosts also send sRNA into pathogens and pests to inhibit their virulence. Recent study showed that host Arabidopsis cells secrete exosome-like extracellular vesicles to deliver sRNA into fungal pathogen B.cinerea. These sRNA-containing vesicles accumulate at the infection sites and are taken up by the fungal cells. Transferred host sRNA induce silencing of fungal critical genes for pathogenicity, so that they reduce the virulence of Botrytis. Thus, Arabidopsis has adapted exosome-mediated cross-kingdom RNA interference as part of its immune responses during the evolutionary arms race with the pathogen. This review summarized reports about cross-kingdom sRNA trafficking between multiple plant-pathogen systems, and discussed potential mechanism associated with sRNA movement. The reliability and limitation of this environment-friendly RNAi-based trans-membrane "RNA killer" is discussed, which would be of great significance for readers understanding the importance of novel biological control technology.
Keywords: Botrytis cinerea    Arabidopsis thaliana    immunity response    extracellular vesicles (EV)    small RNA    host-induced gene silencing (HIGS)   

在植物与病原微生物互作过程中, 植物会产生和动物类似的先天免疫系统(innate immunity)。植物先天免疫系统, 可在未受特定病原微生物诱导的情况下, 对病原侵染发生快速的防卫反应。植物先天免疫系统由病原相关分子模式激发的免疫反应(PAMP-triggered immunity, PTI)和效应蛋白激发的免疫反应(effector-triggered immunity, ETI)组成。其中, PTI主要由病原微生物表面的病原相关分子模式(如多糖、鞭毛蛋白等)刺激诱导, 可导致植物产生非特异性的防卫反应(基础防卫反应); ETI则由植物的抗病蛋白(R蛋白)识别病原微生物产生的效应蛋白引发, 可使植物产生特异性的防卫反应。病原体通过分泌效应蛋白进入到寄主细胞中作为引起植物免疫反应的一种策略。小分子RNA是在真核生物中广泛存在的一类21~24核苷酸长度的非编码RNA分子, 分为miRNA(microRNA)和siRNA(small interfering RNA)2种主要形式。它可以与含Argonauto(AGO)蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体, 切割靶标mRNA或抑制其翻译, 广泛参与植物的免疫防卫机制。本综述主要论述近些年小RNA在寄主与病原物互作中的转运机制及应用前景方面的研究进展。

1 小RNA作为效应子的植物免疫反应的研究进展

随着研究的不断深入, 研究人员发现除了传统的效应蛋白之外, 病原体衍生的小RNA也可以作为一种"新型效应子"分泌到植物细胞中, 通过利用植物的RNA沉默机制, 抑制植物免疫相关基因的表达, 影响其免疫反应。灰霉病菌(Botrytis cinerea)引起植物的灰霉病, 由于寄主范围广, 传播途径多, 以及对一些药物产生抗药性, 因此对许多经济作物造成了重大损失。最近研究发现灰霉病菌在侵染拟南芥和番茄时, 灰霉病菌的小RNA可以作为一种新型效应子运输到寄主植物细胞, 从而沉默植物重要的抗病基因。研究表明, 在植物体内可以检测到70多种灰霉病菌的小RNA, 并且可能调控包括拟南芥和番茄在内的靶标基因[1]。现已成功验证了其中的3个小RNA效应子(Bc-siR3.1、Bc-siR3.2和Bc-siR5), 其能够利用植物的RNA沉默机制沉默寄主植物的免疫基因[1]。Agonatute 1(AGO1)蛋白在RNA沉默机制中主要起结合小RNA识别靶标的作用[2-3]。同样, 当灰霉病菌的小RNA转运到寄主植物细胞中时, 会和寄主植物小RNA一样, 有效利用拟南芥AGO1(AtAGO1)蛋白, 作用到靶标基因, 沉默寄主免疫相关基因。研究发现, 当灰霉病菌侵染拟南芥ago1-27突变体时, 与野生型相比更为抗病。这是由于灰霉病菌的小RNA效应因子缺少合适的AGO蛋白作为功能载体, 失去对寄主基因的沉默作用[1]。此外, 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)也可能利用类似的策略来抑制寄主免疫反应。当大丽轮枝菌侵染拟南芥ago1-27突变体时, 出现了与灰霉病菌相似的抗病表型, 而在侵染拟南芥ago7-2dcl4-2rdr2-4rdr6-15等RNA沉默途径突变体后却表现出较强的感病性[4], 因此, 拟南芥AGO1蛋白也是大丽轮枝菌致病力所必需的。Dicer是一种双链RNA(dsRNA)特异性内切核糖核酸酶, 在触发真核生物转录和转录后基因沉默过程中发挥重要作用, 包括将dsRNA或带有茎环结构的单链RNA(如microRNA前体转录产物)切割成21~24 nt的小RNA[5-6]。大多数灰霉病菌小RNA效应因子是由DCL1和DCL2切割产生[1, 7]。为了进一步验证灰霉病菌小RNA是否可以作为效应因子抑制植物的免疫反应, 研究人员构建了灰霉病菌dcl1dcl2双突变体, 发现其对拟南芥和番茄的致病力降低, 表明灰霉病菌dcl1dcl2双突变体不能再产生致病相关小RNA。因此, 这种真菌病原体将新型效应因子小RNA转移到寄主植物细胞中, 从而抑制寄主免疫反应并实现成功侵染, 表明天然存在的跨界RNAi是病原菌侵染植物的重要方式[8]

2 寄主诱导的基因沉默的应用

植物与微生物互作过程中, 病原菌可以将小RNA作为效应因子分泌到寄主细胞中并影响寄主的免疫反应, 而寄主应该也会做出相应的反应。已有研究证实可以将人为设计的小RNA从植物传递到微生物或者昆虫细胞中[9-12], 这就是目前应用最广泛的HD-RNAi(host-delivered RNAi)或寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing, HIGS)[13-14]。HIGS的基本原理就是在寄主中表达靶向害虫或者病原菌致病基因的RNAi载体, 沉默病原靶标基因, 从而使寄主获得对病原的抗性。这种方法不仅可以有效抵御病毒入侵, 在害虫以及细菌和真菌的防治中也同样具有很好的效果[9-11, 15-16]。如在谷物中, 通过使用大麦条纹花叶病毒(BSMV)RNAi的构建载体在小麦系统叶片中产生真菌基因特异性siRNA分子, 分别靶向丝裂原活化蛋白激酶(PtMAPKl)、亲环蛋白(PtCYCl)和钙依赖磷酸酶(PtCNB)等3种小麦叶锈菌[Puccinia triticina(Pt)]的致病基因。随后Pt接种只能诱导较弱的病害症状, 并且靶向真菌基因的内源性转录水平也相应减少, 表明siRNA分子从寄主转运到真菌细胞中并抑制真菌基因的表达, 影响其致病力[9, 11]。此外, 通过转基因技术, 在莴苣中表达营养型卵菌纲莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)的Highly Abundant Message #34(HAM34)或Cellulose Synthase(CES1)基因的反向重复序列, 通过特异抑制这些基因的表达, 极大限制了B. lactucae的生长且抑制孢子的形成, 从而减轻莴苣霜霉病的发生[15]。除了真菌和卵菌性病害, 虫害也是影响许多作物产量的主要因素之一, 如蚜虫。蚜虫在取食期间, 当口针通过质外体刺透时, 其附近会产生凝胶型唾液并形成鞘。鞘的形成被认为是结构鞘蛋白(structural sheath protein, SHP)通过分子间二硫键交联形成的, 而鞘对于持续摄入来自于筛管分子的韧皮部汁液又是必需的。当蚜虫喂食表达shp双链RNA(shp-dsRNA)转基因大麦后, 与喂食野生型大麦的蚜虫相比, 其shp mRNA表达水平显著降低, 表明RNA抑制剂能成功地从植物转移到昆虫[10]。这表明HIGS技术在农业生产中具有控制蚜虫的应用潜力。此后, 研究人员从感病棉花中分离的大丽轮枝菌中, 检测到一些来源于棉花的内源小RNA(miRNA), 并能够调控真菌靶基因的下调, 表明植物内源miRNA的跨界调控。同时研究发现, 敲除miRNA在真菌中的靶标基因可以大大减弱大丽轮枝菌的致病性, 证明该靶基因是致病基因, 以上研究表明跨界RNAi是棉花和大丽轮枝菌互作中天然存在的抗病途径[17]

3 植物分泌小RNA到真菌细胞的途径

寄主诱导的基因沉默广泛存在作物抗病免疫领域, 但分子试验证据和理论依据还不清楚。同时, 植物内源miRNA也参与对病原菌的跨界调控, 对于这种寄主来源的小RNA如何进入病原菌中以及作用机制却未见明确的阐述。最近研究表明, 寄主小RNA主要是通过类似于外泌体的植物胞外囊泡传递到病原真菌并抑制其靶标基因表达, 影响病原真菌的致病力[18]。胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)是由各种细胞释放到细胞外围环境中的膜囊泡, 当病原物侵染寄主时, 寄主和病原物均会产生胞外囊泡[19], 携带与细胞来源相关的多种蛋白质[20-21]、脂类[22-23]、DNA[24-25]、mRNA[26-27]、miRNA[28-30]等, 广泛参与细胞间通讯、细胞迁移以及免疫调节等过程。最近有报道称, 胞外囊泡能够通过非经典的方式分泌蛋白质/RNA, 并能提供植物与真菌相互作用的细胞外分子环境[31-33]。之前有研究表明胃肠寄生虫(Heligmosomoides polygyrus)的胞外囊泡能够将miRNA转入哺乳动物细胞, 从而抑制寄主免疫[34]。最近又有研究表明, 从病毒感染细胞释放的胞外囊泡可以将病毒RNA传递给树突细胞和巨噬细胞, 从而激活受体细胞中的PRR, 导致Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子的表达。另一方面, 胞外囊泡不仅转移病毒RNA, 而且还将小RNA传递到受体细胞中[35]

上述研究报道小RNA通过胞外囊泡的运输主要是在动物与病原物互作的体系中, 在植物与病原物互作体系中还未见相关的研究报道。为了检验植物是否通过分泌囊泡将sRNA转入真菌细胞, 研究人员以拟南芥和灰霉病菌互作系统为研究对象, 从侵染灰霉病菌的拟南芥组织中分离出真菌细胞。并且通过试验在分离出的真菌细胞中检测到了拟南芥的小RNA, 如:TAS1c-siR585、TAS2-siR453、IGN-siR1、miRNA166等。CD63属于哺乳动物的四跨膜蛋白, 是外泌体(exosome)特异的标志。而在拟南芥中存在与CD63结构高度相似的TETRASPANIN(TET)-like基因TET8TET9, 且二者在灰霉病菌侵染后诱导表达。当灰霉病菌侵染带有自身启动子的TET8-GFP转基因拟南芥时, 发现TET8在侵染位点积累。为了进一步验证灰霉病菌的细胞可以吸收外泌体, 将灰霉病菌和TET8-GFP标记的外泌体共培养, 2 h后发现, 真菌细胞中可以检测到TET8-GFP, 并且用Triton X-100(破坏外泌体的作用)处理后, 在真菌细胞中仍然可见TET8-GFP, 并且外泌体携带的小RNA(TAS1c-siR585、TAS2-siR453和miRNA166)也可以在真菌细胞中检测到。此外, 通过试验方法验证了TET8与TET9的互作, 并发现其在功能上高度冗余。当灰霉病菌侵染tet8tet9双突变体时, 植物更为感病, 表明TET8和TET9突变后减少了与其相关的外泌体的量, 从而减少了寄主分泌小RNA的水平。这些结果证明TET8和TET9相关联的外泌体有助于植物通过转移寄主的小RNA进入到真菌细胞中并产生免疫反应。为了确定转移的小RNA是否影响了真菌毒力, 用灰霉病菌侵染影响反式作用siRNA(tasiRNA)和异染色质siRNA生物合成的dcl2/3/4三重突变体以及在tasiRNA形成中受损的rdr6-15拟南芥突变体, 发现与野生型相比, dcl2/3/4rdr6-15突变体对灰霉病菌更加感病, 表明拟南芥分泌的小RNA可以抑制灰霉病菌侵染。此项研究的发现不仅为寄主诱导的基因沉默提供了理论依据, 而且跨界RNAi中发现外泌体的功能可能有助于发展有效的小RNA定向传递方法, 对人工体外合成RNA用以控制作物病害具有重要的指导意义。

4 RNAi跨界研究的意义及展望

在寄主与病原菌的长期进化中, 除了传统的PTI和ETI先天免疫之外, 跨界RNAi为小RNA介导的免疫开辟了一个新的领域。随着科研技术的进步, 人们对跨界RNAi的了解不断深入, 并将这项技术直接用于病虫害防治, 取得了较好的防治效果。人们利用HIGS技术, 可以通过构建能够特异表达靶向病原致病必需基因的dsRNA转基因植物, 防治由病毒[36]、类病毒[37]、细菌[38]、真菌[4, 11, 16, 39-40]、卵菌[15]、线虫[41-42]以及昆虫[12, 43-44]引起的病虫害。而且, HIGS技术还可以有效防治传统化学防治较难控制的根部病害, 如大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病[17]。不仅如此, 科研人员还尝试直接向寄主植物表面喷洒体外转录的Bc-DCL1/2-dsRNA来抑制灰霉病的发生, 此技术被称之为"喷雾诱导的基因沉默"(spray-induced gene silencing, SIGS)[7, 45]。植物通过胞外囊泡分泌小RNA进入真菌病原体的发现为HIGS以及SIGS的应用提供了理论基础和依据。当今, 传统的化学农药防治面临着农药残留以及对环境污染等问题, 而基于RNAi技术的"RNA杀菌剂"可以有效避免这些问题。此外, 长期使用化学农药会使病原物产生一定的抗药性, 而真菌基因组的测序发展, 以及对基因功能的解析和对侵染过程及寄主抗病过程的深入了解, 使得研究人员能够挑选有效的靶标基因进行特定靶向沉默, 从而有效解决病原菌对化学药物产生抗药性的问题。不仅如此, 还可以通过将靶向多种不同病原物的基因融合, 以便达到同时防治多种病害的目的。因此, 寄主诱导的基因沉默技术以及喷雾诱导的基因沉默具有切实可行的操作性和广阔的应用前景, 与环境友好型病虫害防治策略相一致。当然, 如果将该技术广泛应用到大田作物抗病虫害防治中, 仍然面临着诸多困难。作为病害三要素除寄主和病原物之外的自然环境, 仍是面临的首要问题。自然条件下, 植物将面临着更为复杂的环境和多变的气候条件, 以及病原物之间存在互作关系, 这些问题无疑会给寄主诱导以及喷雾诱导的基因沉默技术的防治效果带来一定程度上的影响。随着现代分子生物学及遗传学的快速发展, 以及植物与病原菌互作分子机制的深入研究, 相信通过科研人员的不懈努力, 跨界RNAi技术将成为未来开发新的植物病害防控的有力工具。

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