文章信息
- 张宝康, 施金彤, 杜红旭, 宋大鲁, 刘家国
- ZHANG Baokang, SHI Jintong, DU Hongxu, SONG Dalu, LIU Jiaguo
- 芪薏术蝎方不同提取物对三氯卡班引起乳腺上皮细胞癌变的修复作用
- Different extracts of Qiyizhuxie formula repaired the cancerous EpH4-Ev cells induced by TCC
- 南京农业大学学报, 2018, 41(6): 1118-1125
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(6): 1118-1125.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201808029
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文章历史
- 收稿日期: 2018-08-21
乳腺癌已经成为世界上第二大危害女性生命健康的疾病, 其死亡率高达40%以上[1]。中国的乳腺癌发病率虽然比西方国家的发病率略低, 但是近年来一直都呈现逐年增长趋势, 并且发病人群呈现年轻化趋势[2]。环境中能够增加乳腺癌发病风险的主要是生殖激素类物质, 这类物质被认为与乳腺癌的发生直接相关。外源性激素能够使得女性体内的雌激素和孕酮水平发生紊乱, 从而增加了乳腺癌的发病风险[1]。
三氯卡班(triclocarban, TCC), 其化学名称为3, 4, 4-三氯均二苯脲, 作为一种广谱抗菌剂被广泛使用。TCC主要被用在抗菌皂、洗衣液、沐浴露等日常生活用品中, 它对革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌、病毒等具有广谱高效的杀灭和抑制作用[3]。大量研究调查结果显示, TCC能够在哺乳动物的乳腺中累积, 从而对动物体的乳腺组织造成损害[4]。近年来, 人们发现TCC在各种环境介质和生物体中被频繁检出。由我们前期试验结果[5]可知, 长期暴露于TCC能够引起EpH4-Ev细胞癌变。中药方剂作为新型的抗癌药物, 其治疗效果得到了国内外的普遍关注。研究证明, 中药及其方剂能够直接抑制癌细胞增殖, 增强患者免疫功能以及抑制一些癌基因等[6], 它不仅能够缓解或治疗肿瘤给患者带来的痛苦, 而且还能降低化学治疗和放射治疗后的副作用, 减少患者的身心痛苦[7]。
我们研发的芪薏术蝎方(Astragalus membranaceus-Coix seed-Rhizoma curcumae-Viola philippica-Scorpion, ARCVS)是由黄芪、薏苡仁、莪术、紫花地丁、全蝎等组成的方剂, 目前已在宠物肿瘤防治中广泛使用。为进一步研究其药理作用和其主要有效成分, 我们提取了方剂的水提物(ARCVS)和总多糖(total ploysaccharides, TP)、醇提物(ethanol extract, EE), 并以TCC作为致癌剂, 使EpH4-Ev细胞累积和重复暴露于TCC分别与芪薏术蝎方水提冻干物、醇提物、总多糖及紫杉醇(paclitaxel, PTX)共同作用的溶液中, 来检测芪薏术蝎方及其醇提物和多糖粗提物的治疗作用, 并以紫杉醇作为阳性对照药来评价它们的疗效, 为进一步研发抗肿瘤药物及其合理剂型提供参考。
1 材料与方法 1.1 主要材料、细胞与试剂芪薏术蝎方主要组成为黄芪、薏苡仁、莪术、全蝎、紫花地丁等(均购自南京天元大药房), 是将方剂水煎液冷冻干燥的粉末及其多糖提取物(total polysaccharides, TP)和醇提物(ethanol extract, EE)分别溶于PBS中配成一定浓度母液, 用0.22 μm滤膜过滤除菌, 4 ℃保存。临用前用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基倍比稀释。经试验前测定, 中药方剂水提物、醇提物、总多糖在EpH4-Ev细胞上的最大安全质量浓度分别为1、1和3 mg·mL-1。
紫杉醇溶液的配制:称取紫杉醇粉末(纯度99.6%, 西安昊轩生物有限公司)用乙醇和聚氧乙烯蓖麻油(体积比1 :1)配成25 μmol·L-1溶液, 用0.22 μm滤膜过滤除菌, 4 ℃保存。临用前用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM 10倍稀释。经测定, 其在EpH4-Ev细胞上的最大安全浓度为0.25 μmol·L-1。
正常小鼠乳腺上皮细胞系(EpH4-Ev), 购自美国ATCC细胞公司。
TCC溶液(纯度为99.9%, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO公司):按文献[7]方法配制成0.195 μmol·L-1溶液, 用0.22 μm滤膜过滤除菌, 4 ℃保存。四甲基偶氮唑蓝(MTT)用PBS配制成5 mg·mL-1溶液, 用0.22 μm滤膜过滤除菌, 避光4 ℃保存。
细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK1/2)、MAP蛋白激酶(Mek1/2)、磷酸化Mek1/2(p-Mek1/2)、组蛋白(H2AX)、磷酸化H2AX(p-H2AX)抗体, 均购买于Cell Signaling公司; 有丝分裂氧化酸(Nox-1)抗体购买于Abcam公司; β-actin抗体购买于Santa Cruz Biotechnology公司。
1.2 TCC和药物共同处理EpH4-Ev细胞将0.195 μmol·L-1 TCC和各安全浓度的药物按1 : 1混合后, 分别加入细胞瓶中培养至单层的正常细胞中培养48 h后传代; 以不加TCC和药物处理的正常细胞作为未处理细胞对照(untreated)。以加TCC作用48 h为1个循环, 连续作用6个循环作为T-6阳性对照细胞(简称T-6细胞), 除T-6细胞组再继续用TCC处理6个循环(T-6组)外, 其余EE/T-6、TP/T-6、ARCVS/T-6、PTX/T-6组分别以EE、TP、ARCVS、PTX替代TCC继续连续作用6个循环, 验证药物对于TCC致细胞癌变的影响。
1.3 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞增殖的影响采用MTT法[5]检测中药方剂不同提取物对T-6细胞增殖的影响。分组处理同1.2节, 将T-6细胞(每孔3×103)加入6块96孔细胞培养板中, 置37 ℃、5% CO2培养至铺满96孔板, 弃培养基, 用PBS润洗细胞2次, 每孔加入稀释好的药物100 μL, 设置6个重复; untreated组和T-6组均加入含4%(体积分数)血清的DMEM 100 μL。置细胞培养箱37 ℃、5% CO2培养48 h后, 用MTT法检测波长570 nm处吸光值(A570)。
1.4 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞ROS水平的影响试验设6组, 分别为untreated、T-6、EE/T-6、TP/T-6、ARCVS/T-6、PTX/T-6。取1.2节中untreated和T-6细胞及各药物处理的细胞, 按每孔8×105个细胞分别加入6孔细胞培养板中, 37 ℃、5% CO2培养至铺满底部, 弃培养基后用PBS润洗细胞2次, 分别加入上述最大安全浓度的药物, 每孔2 mL, untreated、T-6组均加含4%血清的DMEM, 每孔2 mL, 每组样品设置3个重复, 置细胞培养箱37 ℃、5% CO2培养48 h后, 收集细胞, 按照ROS检测试剂盒(南京碧云天公司)说明用流式细胞仪检测细胞ROS水平。
1.5 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞内ERK通路及DNA损伤的影响ERK(细胞外调节蛋白激酶)通路检测了p-ERK1/2、ERK1/2以及Nox-1蛋白的活性;DNA损伤程度用H2AX转化为p-H2AX的量表示, 以β-actin作为内参蛋白。蛋白表达量用Western blot法检测。
分组及细胞处理同1.4节细胞处理部分。细胞再培养48 h后弃培养液, 用PBS漂洗2次后加入适量新配制的含蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA裂解液使细胞裂解, 移至离心管内, 每个样品超声匀浆2次, 4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min, 收集上清液, 按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书(碧云天公司)绘制标准曲线,根据标准曲线计算蛋白浓度。根据变性后样品蛋白浓度等质量上样至电泳凝胶加样孔内, 用浓缩胶80 V电泳30 min, 分离胶120 V电泳120 min。使用半干式转印法20 V转膜60 min后, 将PVDF膜放入TBST缓冲液中, 漂洗3次后加入含5%脱脂奶粉的封闭液, 室温封闭2 h, 然后向膜上加一抗(1 : 1 000)稀释液, 4 ℃孵育过夜。加TBST液漂洗3次后, 再加6 mL含5%脱脂奶粉的二抗溶液(1 : 5 000稀释), 室温孵育1 h, 加TBST漂洗3次后曝光。利用Image-Pro Plus 6.0软件进行蛋白条带的光密度值测定。
1.6 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞凋亡的影响细胞处理同1.4节细胞处理部分。采用流式细胞仪按照细胞凋亡试剂盒(BD公司)检测细胞的凋亡率。详细步骤如下:细胞药物培养48 h后用PBS润洗3次, 用2.5 g·L-1胰酶消化EpH4-Ev细胞3~5 min, 加入10% DMEM终止消化, 将细胞转移至EP管中, 4 ℃、1 200 r·min-1离心5 min, 弃上清液, 加入PBS重悬后离心收集细胞, 加入1 mL 1×Binding Buffer重悬细胞, 吸出200 μL细胞悬液加入5 mL离心管中(每支离心管中预先加入5 μL FITC)染色5 min, 避光室温孵育15 min, 再加入5 μL PI染色剂避光染色5 min, 最后各加入400 μL Binding Buffer重悬细胞, 在1 h内用流式细胞仪完成检测。
1.7 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞非停泊性生长的影响分别取untreated、T-6、EE/T-6、TP/T-6、ARCVS/T-6、PTX/T-6组的细胞1×103mL-1制成细胞悬液备用, 试验步骤同文献[5]。
1.8 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞划痕试验的影响分别取untreated、T-6、EE/T-6、TP/T-6、ARCVS/T-6、PTX/T-6组的细胞, 加入6孔板中每孔1×106个细胞, 培养12 h, 试验步骤同文献[5]。
1.9 数据分析试验数据以x±SE表示, 用SPSS 20.0软件进行方差分析和多重比较, 用Graph Pad Prism软件绘制柱状图。
2 结果与分析 2.1 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞增殖的影响从图 1可见:4种药物处理组的细胞增殖率均与未处理对照细胞(untreated)无显著性差异, 与T-6组相比, 细胞增殖率均显著降低; 4种药物之间没有显著差异。说明用TCC反复处理细胞可以造成乳腺上皮细胞明显增生, 而3种中药提取物及阳性对照药紫杉醇均可有效抑制这种增生, 且其作用无显著差异。
2.2 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞ROS水平的影响如图 2所示:与对照细胞相比, T-6组和4种药物处理组细胞的ROS水平均极显著升高, 4种药物处理组细胞产生的ROS水平也均显著高于T-6组的ROS水平, 紫杉醇作用稍优于3种中药提取物。
2.3 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞ERK通路活化的影响如图 3所示:4个药物处理组细胞中ERK1/2、p-ERK1/2的表达量均显著低于T-6组, 而Nox-1的表达量显著高于T-6组。与不处理对照细胞组相比, 这4种药物处理组细胞的ERK1/2、p-ERK1/2表达量均显著降低, 而Nox-1的表达量均显著升高; 各药物之间差异不显著。表明TCC长期处理会导致乳腺上皮细胞ERK通路活化, 而3种中药提取物和紫杉醇均能够抑制其活化, 且作用效果接近。
2.4 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞DNA断裂相关蛋白的影响如图 4所示:与T-6组相比, 未处理细胞组与DNA断裂相关蛋白p-H2AX表达量显著降低, 而经过药物作用细胞的DNA断裂相关蛋白显著增加, 各药物组之间没有显著差异。表明TCC长期处理引起了细胞明显的DNA损伤, 而3种中药提取物和紫杉醇加剧了T-6细胞DNA的断裂程度。
2.5 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞凋亡的影响如图 5所示:与未处理组相比, T-6组细胞凋亡水平显著增加, 而3种中药提取物和紫杉醇处理组细胞凋亡水平均显著高于T-6组细胞, 但各药物之间无显著差异。表明TCC长期处理引起了显著的细胞凋亡, 3种中药提取物和紫杉醇均加剧了细胞凋亡。
2.6 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞非停泊性生长的影响如图 6所示:T-6组、EE/T-6和TP/T-6组形成的细胞集落数显著大于未处理对照细胞, 但后2组显著低于T-6组细胞, ARCVS/T-6和PTX/T-6组的细胞集落与未处理对照细胞无显著差异, 并显著低于T-6组细胞。表明TCC长期处理促进乳腺上皮集落形成, 3个中药提取物和紫杉醇均可有效抑制T-6细胞的非停泊性生长, 尤其以ARCVS和紫杉醇效果最好, 其次是TP, EE也有显著抑制作用。
2.7 芪薏术蝎方不同提取物对T-6细胞迁移的影响如图 7所示:用细胞划痕试验来检测细胞的迁移, 与未处理细胞相比, TCC长期处理的T-6细胞在8、16 h的细胞划痕间距均显著减小, 细胞迁移率显著增加; 3种中药提取物和紫杉醇处理组的细胞的划痕间距在8、16 h也均显著高于T-6细胞, 细胞迁移率显著减小, 尤以TP、ARCVS和PTX效果最明显, 三者之间没有显著差异。表明3种中药提取物和紫杉醇均能够抑制T-6细胞的迁移, 以TP、ARCVS和PTX的效果为佳。
3 讨论目前, 治疗癌症最重要和最普遍的手段就是化学药物治疗、放射疗法和手术切除, 这3种方式能够有效遏制癌细胞的扩散, 提高患者的存活率。但是, 这3种治疗手段所带来的副作用, 例如呕吐、脱发、昏迷等使患者在身体和精神上饱受折磨。这些严重的副作用促使我们开始重新思考治疗的意义, 对疾病的治疗除了延长患者生命之外, 也不能忽略患者接受治疗后的生活质量, 否则就失去了治疗的意义。因此, 需要研发新药以获得良好的药效并尽可能降低其毒副作用, 中药方剂就是这样一类药物。
中药方剂是由多味中草药根据中药的配伍原则和患者的证候, 按比例进行组合而成的, 它的应用在中国传统医学中有着不可动摇的地位[8]。多种药物配伍在一起能够降低单味药物的毒副作用, 并能够增强疗效, 提高患者的生存质量[9]。所以, 我们根据宠物临床常见证候, 按照辨证施治的原则组成了芪薏术蝎方。目前该方已在宠物肿瘤防治临床中大量使用并获得良好反响, 在防治乳腺瘤和皮肤瘤方面效果尤佳。本方选择黄芪、薏苡仁、紫花地丁、莪术和全蝎等中药材组成, 其中黄芪有行气活血、益气健脾的功效, 当癌症患者因为脾肺虚弱而出现吐血、喘息、痰多等症状时, 黄芪能够有效化解或减轻这些症状; 薏苡仁则具有利水渗湿、健脾止泻、解毒散结的功效, 薏苡仁能够有效祛除体内毒素和缓解肿瘤的发展; 紫花地丁具有清热解毒、凉血消肿等作用, 其有效成分具有显著的抗肿瘤作用; 莪术具有行气止痛、破血祛瘀等作用, 具有很好的抗肿瘤效果; 全蝎具有息风解痉、攻毒散结、通络止痛等功效, 对于疮疡、瘰疬等具有良好的效果。诸药配伍, 补气活血、托毒散结、祛瘀解痉, 共凑抗瘤化瘤之功效。
氧化应激是多数癌细胞的一个重要特征, 这是癌细胞发生发展的一个必要过程, 相比正常细胞, 癌细胞内的ROS水平要高出许多[10-11]。癌细胞的强代谢能力使其能够产生大量的ROS, 这些ROS又激活细胞内的一些信号通路, 干扰细胞内线粒体的代谢, 从而造成细胞的异常增殖和氧化损伤[12-13]。这说明在癌细胞中, ROS是一个重要的示病性指标[13]。然而, 体内ROS水平的紊乱会使细胞处于一种极度不稳定的状态, 当ROS升高到一定程度时, 对细胞造成的氧化损伤就是致死性的。大量的研究表明, ROS的过量产生会对癌细胞造成损伤, 而正常细胞因为其强大的调节氧化平衡的能力, 不会受到很大影响。所以, ROS对细胞来讲是一把双刃剑, 既能够促进细胞氧化损伤而发生癌变, 过量产生时又能够加速癌细胞死亡。所以, 用药物促进癌细胞内ROS水平升高来杀死癌细胞也是一种有效的治疗方式。本试验结果表明, 乳腺上皮细胞经过TCC长期处理后, 细胞内ROS水平显著升高, 细胞增殖显著, 细胞迁移力显著增强, ERK通路相关蛋白活化、DNA损伤明显, 表现出明显的癌变特点。说明采用TCC长期处理乳腺上皮细胞, 可以诱导其产生明显的细胞癌变。3种中药提取物及紫杉醇处理的T-6细胞较T-6组细胞增殖显著降低, 细胞内ROS水平显著增加、细胞迁移力和非停泊性生长均显著降低, ERK通路相关蛋白活化也受到抑制, 细胞凋亡总量明显升高, 表明这些药物促进T-6细胞内产生过量的ROS, 大量的ROS对癌细胞造成了严重的损伤, 使得癌细胞的增殖率降低, ERK通路被抑制, 细胞凋亡加剧, 最终导致细胞死亡, 从而表现出良好的抑癌效果。与紫杉醇相比, 3种中药提取物在抑制T-6细胞增殖、调节ERK通路活化、影响细胞DNA损伤和抑制细胞迁移等方面作用基本接近, 但在调控细胞凋亡方面作用更明显, 而紫杉醇在调节T-6细胞内ROS水平方面作用更为明显。综合评价, 3种中药提取物作用与紫杉醇基本接近, 其中水提物作用稍好。
我们前期研究结果[5]和本试验结果证明TCC长期处理可以诱导乳腺上皮细胞发生明显的癌变; 芪薏术蝎方水提物、多糖和醇提取物既能对正常乳腺上皮细胞提供保护功能, 增强正常细胞的抗氧化能力, 来抵抗TCC造成的急性细胞损伤, 又能杀伤已经癌变的细胞, 其杀伤功能的发挥可能是通过促进癌变细胞内产生的过量ROS, 从而造成癌细胞的死亡。这种双重作用既避免了抗肿瘤药物对正常细胞的损害, 又能够清除已经癌变的细胞, 大大减少了对机体的损害。这种作用与抗瘤药物紫杉醇效果基本接近, 可望进一步研发利用。
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