南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (6): 1113-1117   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201801046
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李国强, 朱丽萍, 朱丽臻, 陈蕾蕾, 颜世敢
LI Guoqiang, ZHU Liping, ZHU Lizhen, CHEN Leilei, YAN Shigan
UPEC双组分信号系统KguS/KguR调控基因缺失株的构建及其生长特性研究
Construction and growth characteristics analysis of the deletion mutant of the target gene regulated by two-component signaling system KguS/KguR of UPEC
南京农业大学学报, 2018, 41(6): 1113-1117
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(6): 1113-1117.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201801046

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收稿日期: 2018-01-25
UPEC双组分信号系统KguS/KguR调控基因缺失株的构建及其生长特性研究
李国强1 , 朱丽萍1 , 朱丽臻2 , 陈蕾蕾3 , 颜世敢1     
1. 齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院/山东省微生物工程重点实验室, 山东 济南 250353;
2. 山东省临沂市相公中心医院, 山东 临沂 276025;
3. 山东省农业科学院农产品研究所, 山东 济南 250100
摘要[目的]构建尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)CFT073株的双组分信号系统KguS/KguR调控的c5032c5037基因的缺失株,并研究基因缺失株在有氧和厌氧条件下的生长特性。[方法]运用Red重组系统将带有c5032c5037基因同源臂的氯霉素抗性基因取代c5032c5037基因,在温度敏感型质粒pCP20作用下消除氯霉素抗性基因,构建基因缺失株CFT073Δc5032c5037,用PCR和基因测序验证基因敲除是否成功,测定有氧和厌氧条件下CFT073Δc5032c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中培养不同时间的菌液D600值。[结果]构建了CFT073Δc5032c5037,PCR验证及基因测序结果均表明已成功敲除c5032c5037基因;厌氧条件下CFT073Δc5032c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中生长比野生型菌株CFT073缓慢,且差异极显著(P < 0.01),但在有氧条件下二者的生长无显著差异。[结论]成功构建了基因缺失株CFT073Δc5032c5037,并试验证实KguS/KguR调控的c5032c5037基因在厌氧条件下参与α-酮戊二酸的利用,为进一步研究KguS/KguR在UPEC中的代谢适应机制奠定了基础。
关键词尿道致病性大肠杆菌   KguS/KguR   c5032-c5037基因   Red重组系统   
Construction and growth characteristics analysis of the deletion mutant of the target gene regulated by two-component signaling system KguS/KguR of UPEC
LI Guoqiang1, ZHU Liping1, ZHU Lizhen2, CHEN Leilei3, YAN Shigan1    
1. School of Bioengineering/Shandong Key Laboratory of Microbial Bioengineering, Qilu University of Technology(Shandong Academy of Sciences), Jinan 250353, China;
2. Xianggong Central Hospital of Linyi City, Shandong Province, Linyi 276025, China;
3. Institute of Agricultural Food, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China
Abstract: [Objectives] This study aims to delete c5032-c5037 genes regulated by two-component signaling system KguS/KguR of uropathogenic Escherichia coli (UPEC)strain CFT073, and study the growth characteristics of the mutant under aerobic or anaerobic conditions. [Methods] Red recombination system was used to replace c5032-c5037 genes with chloramphenicol resistance gene containing the homologous arms of c5032-c5037 genes, and then chloramphenicol resistance genes was eliminated by introducing a temperature sensitive plasmid pCP20. Finally c5032-c5037 genes deletion mutant CFT073Δc5032-c5037 was constructed. PCR and gene sequencing were used to confirm whether genes were successfully knocked out. The growth characteristics of the mutant CFT073Δc5032-c5037 were monitored in M9 minimal medium with α-ketoglutarate as the sole carbon source under aerobic or anaerobic conditions. [Results] The results of PCR and DNA sequencing of the mutant CFT073Δc5032-c5037 accorded with theoretical results. No significant growth differences were observed between the wild strain CFT073 and the mutant CFT073Δc5032-c5037 under aerobic conditions, while significant differences appeared between them under anaerobic conditions (P < 0.01). [Conclusions] Genes deletion mutant CFT073Δc5032-c5037 was constructed successfully and the growth result revealed c5032-c5037 genes were closely correlated with the utilization of α-ketoglutarate under anaerobic conditions. This study could establish the foundation for further research in the function of KguS/KguR.
Keywords: uropathogenic Escherichia coli    KguS/KguR    c5032-c5037 genes    Red recombination system   

尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)是引起尿道感染的常见病原菌。60%~80%的尿道感染由UPEC引起[1]。UPEC的代表菌株是CFT073株,血清型为O6 :K2 :H1,是从急性肾盂肾炎患者血液中分离得到的[2]。UPEC通过特定的黏附素(如P、1型菌毛和其他型菌毛)吸附到尿道上皮细胞上,在获取毒素、荚膜多糖等毒力因子后迁移到膀胱、肾脏定殖并引起尿道感染[3]。尿道和肾脏是一个厌氧、乏营养、高α-酮戊二酸的环境,UPEC为适应肾脏的特定环境必须进行代谢途径调整才能利用α-酮戊二酸进而生存下来。关于UPEC在肾脏中的代谢适应机制尚未见报道,研究该机制对阐明尿道感染的发病机制及防治具有重大意义。

KguS/KguR是在UPEC中发现的一种新型双组分信号系统,其中KguS是一种组氨酸蛋白激酶,是α-酮戊二酸利用的传感器,KguR是一种反应调节蛋白,是α-酮戊二酸利用的调节器。敲除kguSkguR基因时,UPEC在厌氧条件下利用α-酮戊二酸的能力大大减弱[4]。研究发现KguS/KguR调控的靶基因c5032c5034c5035c5036c5037c5038c5039被编码在一个基因岛上,该基因岛插入在大肠杆菌K12的tyrBaphA基因之间,而且c5032c5037基因编码蛋白在氨基酸序列上与sucABCD编码的α-酮戊二酸脱氢酶和琥珀酰辅酶A合成酶亚基高度相似[4]。α-酮戊二酸脱氢酶和琥珀酸辅酶A合成酶在细菌的三羧酸循环中发挥重要作用,由此推测c5032c5037基因在UPEC利用α-酮戊二酸的代谢中可能具有重要作用。

本试验利用Red同源重组技术,敲除KguS/KguR调控的c5032c5037基因,构建基因缺失菌株CFT073Δc5032c5037,并对缺失株的生长特性进行研究,为进一步探究KguS/KguR在UPEC中的代谢适应机制和致病机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 菌株和质粒

UPEC野生型菌株CFT073,质粒pKD46、pKD3和pCP20,均由美国爱荷华州立大学李干武教授惠赠。

1.2 试剂和设备

LB培养基、SOB培养基按照文献[5]配制;SOC培养基:由每100 mL SOB培养基中加入2 mL已除菌的1 mol·L-1葡萄糖溶液配制而成。DNA Taq聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司;质粒提取试剂盒和DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;L-阿拉伯糖、氯霉素和氨苄青霉素均购自上海生工生物工程有限公司,用时分别配制为30 mmol·L-1、25 mg·L-1和50 mg·L-1;α-酮戊二酸购自Sigma公司,工作浓度为40 mmol·L-1;其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

AnaeroPouch-Anaero型厌氧产气袋购自日本三菱瓦斯化学株式会社;Eporator型电转化仪、5424R型冷冻离心机均购自德国Eppendorf公司。

1.3 基因缺失株的构建

利用Datsenko等[6]建立的λ Red同源重组技术构建c5032c5037基因缺失株。

1.3.1 敲除引物和验证引物的设计

根据c5032c5037基因序列及其上、下游的核苷酸序列,设计带60 bp同源臂的氯霉素抗性基因的敲除引物对Del-(c5032c5037)-F/R,设计PCR验证引物对c5032c5037-F/R、内部PCR验证引物对c5032 -inner-F/R以及氯霉素抗性基因PCR验证引物对C1/C2。引物序列见表 1

表 1 c5032c5037基因敲除引物和验证引物 Table 1 Primers for deletion and identification of c5032-c5037 genes
引物Primers 引物对序列(5′→3′) Prime pairs sequences
Del-(c5032c5037)-F/R TCCCCTACTATTCTGTCCCTTTTTTCGCCCACTTTTACATCATCTCTTTTCTATAAGTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC/TTCTCTTACCACACAGATAAAAAAAGGGAGCGATATGCTCCCTTGATATTCATTTATGGACATATGAATATCCTCCTTAG
c5032c5037-F/R TTTTGGTGCGAAGGTGGT/CCAGTGGCAGAAGGGTAAT
c5032-inner-F/R CGAAGGTAGCACGGTCAC/CCCATAACTGCCACATCAA
C1/C2 TTATACGCAAGGCGACAAGG/GATCTTCCGTCACAGGTAGG
注:下划线表示目的基因同源臂。The underlined sequences represent homogeneous arms of target genes.
1.3.2 线性打靶DNA片段的制备

以质粒pKD3为模板、Del-(c5032c5037)-F/R为引物PCR扩增打靶DNA片段。PCR反应体系:Taq Plus Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各1.25 μL,DNA模板2 μL,加无菌水至25 μL。PCR反应参数:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,30个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,利用DNA凝胶回收试剂盒回收打靶DNA片段。

1.3.3 CFT073/pKD46重组子的构建

过夜培养大肠杆菌CFT073,按1 : 100接种至新鲜的LB培养基中,振荡培养。当菌液D600≈0.6时,制备CFT073感受态细胞。向CFT073感受态细胞中加入10 μL质粒pKD46,设置电转化仪参数为1.8 kV进行电转化。电转化后的菌液28 ℃摇床培养1 h,然后涂布至含氨苄青霉素的LB平板,28 ℃倒置培养,次日挑取重组子CFT073/pKD46。

1.3.4 氯霉素抗性重组子的构建

过夜培养CFT073/pKD46,按1 : 1 000接种至SOB培养基,同时加入L-阿拉伯糖,使其终浓度为30 mmol·L-1,28 ℃振荡培养。菌液D600值≈0.6时制备CFT073/pKD46的感受态细胞。将制备好的CFT073/pKD46感受态细胞转入预冷的电击杯中,加入打靶DNA片段,进行电击。电击结束后,将菌液转移至SOC培养基中,37 ℃振荡培养1 h,然后室温静置过夜。将菌液涂布于含氯霉素的LB平板,37 ℃倒置培养。挑取单菌落于含氯霉素的LB培养基振荡培养,并用PCR验证引物进行PCR验证,得到氯霉素抗性基因取代c5032c5037基因的重组子CFT073Δc5032Cmrc5037

1.3.5 氯霉素抗性基因消除的验证

利用电转化法将质粒pCP20转化到氯霉素抗性重组子中,在抗性平板上挑取单菌落,接种LB培养基,37 ℃振荡培养24 h后进行划线培养。挑取单菌落,分别接种至含氯霉素的LB平板和不含氯霉素的LB平板,选择在无抗性平板上生长但在含氯霉素平板上不能生长的菌落,利用验证引物对c5032c5037 -F/R和内部验证引物对C1/C2进行PCR验证,筛选出基因缺失菌株CFT073Δc5032c5037。为进一步验证目的基因是否敲除,将验证引物扩增的PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序并对测序结果进行比对。

1.4 基因缺失株生长特性的测定 1.4.1 基因缺失株在LB培养基中的生长特性测定

将野生型CFT073和基因缺失株CFT073Δc5032c5037分别在LB固体平板上划线培养,挑取单菌落,分别接种至LB液体培养基活化,活化的菌液按1 : 100分别接种于50 mL LB液体培养基,37 ℃振荡培养,每隔一定时间测定菌液D600值。以培养时间为横坐标,菌液D600为纵坐标,绘制野生型和基因缺失型菌株的生长曲线。

1.4.2 基因缺失株在M9培养基中的生长特性测定

分别挑取活化的CFT073和CFT073Δc5032c5037单菌落接种至3 mL LB培养基中37 ℃振荡培养。菌液D600≈1.0时,离心,弃上清液,用灭菌PBS缓冲液洗涤,高速离心,用3 mL灭菌PBS缓冲液重溶沉淀,按1 : 100比例接种至以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中,37 ℃振荡培养,每隔一定时间测定菌液D600值。厌氧培养时,将接种菌的M9培养基放入培养袋(15 cm×30 cm)中,再放入厌氧产气袋,然后密封培养袋的袋口,厌氧产气袋在30~60 min内完全吸收培养袋中的氧气,产生约21%的二氧化碳,形成厌氧环境。

2 结果与分析 2.1 氯霉素抗性重组子的构建

在氯霉素抗性平板上挑取筛选的单菌落,以c5032c5037 -F/R为引物对进行PCR扩增,野生型CFT073的PCR产物大小应为8 264 bp,而氯霉素抗性基因取代c5032c5037后,PCR产物大小为1 765 bp。琼脂糖凝胶电泳结果如图 1所示,PCR扩增产物的大小与目的片段一致。

图 1 氯霉素抗性重组子的PCR鉴定 Figure 1 PCR identifications of chloramphenicol resistant mutants M. DNA marker:1, 2. CFT073Δc5032Cmrc5037;3. CFT073.

氯霉素内部基因检测引物C2和c5032c5037-R组合进行PCR验证,扩增产物为407 bp(图 2-A);C1和c5032c5037 -F组合进行PCR验证,扩增产物为649 bp(图 2-B)。

图 2 CFT073Δc5032Cmrc5037的PCR鉴定 Figure 2 PCR identification of CFT073Δc5032-Cmr-c5037 M. DNA marker;1,2. CFT073Δc5032Cmrc5037;3. CFT073;4,5. CFT073Δc5032Cmrc5037;6. CFT073.
2.2 氯霉素抗性基因的消除

通过PCR和基因测序鉴定氯霉素抗性基因是否消除。用引物对c5032c5037 -F/R进行PCR验证,CFT073Δc5032c5037 PCR产物大小为835 bp,CFT073Δc5032Cmrc5037 PCR产物大小为1 765 bp(图 3-A);用内部引物对c5032 -inner-F/R进行PCR验证,CFT073Δc5032c5037无法进行PCR扩增,CFT073 PCR产物大小为1 016 bp(图 3-B)。

图 3 CFT073Δc5032c5037的PCR鉴定 Figure 3 PCR identification of CFT073Δc5032-c5037 mutants M. DNA marker;1,2. CFT073Δc5032c5037;3. CFT073Δc5032Cmrc5037;4,5. CFT073Δc5032c5037;6. CFT073.

将DNA测序结果与原基因序列进行比对,结果显示,c5032c5037基因已不在测序结果中,进一步印证了c5032c5037基因敲除成功。

2.3 基因缺失株的生长特性 2.3.1 有氧条件下基因缺失株的生长特性测定

基因缺失株和野生型菌株分别在LB培养基和以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中培养,以培养时间为横坐标,以菌液吸光度D600值为纵坐标,绘制生长曲线。结果如图 4所示:基因缺失株和野生型菌株在有氧条件下生长曲线保持一致,没有显著性差异。生长试验结果表明,在有氧条件下, c5032c5037基因的敲除未对UPEC在LB培养基中的生长和对α-酮戊二酸的利用造成不利影响。

图 4 CFT073Δc5032c5037和CFT073在LB培养基(A)和M9培养基(B)中的生长曲线 Figure 4 The growth curves of CFT073Δc5032-c5037 and CFT073 in LB medium(A) and M9 medium(B)
2.3.2 厌氧条件下基因缺失株的生长特性测定

厌氧条件下基因缺失株CFT073Δc5032c5037和野生型菌株CFT073在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中的生长试验结果(图 5)显示:在厌氧条件下在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中,CFT073Δc5032c5037生长比野生型菌株CFT073慢,且差异极显著(P < 0.01),说明c5032c5037基因的缺失导致CFT073在厌氧条件下对α-酮戊二酸的利用能力明显降低。

图 5 CFT073Δc5032c5037和CFT073厌氧培养结果 Figure 5 Growth of CFT073Δc5032-c5037 and CFT073 under anaerobic conditions **P < 0.01.
3 讨论

基因敲除是研究基因功能的重要手段。对序列已知但功能未知的基因,通过采用同源重组等分子手段敲除该基因,通过对敲除基因生物体与其亲本对照试验,发现基因敲除后对生物体造成的功能缺失,以此来推测该基因的生物学功能。本研究利用Red重组系统,通过带c5032c5037同源臂的氯霉素抗性基因与c5032c5037基因发生同源重组,从而取代了c5032c5037基因,而氯霉素抗性基因在pCP20表达的反转重组酶作用下被消除。对构建的基因缺失株进行的一系列PCR验证及测序分析结果均表明已成功敲除了c5032c5037基因,为深入研究c5032c5037基因的功能奠定基础。

c5032c5037基因由KguS/KguR调控,其编码的蛋白与sucABCD基因编码的α-酮戊二酸脱氢酶和琥珀酰辅酶A合成酶具有较高的相似性,其中c5032c5034c5035编码的蛋白分别与α-酮戊二酸脱氢酶的E1、E2和E3亚基的相似性达到64%、69%和55%,而c5036c5037编码的蛋白与琥珀酰辅酶A合成酶α和β亚基的相似性达到83%和70%[4]。α-酮戊二酸脱氢酶是三羧酸循环中的关键酶,可催化α-酮戊二酸、辅酶A和NAD+生成乙酰辅酶A、NADH和CO2,而琥珀酰CoA合成酶是三羧酸循环中的另一种重要酶,能够催化琥珀酰CoA高能硫酯键水解,为细胞生命活动提供能量[7-8]。由此推测c5032c5037基因对CFT073的生长代谢具有重要作用。研究还发现大肠杆菌在单独敲除sucABsucCD时可以生存,这是因为sucABsucCD编码的酶产生的琥珀酰辅酶A能够满足细菌生存需要,但是同时敲除sucABsucCD,基因缺失菌株无法存活[9]。本试验中我们不仅同时敲除了c5032c5035基因和c5036c5037基因,成功构建了缺失株CFT073Δc5032c5037,而且在有氧条件下通过对野生型CFT073和CFT073Δc5032c5037在LB培养基和M9培养基生长测定,发现CFT073Δc5032c5037和CFT073的生长趋势保持一致,说明在有氧条件下c5032c5037基因对CFT073的生长不起作用。在厌氧条件下,在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中,CFT073Δc5032c5037的生长速度明显慢于野生型CFT073,表明厌氧条件下c5032c5037的缺失会导致CFT073利用α-酮戊二酸的能力减弱,从而证实厌氧条件下KguS/KguR能够调控c5032c5037基因利用α-酮戊二酸以提高UPEC的生存能力。对肾盂肾炎的组织活检发现UPEC感染常发生在肾元的近曲小管[2],而近曲小管的α-酮戊二酸含量丰富,浓度达到100~400 μmol·L-1,是其他细胞中α-酮戊二酸浓度的10~40倍[10-11],推测UPEC在厌氧条件下通过KguS/KguR调控c5032c5037基因利用α-酮戊二酸以提高在肾脏中的生存能力。本文通过构建缺失株CFT073Δc5032c5037并测定其生长特性,证实了c5032c5037基因与厌氧条件下利用α-酮戊二酸密切相关,为进一步研究KguS/KguR如何调节c5032c5037基因利用α-酮戊二酸以提高在肾脏的代谢适应机制奠定了基础。

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