南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (6): 1093-1099   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201804005
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侯金秀, 郑阳, 李照耀, 胡峰, 陈熊男, 张云娜, 周斌
HOU Jinxiu, ZHENG Yang, LI Zhaoyao, HU Feng, CHEN Xiongnan, ZHANG Yunna, ZHOU Bin
猪瘟病毒非结构蛋白NS3和NS5B多克隆抗体的制备和鉴定
Preparation and identification of polyclonal antibody against NS3 and NS5B proteins of classical swine fever virus
南京农业大学学报, 2018, 41(6): 1093-1099
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(6): 1093-1099.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201804005

文章历史

收稿日期: 2018-04-04
猪瘟病毒非结构蛋白NS3和NS5B多克隆抗体的制备和鉴定
侯金秀1 , 郑阳1 , 李照耀1 , 胡峰2 , 陈熊男1 , 张云娜1 , 周斌1     
1. 南京农业大学动物医学院, 江苏 南京 210095;
2. 南京农业大学校医院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本试验旨在制备特异性鼠抗猪瘟病毒(CSFV)非结构蛋白NS3和NS5B的多克隆抗体。[方法]根据CSFV NS5B基因序列设计1对特异性引物,以CSFV石门株为模板PCR扩增NS5B基因,同时根据大肠杆菌对密码子的偏嗜性优化了NS3密码子,并将NS3NS5B基因分别克隆至原核表达载体pColdI,转化至大肠杆菌Rossetta 2(R2),经0.1 mmol·L-1 IPTG诱导后进行融合蛋白的表达和纯化,常规免疫BALB/c小鼠制备抗血清。应用Western blot和间接免疫荧光技术鉴定了多克隆抗体的特异性。[结果]Western blot结果显示,该抗血清不仅能识别原核和真核表达的NS3和NS5B蛋白,也能识别细胞中感染的CSFV并产生特异性条带;间接免疫荧光检测结果表明,2种抗血清除均能与胞浆中的CSFV粒子发生反应外,也能识别宿主细胞中真核表达的NS3和NS5B蛋白。[结论]本试验成功表达了NS3和NS5B,且用其制备的抗血清具有生物学功能,为深入探究猪瘟病毒致病机制奠定了基础。
关键词猪瘟病毒   非结构蛋白3(NS3)   NS5B   原核表达   多克隆抗体   鉴定   
Preparation and identification of polyclonal antibody against NS3 and NS5B proteins of classical swine fever virus
HOU Jinxiu1, ZHENG Yang1, LI Zhaoyao1, HU Feng2, CHEN Xiongnan1, ZHANG Yunna1, ZHOU Bin1    
1. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. School Hospital, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The paper aims to prepare polyclonal antibody against non-structural protein 3 (NS3) and non-structural protein 5B (NS5B) of classical swine fever virus (CSFV). [Methods] The NS5B gene was amplified from RNA of the CSFV Shimen strain using a pair of specific primers by RT-PCR. The NS3 gene was codon-optimized according to the preference of Escherichia coli (E. coli). NS3 and NS5B were cloned into prokaryotic expression vector pColdI, respectively, and transformed into E. coli R2 (Rossetta 2). Fusion protein was expressed and purified after induced by 0.1 mmol·L-1IPTG, then polyclonal antibody was prepared by immunizing BALB/c mice with purified NS3 and NS5B protein. The specificity of polyclonal antibody was identified by Western blot and indirect immunofluorescence assay. [Results] Western blot results showed that antiserum could not only recognize prokaryotic and eukaryotic NS3 or NS5B protein, but also recognize CSFV, which caused specific bands; indirect immunofluorescence results showed that both antisera could react with CSFV particles in the cytoplasm and recognize the eukaryotic NS3 or NS5B protein in host cells. [Conclusions] The results showed that NS3 and NS5B protein were expressed successfully and the prepared antiserum had biological function. This study laid a foundation for further research of the role of NS3 and NS5B protein in the pathogenesis of CSFV.
Keywords: classical swine fever virus    non-structural protein 3(NS3)    non-structural protein 5B(NS5B)    prokaryotic expression    polyclonal antibody    identification   

猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的猪高度接触性致死性传染病,对养猪业造成严重危害。CSFV为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员,同属的还有牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和羊边界病病毒(BDV)[1]。CSFV为有囊膜的单股正链RNA病毒,病毒全基因组大小为12.3 kb,由5′非编码区(含有IRES)、开放阅读框(ORF)和缺少polyA的3′非编码区组成[2-3]。ORF编码3 898个氨基酸组成的多聚蛋白,主要排列顺序从N端至C端依次为Npro—C—Erns—E1—E2—p7—NS2—NS3—NS4A—NS4B—NS5A—NS5B[4-5]

NS3和NS5B为CSFV的非结构蛋白,在CSFV复制过程中起着重要作用。NS3蛋白由683个氨基酸组成,相对分子质量为76×103[6]。NS3蛋白能与RNA结合,具有丝氨酸蛋白酶活性、核苷酸活性和RNA解旋酶(NTPase)活性[7]。NS3蛋白与细胞转化相关,是病毒致病性标志。Xu等[8]构建pEGFP-C1-NS3转染PK-15细胞后,发现pEGFP-C1-NS3阳性细胞中的细胞病变(CPE)是由细胞凋亡诱导的,NS3的表达与细胞凋亡有关。NS5B蛋白是RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp),包含718个氨基酸,相对质分子质量为82×103,它能结合基因组3′-UTR的同源序列并启动翻译过程。NS5B蛋白主要分布在细胞质膜附近,具有RdRp活性[9];NS5B不但可作为病毒复制酶[10],还具有核苷酸转移酶(TNTase)活性[11]

本试验根据大肠杆菌对密码子的偏嗜性优化了NS3密码子[12],截取了NS5B第239~479位氨基酸,使NS3NS5B这2段基因利于在大肠杆菌原核表达系统中表达,将纯化得到的NS3和NS5B蛋白分别免疫BALB/c小鼠[13],获得了具有生物学活性的多克隆抗体,将有助于对NS3和NS5B蛋白结构、功能以及在CSFV致病机制上的研究。

1 材料与方法 1.1 菌株、细胞和试验动物

猪瘟病毒石门株购自中国兽医药品监察所;载体pColdI、大肠杆菌DH5α、Rossetta 2(R2),质粒pcDNA3.0-NS3和pcDNA3.0-NS5B、PK-15细胞均由本实验室保存。6周龄BALB/c雌性小鼠12只,SPF级,购自南京农业大学实验动物中心。

1.2 主要试剂

病毒RNA提取试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司;高保真Taq酶购自英潍捷基(上海)贸易有限公司;蛋白质标准品购自美国Thermo scientific公司;RNA反转录试剂盒、DNA标准品、胶回收试剂盒、限制性内切酶KpnⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、T4连接酶购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司;质粒提取试剂盒购自美国Omega公司;ECL发光试剂盒购自Bio-Rad生命医学产品(上海)有限公司;镍磁珠购自英芮诚生化科技(上海)有限公司;鼠源6×His单抗购自Cell Signaling Technology公司;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国Sigma-Aldrich公司;DMEM、胎牛血清购自Gibco公司;CSFV多克隆抗体由哈尔滨兽医研究所仇华吉研究员惠赠;荧光标记羊抗鼠IgG购自Santa Cruz公司。

1.3 基因合成与引物设计

根据CSFV基因组序列(AF092448.2)NS3基因的高级结构及GC含量、大肠杆菌宿主密码子使用频率等,利用Rare Codon Caltor分析了NS3基因中含有的稀有密码子,并进行优化[14-15],优化后序列由武汉金开瑞生物工程有限公司合成;根据CSFV基因组序列(AF092448.2)NS5B基因序列,用SnapGene软件设计1对特异引物:P1:5′-TGACGGTACC ATGAAAGTCGAAGAGATTATTGACAATCT-3′(KpnⅠ),P2:3′-TGACAAGCTT TTAGATCTTCTGGGGCTTCCC(HindⅢ),下划线部分为酶切位点。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 NS3NS5B基因的克隆

提取猪瘟病毒石门株RNA,RT-PCR扩增NS5B基因(720 bp)。用KpnⅠ和HindⅢ分别对载体pColdI和胶回收纯化的NS5B产物进行酶切,用KpnⅠ和BamHⅠ分别对pColdI和胶回收纯化的NS3产物进行酶切,对双酶切产物胶进行回收、纯化。纯化的酶切产物用T4连接酶于16 ℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂布于具有氨苄抗性的LA平板,37 ℃培养过夜。将PCR扩增、酶切和测序鉴定正确的阳性克隆分别命名为pColdI-NS3和pColdI-NS5B

1.5 NS3NS5B基因在大肠杆菌中的表达与纯化

将空载体质粒pColdI、重组质粒pColdI-NS3、pColdI-NS5B分别转化Rossetta 2感受态细胞,转化后的阳性克隆37 ℃振荡培养至D600为0.6~0.8,加入IPTG(终浓度0.1 mmol·L-1)18 ℃振荡诱导培养过夜,同时设置诱导的Rossetta 2空菌作为阴性对照。诱导后的菌液4 ℃离心,收集菌体,PBS重悬菌体后使用超声波破碎仪于冰上破碎,高速离心后分离上清液和包涵体,加入5×SDS电泳上样缓冲液煮沸,进行SDS-PAGE,并对其进行考马斯亮蓝染色和脱色,观察重组蛋白的表达情况。

1.6 多克隆抗体的制备

大量诱导表达的NS3和NS5B产物以包涵体形式存在,包涵体经8 mol·L-1尿素溶解,用His标签蛋白磁珠进行纯化。纯化的蛋白经透析复性、去除蛋白中咪唑等有害物质后,以每只50~100 μg的剂量与弗氏完全佐剂(1 : 1)乳化后免疫小鼠,首免后每隔14 d将纯化蛋白经弗氏不完全佐剂(1 : 1)乳化后进行二免和三免,三免7 d后小鼠眼眶静脉丛采血,分离血清于-80 ℃保存备用。

1.7 Western blot检测多克隆抗体的反应性

将生长状态良好的PK-15细胞接种6孔板,待细胞长至70%~90%贴壁时,分别对不同细胞孔瞬时转染重组质粒pcDNA3.0-NS3、pcDNA3.0-NS5B、感染CSFV,同时设置未转染质粒、未接毒的细胞孔作为阴性对照;24 h后收取瞬时表达细胞样本,48 h后收取CSFV感染的细胞样本。分别用重组NS3和NS5B蛋白以及瞬时表达的NS3和NS5B蛋白、CSFV感染PK-15细胞48 h后进行SDS-PAGE,转印PVDF膜,100 g·L-1脱脂奶粉室温封闭1 h。PBST洗膜3次,分别经1 : 1 000稀释的鼠源6×His单抗、抗NS3多抗和抗NS5B多抗4 ℃孵育过夜,PBST洗膜3次,加入HRP标记羊抗鼠IgG(1 : 10 000稀释)室温下孵育1 h;重组蛋白NS3和NS5B经1 : 200稀释的抗CSFV多抗4 ℃孵育过夜,PBST洗膜3次后,加入HRP标记羊抗猪IgG(1 : 100 000稀释)室温下孵育1 h。PBST洗膜3次后加ECL试剂曝光观察结果。

1.8 间接免疫荧光(IFA)检测多克隆抗体的反应性

将PK-15细胞分别瞬时转染pcDNA3.0-NS3和pcDNA3.0-NS5B、感染CSFV(MOI为1),未转染质粒、未接毒的PK-15细胞作为阴性对照。PK-15细胞经转染质粒24 h或者感染CSFV 48 h后,4%多聚甲醛固定细胞,X-Triton透膜,10%羊血清封闭,1 : 200稀释的抗CSFV多抗、小鼠抗NS3多抗和小鼠抗NS5B多抗37 ℃分别孵育2 h,PBST洗涤3次,再加入1 : 100稀释的荧光标记山羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h,PBST洗涤3次,DAPI染核20 min,激光共聚焦显微镜观察。

2 结果与分析 2.1 NS3密码子优化及NS5B抗原表位选择

根据CSFV NS3基因序列中的稀有密码子分布情况(表 1),依据大肠杆菌对特定密码子的偏嗜性,改变原基因序列中的部分稀有密码子,使序列中只含有2个ACG,并使NS3基因各位点GC含量均匀分布在40%(图 1-A),使该基因利于在大肠杆菌中表达。另外,经DNAStar分析,选择NS5B基因亲水性及抗原性皆好的第239~479位氨基酸进行克隆表达(图 1-B)。

表 1 猪瘟病毒NS3基因中含有的大肠杆菌Rossetta 2(R2)稀有密码子及其编码的氨基酸 Table 1 Rare codons and encoded amino acid of E. coli Rossetta 2(R2)contained in CSFV NS3 gene
稀有密码子(编码氨基酸)
Rare codon(encoded amino acid)
出现次数
Occurrence
频率/%
Frequency
CGA(Arg) 1 0.1
CGG(Arg) 3 0.4
AGG(Arg) 18 2.6
AGA(Arg) 16 2.3
GGA(Gly) 16 2.3
GGG(Gly) 20 2.9
AUA(Iso) 21 3.0
CUA(Leu) 6 0.8
CCC(Pro) 5 0.7
ACG(Thr) 6 0.8
总计Total 112 16.1
图 1 NS3和NS5B蛋白的特性分析 Figure 1 Analysis of NS3 and NS5B protein properties A.优化NS3基因的GC含量;B.NS5B多肽链的亲水性分析。 A. Optimize GC content of NS3 gene; B. Hydrophilic analysis of NS5B polypeptide chain.
2.2 构建NS3和NS5B原核表达载体

合成的NS3基因(2 049 bp)经KpnⅠ和BamHⅠ酶切后连接pColdI;以CSFV石门株基因组cDNA为模板,PCR扩增得到720 bp的NS5B基因片段,扩增产物经KpnⅠ和HindⅢ酶切后连接pColdI。重组表达质粒双酶切鉴定结果表明:NS3基因和NS5B基因成功连接至pColdI(图 2-AB),且重组质粒测序正确。

图 2 重组质粒pColdI-NS3 (A)和pColdI-NS5B(B)的双酶切鉴定 Figure 2 Identification of recombinant plasmid pColdI-NS3 and pCold I-NS5B M.核酸标准品(DL5000);1、2.分别为pColdI-NS3和pColdI质粒均经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切的产物;3、4.分别为pColdI-NS5B和pColdI质粒均经KpnⅠ和HindⅢ双酶切的产物。 M. DNA marker(DL5000);1, 2. The pColdI-NS3 and pColdI plasmid were digested by KpnⅠ and BamHⅠ, restpectively; 3, 4. The pColdI-NS5B and pColdI plasmid were digested by KpnⅠ and HindⅢ, respectively.
2.3 NS3和NS5B重组蛋白的表达、纯化及鉴定

将重组菌株R2(pColdI-NS3)、R2(pColdI-NS5B)经IPTG诱导后表达成功的包涵体产物进行洗涤和溶解,用His标签蛋白磁珠进行纯化。SDS-PAGE结果显示:在相对分子质量约80×103处可见NS3蛋白(图 3-A),在相对分子质量约27×103处可见NS5B(图 3-B),且2种重组蛋白主要以包涵体形式存在,并经镍磁珠纯化获得了高纯度重组蛋白。

图 3 重组蛋白NS3(A)和NS5B(B)的SDS-PAGE鉴定 Figure 3 SDS-PAGE identification of recombinant proteins NS3 and NS5B M.蛋白标准品;1.诱导的R2;2.诱导的R2(pColdI);3.诱导的R2(pColdI-NS3/NS5B)上清液;4.诱导的R2(pColdI-NS3/NS5B)包涵体;5.诱导的R2(pColdI-NS3/NS5B)全菌;6.纯化后的NS3/NS5B。 M. Protein marker; 1. Induced R2;2. Induced R2(pColdI); 3. Induced R2(pColdI-NS3/NS5B)supernatant; 4. Induced R2(pColdI-NS3/NS5B)inclusion bodies; 5. Induced R2(pColdI-NS3/NS5B); 6. Purified NS3 or NS5B.
2.4 Western blot结果分析

用原核表达的重组NS3和NS5B蛋白、真核表达的NS3和NS5B蛋白、感染CSFV 48 h后的PK-15细胞裂解物分别进行Western blot分析。结果显示:重组蛋白NS5B和NS3能被抗CSFV多抗能识别(图 4-A),用鼠源6×His单抗能检测出重组蛋白NS5B和NS3(图 4-BC),小鼠抗NS3多抗能与重组NS3蛋白(图 4-D)、瞬时表达的NS3蛋白(图 4-E)和病毒感染的细胞裂解物发生反应(图 4-F);同样,小鼠抗NS5B多抗能与重组NS5B蛋白(图 4-G)、瞬时表达的NS5B蛋白(图 4-H)和CSFV感染的细胞裂解物发生反应(图 4-I)。其中,因 NS2-NS3NS5A-NS5B位点切割不完全会分别形成蛋白二聚体NS2-3(图 4-F)和NS5A/B(图 4-I)。

图 4 Western blot检测多抗的反应性 Figure 4 Western blot detection of polyclonal antibody reactivity A.检测抗CSFV多克隆抗体与重组蛋白NS3/NS5B反应性(M.蛋白标准品;1. NS3;2. NS5B;3. pColdI);B、C.检测6×His单抗与重组蛋白NS3/NS5B反应性;D、G.检测抗NS3/NS5B多抗与重组蛋白NS3/NS5B反应性(M.蛋白标准品;1. NS3/NS5B;2. pColdI);E、H.检测抗NS3/NS5B多抗与瞬时转染NS3/NS5B反应性(M.蛋白标准品;1. NS3/NS5B;2. Mock);F、I.检测抗NS3/NS5B多抗与CSFV反应性(M.蛋白标准品;1. CSFV;2. Mock)。 A. Detection of anti-CSFV polyclonal antibodies and recombinant protein NS3/NS5B reactivity(M. Protein marker; 1. NS3;2. NS5B;3. pColdI); B, C. Detection of 6×His-McAb reactivity with recombinant protein NS3/NS5B;D, G. Detection of NS3/NS5B pAb reactivity with recombinant protein NS3/NS5B(M. Protein marker; 1. NS3/NS5B;2. pColdI); E, H. Detection of NS3/NS5B pAb reactivity with transient transfection of NS3/NS5B(M. Protein marker; 1. NS3/NS5B;2. Mock); F, I. Detection of NS3/NS5B pAb reactivity with CSFV(M. Protein marker; 1. CSFV; 2. Mock).
2.5 间接免疫荧光(IFA)结果分析

激光共聚焦显微镜观察结果显示:抗CSFV多抗能识别CSFV病毒(图 5-A),小鼠抗NS3多抗(图 5-B)和抗NS5B多抗(图 5-C)能分别与瞬时表达的NS3和NS5B、感染CSFV石门株的PK-15细胞发生反应,在感染病毒的PK-15细胞胞浆中发现有特异性红色荧光;而空白对照细胞PK-15胞浆中未发现有特异性红色荧光。

图 5 间接免疫荧光试验(IFA)检测多抗的反应性 Figure 5 Indirect immunofluorescence assay(IFA)to detect the reactivity of polyclonal antibodies A. CSFV与抗CSFV多抗反应性鉴定;B. CSFV、pcDNA3.0-NS3、Mock与抗NS3多抗反应性鉴定;C. CSFV、pcDNA3.0-NS5B、Mock与抗NS5B多抗反应性鉴定。 A. Identification of CSFV and anti-NS3 pAb reactivity; B. Identification of CSFV, pcDNA3.0-NS3, Mock and anti-NS3 pAb reactivity; C. Identification of CSFV, pcDNA3.0-NS5B, Mock and anti-NS5B pAb reactivity.
3 讨论

CSFV的12种蛋白中,Erns和E2能诱导猪瘟病毒中和抗体产生[16],Erns蛋白可用于CSFV血清学检测,能鉴别疫苗免疫和流行毒株感染[17];E2蛋白亚单位疫苗已得到广泛应用[18]。陆欣然等[19]建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体间接ELISA检测方法,但NS3蛋白在临床上尚未得到广泛应用。尽管有许多研究证明了NS3和NS5B功能,如Zhu等[20]发现NS5B蛋白可以通过刺激NS3蛋白来提高翻译的速率,NS5B蛋白也可以与NS3蛋白的蛋白酶结构域反应来削弱NS3蛋白和IRES的相互作用,但NS3和NS5B作为CSFV 2种重要的非结构蛋白,其功能仍需进一步探究。

NS3基因长度为2 049 bp,NS5B基因长度为2 154 bp,利用Rare Codon Caltor和DNAStar软件分析出NS 3NS5B基因中含有大量稀有密码子和疏水基团,这也是这2种蛋白在原核表达系统中表达相对困难的原因,因此本研究通过优化NS3密码子和选取NS5B 239~479位亲水区域,利用大肠杆菌表达系统成功表达并纯化出了NS3和NS5B蛋白,制备出具有生物学活性的特异性多克隆抗体。本试验中使用的pCold载体是由Qing等[21]2004年开发的冷休克载体,其已被用于表达许多使用常规载体难以表达的蛋白质[22]。低温诱导重组子能使目的蛋白高效表达,也能利于目的蛋白积累和产生可溶性蛋白。此外,本试验采用镍磁珠纯化蛋白,优化蛋白纯化流程,能更快速简便地纯化出目的蛋白,获得的重组蛋白纯度高。

研究表明,在瘟病毒中NS2/3位点切割不完全,多以NS3和NS2-3这2种形式出现。NS3蛋白是鉴定致细胞病变BVDV毒株的重要标志[23],而猪瘟病毒中的NS2-3为一种免疫优势蛋白[24]。本试验的Western blot结果表明,1 : 1 000稀释的2种多克隆抗体能分别与相应的重组蛋白、宿主真核表达蛋白反应;其中抗NS3多抗能识别CSFV感染PK-15细胞后表达的NS2-3蛋白,未检测到NS3单体蛋白,抗NS5B多抗能识别CSFV感染PK-15细胞后表达的NS5B蛋白和NS5A/B二聚体,此结果也与Lamp等[4]的研究结果相似。IFA结果显示,1 : 200稀释的2种多克隆抗体均能识别瞬时表达的NS3和NS5B蛋白以及感染CSFV的PK-15细胞蛋白,并且均能在胞浆中观察到特异性荧光。

本试验成功制备了特异性鼠抗CSFV非结构蛋白NS3和NS5B的多克隆抗体,并且2种多克隆抗体均可应用于与CSFV相关的Western blot和IFA试验,为进一步研究NS3和NS5B蛋白结构功能及CSFV复制和致病机制提供了基础。

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