南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (6): 994-1002   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201801037
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汪影, 张昌伟, 吕善武, 侯喜林
WANG Ying, ZHANG Changwei, LÜ Shanwu, HOU Xilin
大白菜BrCNGC全基因组鉴定及其表达分析
Genome-wide identification and expression analysis of BrCNGC in Chinese cabbage
南京农业大学学报, 2018, 41(6): 994-1002
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(6): 994-1002.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201801037

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收稿日期: 2018-01-23
大白菜BrCNGC全基因组鉴定及其表达分析
汪影 , 张昌伟 , 吕善武 , 侯喜林     
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区 园艺作物生物学与种质创新重点实验室, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在研究大白菜环核苷酸门控离子通道基因(BrCNGC)的进化关系、结构特征、染色体定位及其表达模式。[方法]通过生物信息技术对大白菜BrCNGC进行分子进化分析、功能结构分析、染色体定位分析、保守结构域分析,并且通过荧光定量PCR分析该基因家族在脱落酸(ABA)+芜菁花叶病毒(TuMV)、水杨酸(SA)+TuMV、茉莉酸甲酯(MeJA)+TuMV和抗坏血酸(AsA)+TuMV处理下的表达差异。[结果]大白菜BrCNGC家族有26个成员,可分为4个组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),其中第Ⅳ组又可以分为2个亚组(Ⅳa和Ⅳb)。它们分布在9条染色体上,1号染色体上BrCNGC数量最多(有5个),5号染色体上只有1个BrCNGC基因,而8号染色体上没有BrCNGC基因分布。基因结构分析表明:该家族基因中共鉴定出10种motif,其中有14个BrCNGC蛋白都包含这10种motif,同组成员之间的motif组成相似。荧光定量PCR结果表明:在植物生长调节剂与TuMV相互作用下,大部分BrCNGC的表达量上调,少数BrCNGC的表达量下调。[结论]大白菜BrCNGC结构高度保守,其在大白菜抵御TuMV侵染过程中发挥一定的作用,该发现为以后进一步研究BrCNGC的功能奠定了基础。
关键词大白菜   环核苷酸门控离子通道基因(CNGC)   全基因组分析   芜菁花叶病毒(TuMV)   荧光定量PCR   
Genome-wide identification and expression analysis of BrCNGC in Chinese cabbage
WANG Ying, ZHANG Changwei, LÜ Shanwu, HOU Xilin    
State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The aim of this study is to investigate the evolutionary relationships, structural features, chromosomal location of the cyclic nucleotide gated ion channel genes in Chinese cabbage (BrCNGC) and to analyze their expression parterns under different treatments. [Methods] The bioinformatics techniques were used to analyze the molecular evolution, genes structure, chromosomal location and conserved motifs of BrCNGC in Chinese cabbage. The expression level of BrCNGC was analyzed by quantitative RT-PCR under different treatments:abscisic acid (ABA)+Turnip mosaic virus (TuMV), salicylic acid (SA)+TuMV, methyl jasmonate (MeJA)+TuMV, and ascorbic acid (AsA)+TuMV. [Results] The results showed that there are 26 BrCNGC genes in Chinese cabbage and can be classified into four major groups (Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ) and two subgroups (Ⅳa and Ⅳb), they were predicted to be located on 9 chromosomes, the chromosome 1 contained five BrCNGC, while the chromosome 5 only contained one BrCNGC and no BrCNGC on chromosome 8. Gene structure analysis showed that 10 kinds of motifs were identified in these genes, 14 BrCNGC proteins contained all of 10 motifs, and the genes that came from the same group shared similar motif composition. The results of quantitative RT-PCR showed that most BrCNGC genes up-regulated and few BrCNGC genes down-regulated by the interaction between plant growth regulator and TuMV. [Conclusions] The structure of BrCNGC in Chinese cabbage is highly conserved and they play a role in the protection against TuMV infection. This finding laid the foundation for the further study on the function of BrCNGC genes.
Keywords: Chinese cabbage    cyclic nucleotide gated ion channel gene(CNGC)    genome-wide analysis    Turnip mosaic virus(TuMV)    quantitative real-time PCR   

环核苷酸门控离子通道基因(CNGC)在1985年被Fesenko等[1]首次报道出来,在1998年,Schuurink等[2]又在大麦中发现了植物CNGC。随后,在拟南芥[3]、番茄[4]、水稻以及玉米[5]等植物中CNGC也被鉴定出来。目前,拟南芥AtCNGC的全基因组分析已经完成,AtCNGC家族由20个成员组成,根据系统发育关系将其分为4个组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),而第Ⅳ组又分为2个亚组(Ⅳa组和Ⅳb组)[6]。植物CNGC的分子结构和Shaker型钾离子电压门控离子通道非常相似[7],其预测结构由6个跨膜区(S1—S6)、S5和S6中间的孔状区(P环)、C末端钙调素结合结构域(CaMBD)和环核苷酸结合结构域(CNBD)组成[8],其中最保守的区域是CNBD中的磷酸结构域(PBC)及“hinge”区域[9-10]。研究表明,植物CNGC参与调节植物生长发育的众多进程,包括维持体内离子平衡[11],调节重金属毒害作用[3, 12],调控植物根系伸长与生长和花粉管伸长[13-14],参与植物免疫与抗病等过程[15-16]等,但其作用机制尚不清楚。

目前在拟南芥等植物中CNGC的研究比较深入,而对大白菜(Brassica rapa ssp. pekinensis)CNGC基因的研究较少。大白菜在我国栽培广泛并已逐渐成为一种世界性蔬菜,其基因组测序已经完成[17-18]。因此,CNGC全基因组在大白菜中的鉴定和分类具有重要的意义。本试验通过生物信息学方法分析了大白菜中的BrCNGC,对这些基因的进化关系、基因结构、染色体定位以及保守结构域进行分析,并分析了不同植物生长调节剂和芜菁花叶病毒(TuMV)共同处理下基因表达量的变化,为后期深入研究BrCNGC功能提供依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料和处理

供试材料为大白菜(Brassica rapa ssp. pekinensi)栽培品种‘Chiifu-401-42’,属于感芜菁花叶病毒(TuMV)病的品种。大白菜和TuMV均由南京农业大学白菜课题组提供。

先将大白菜种子放在培养皿中催芽,2 d后,将其移植到装有灭菌基质(草炭与蛭石体积比为3 : 1)的穴盘中,培养条件为光照(25 ℃)/黑暗(18 ℃),光周期16 h/8 h,相对湿度60%。30 d后,将生长健壮且长势一致的植株(5叶期)分为5个组,每组20株,分别用100 μmol · L-1脱落酸(ABA)、5 mmol · L-1水杨酸(SA)、50 μmol · L-1茉莉酸甲酯(MeJA)和5 mmol · L-1抗坏血酸(AsA)喷施植株叶片,2 d后,通过摩擦法[19]接种TuMV。在TuMV侵染后1、2、3、4和5 d取样,每处理重复3次。将样品迅速放入液氮中,随后转入-70 ℃冰箱中保存。

1.2 RNA提取和qRT-PCR

参照RNA Simple Total RNA Kit试剂盒(TIANGEN)说明书提取总RNA。以总RNA为模板,按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa,大连)试剂盒说明书反转录合成cDNA。荧光定量PCR体系参照SYBR PrimeScript RT-PCR Kit Ⅱ试剂盒(TaKaRa)说明书。PCR程序分2步进行:第1步为95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环;第2步为:65 ℃ 10 s,61个循环。内参基因为Actin(Bra 028615),用Beacon Designer 7.9设计引物(表 1),在大白菜数据库进行BLAST验证其特异性后再由南京擎科生物科技有限公司合成。基因的相对表达水平计算方法采用ΔΔCT法,相对表达量为2-ΔΔCT[20]

表 1 BrCNGC引物序列 Table 1 Primer sequence of BrCNGC
基因名称
Gene name
基因代码
Gene code
正向引物(5′→3′)
Forward primer
反向引物(5′→3′)
Reverse primer
BrCNGC1 Bra01186 ATGGAGGTTGAAGAAGAGA AACAAGGTCTAAGCATAGGT
BrCNGC2 Bra029958 GTTAATAGATGCTTACCTGGAAT TGGACTAATATGATGAAGAAGAA
BrCNGC3 Bra031529 GATTCATCCATCAGCGTAA CACTCACAACCTCACAAC
BrCNGC4 Bra031515 GTGGCATTGGCTATTGAT ATGATACTTGAGAACGAGGA
BrCNGC5 Bra021266 AACCAATGCCTACGAGAT ACTGCCTTCATATAGATTCCA
BrCNGC6 Bra020402 AACAATCAACAAGGAGTCATC GTCGTTCAAGCGTTATAGAG
BrCNGC7 Bra022702 AATGGTCTGAGGTTGTCTT TGAAGTTGTTGCGTGAAG
BrCNGC8 Bra022632 ACAGAGAAGACAGCAACA CCAATCAAGAAGGAGAACAG
BrCNGC9 Bra000937 ATGACAGAAGCGAAGAGAA CACATAAGAACGAAGAGAAGAG
BrCNGC10 Bra001676 ATTGTGAGAACTATAACGGATG AGCAGTAAGCCAACAGAT
BrCNGC11 Bra001678 AGATTGTGAGCGTCGTAA GAGATTGACTGCCTTCCA
BrCNGC12 Bra024067 ACCGTTGACTCGTTCTAA GCTTATTACTTGCTACTCTACAT
BrCNGC13 Bra032132 TCAGCAATCAGCAGAGAA GGTAGTCCTTATAGCATCAGA
BrCNGC14 Bra032081 CTTGTCCTCATTGTTCTTGTT GCTGTGGTTGTGACTACT
BrCNGC15 Bra034281 CCTGTGATTGATTCTCCTAAC GGCTATGAACTCGGTGAT
BrCNGC16 Bra004537 GCTTCCTTCTACAGTATCTCT TCTCAAGTTACCTTCTTATCCT
BrCNGC17 Bra026086 GCATCATCATCATCATACTCAT GGCTTCTTCCTTCATCCA
BrCNGC18 Bra018089 CGCCACCATAACAACAAC GTTCCATCTCGTGATTAGGT
BrCNGC19 Bra011963 CTAAGACAAGCCGTGAGA AACTAAGGAGATGAAGAATGAAG
BrCNGC20 Bra003323 TGGAAGACTACGAAGATGAG AGAGACACAGAACAATGGAT
BrCNGC21 Bra007839 GGCTTCAACTTCTTCTAACG CTTCAACTCAATCACACTCAA
BrCNGC22 Bra039221 GCTGAGGACGGTTATAGAT GATGTTGTTATACCTGTGGAA
BrCNGC23 Bra003081 GACAGACCTAACGGACTTAT GCTCACTTCACTCACTCT
BrCNGC24 Bra003001 TAACGAGAAGAAGACCACTT TCACATATTCCACTTACATAACC
BrCNGC25 Bra008699 TCTTCGGTTATTATGTTGATTGT TGCTTAGGCTCTGGTTAC
BrCNGC26 Bra008733 CAATGTTGGCGTCTAAGTT AATCAGGCTCATCAGGTT
Actin Bra028615 CTCAGTCCAAAAGAGGTATTCT GTAGAATGTGTGATGCCAGATC
1.3 BrCNGC基因的鉴定以及系统发育分析

为了鉴定大白菜BrCNGC,从TARI(https://www.arabidopsis.org/)获得20个AtCNGC编码的蛋白序列,然后使用BLASTp在大白菜数据库(http://brassicadb.org/brad/)中搜索大白菜CNGC蛋白,并在Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)和SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)将检索到的序列进行筛选。使用ClustalW对多重序列进行比对(选择默认参数)。用MEGA 7(http://www.megasoftware.net)进行AtCNGCBrCNGC的系统发育分析,采用邻接(NJ)法构建进化树,Bootstrap值设置为1 000。

1.4 BrCNGC基因的染色体定位和基因结构分析

从大白菜数据库获取26个BrCNGC在染色体上的位置,利用Perl脚本将BrCNGC定位于大白菜的10条染色体上,并绘制基因分布图。利用GSDS网站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析BrCNGC的基因结构,使用在线工具MEME(http://meme.nbcr.net/meme3/meme.html)预测BrCNGC所编码蛋白的保守结构。

2 结果与分析 2.1 BrCNGC基因的鉴定及系统发育分析

本试验共筛选出26个BrCNGC。根据它们在染色体上的分布,从上至下将26个BrCNGC命名为BrCNGC 1—BrCNGC26。它们都有相同的结构组分,例如环核苷酸结合结构域(CNBD)、环核苷酸结合蛋白(cNMP,PF00027)、跨膜结构域(TM)以及离子转运蛋白结构域(ITP,PF00520)(表 2)。根据AtCNGC的系统发育关系,通过比较分析将26个BrCNGC和20个AtCNGC编码的蛋白序列用于构建系统发育树(图 1),与AtCNGC类似,BrCNGC基因也分为4大组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)和2个亚组(Ⅳa和Ⅳb)。第Ⅰ组是最大的组,共13个成员,包括7个BrCNGC(BrCNGC4BrCNGC9BrCNGC13BrCNGC15BrCNGC16BrCNGC20BrCNGC23)和6个AtCNGC(AtCNGC1AtCNGC3AtCNGC10AtCNGC11AtCNGC12AtCNGC13);第Ⅱ组有5个BrCNGC(BrCNGC6BrCNGC8BrCNGC12BrCNGC17BrCNGC22)以及5个AtCNGC(AtCNGC5AtCNGC5AtCNGC7AtCNGC8AtCNGC9),该组中BrCNGC数量最少;第Ⅲ组有6个BrCNGC(BrCNGC1BrCNGC14BrCNGC18BrCNGC19BrCNGC21BrCNGC26)和5个AtCNGC(AtCNGC14AtCNGC15AtCNGC16AtCNGC17AtCNGC18);第Ⅳ组含有的BrCNGC数量最多(8个),其中第Ⅳa组由5个BrCNGC(BrCNGC2BrCNGC3BrCNGC5BrCNGC10BrCNGC11)和2个AtCNGC(AtCNGC19AtCNGC20)组成,第Ⅳb组由3个BrCNGC(BrCNGC7BrCNGC2BrCNGC25)和2个AtCNGC(AtCNGC2AtCNGC4)组成(图 1)。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的亲缘关系较近,而第Ⅳ组与其他组之间的亲缘关系相对较远,且其又分为2个亚组(Ⅳa和Ⅳb),亚组成员之间的亲缘关系也相对较远。

表 2 BrCNGC基因结构及染色体定位 Table 2 BrCNGC genes structure and chromosomes location
基因名称
Gene mane
染色体定位
Chromosomes location
氨基酸数
Amino acids number
内含子数
Intron number
基因结构Gene structure
染色体
Chromosome
位置
Location
Pfam SMART
BrCNGC1 A01 3422819~3426535 728 6 ITP CNBD cNMP 6TMD
BrCNGC2 A01 14741686~14746906 670 8 ITP cNMP 4TMD
BrCNGC3 A01 16542495~16546796 758 5 ITP cNMP 7TMD
BrCNGC4 A01 16651616~16656087 556 6 ITP cNMP 3TMD
BrCNGC5 A01 22102703~22106050 760 7 ITP cNMP 4TMD
BrCNGC6 A02 5537255~5540170 749 6 ITP CNBD cNMP 2TMD
BrCNGC7 A02 6903420~6907955 695 5 ITP cNMP 5TMD
BrCNGC8 A02 7390572~7393211 746 4 ITP cNMP 4TMD
BrCNGC9 A03 14054247~14058116 705 7 ITP cNMP 5TMD
BrCNGC10 A03 17833555~17836622 680 4 ITP cNMP 4TMD
BrCNGC11 A03 17843897~17852047 654 5 ITP cNMP 4TMD
BrCNGC12 A03 27904482~27907069 712 6 ITP CNBD cNMP 3TMD
BrCNGC13 A04 11074762~11077889 739 6 ITP CNBD cNMP 7TMD
BrCNGC14 A04 11383157~11386389 728 6 ITP CNBD cNMP 5TMD
BrCNGC15 A04 11980216~11982791 647 6 ITP cNMP 5TMD
BrCNGC16 A05 687357~690331 702 5 ITP CNBD cNMP 5TMD
BrCNGC17 A06 5904523~5907153 712 6 ITP CNBD cNMP 4TMD
BrCNGC18 A06 9846882~9849809 706 6 ITP CNBD cNMP 5TMD
BrCNGC19 A07 13141306~13144346 684 7 ITP CNBD cNMP 6TMD
BrCNGC20 A07 15879616~15883454 666 7 ITP cNMP 4TMD
BrCNGC21 A09 32710513~32713938 733 7 ITP CNBD cNMP 5TMD
BrCNGC22 A09 32929402~32932962 737 10 ITP cNMP 4TMD
BrCNGC23 A10 5414086~5416746 758 10 ITP CNBD cNMP 4TMD
BrCNGC24 A10 6203509~6208673 698 10 ITP cNMP 5TMD
BrCNGC25 A10 12252329~12255245 719 9 ITP CNBD cNMP 7TMD
BrCNGC26 A10 12426314~12429518 714 10 ITP CNBD cNMP 7TMD
注:ITP:离子转运蛋白Ion transport protein;CNBD:环核苷酸结合结构域Cyclic nucleotide-binding domain;cNMP:环核苷酸Cyclic nucleotide-monophosphate;TMD:跨膜区域Transmembrane domain.
图 1 BrCNGC蛋白和AtCNGC蛋白的进化树 Figure 1 Phylogenetic tree of BrCNGC and AtCNGC proteins 每个分支上的数字代表自展支持率。 The number on each branch represents its bootstrap value.
2.2 BrCNGC基因及其编码蛋白的结构分析

为了进一步研究蛋白质结构的多样性,使用MEME软件预测了BrCNGC所编码蛋白的结构,在这些蛋白中共鉴定出10种motif,命名为motif 1—motif 10(图 2)。如图 2所示:有14个BrCNGC蛋白均含有这10个motif,motif 1和motif 7在所有BrCNGC蛋白中都被鉴定出来,motif 3、motif 5和motif 6分别在25个BrCNGC蛋白中存在,表明BrCNGC蛋白具有高度保守的结构。此外,来自同一组的基因编码的蛋白具有相似的motif组成,这些基因的功能可能也类似。motif 8和motif 10在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组成员中均被鉴定出,而第Ⅳ组不含motif 8,这也进一步说明第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组亲缘关系较近,各组可能具有相似的功能;第Ⅳ组与其他组的亲缘关系较远,该组成员的功能可能与其他组的差异较大。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组BrCNGC的内含子数量为4~8,且多数为6,而第Ⅳ组BrCNGC的内含子数量为7~10,且多数为10,与前几组之间的差异较大;各个BrCNGC的内含子与外显子的位置及片段大小都有差异。

图 2 BrCNGC基因及其编码蛋白的结构分析 Figure 2 Structural analysis of BrCNGC genes and its encoded proteins A. BrCNGC蛋白系统发育关系分组;B. BrCNGC蛋白保守motif;C. BrCNGC基因内含子和外显子结构。 A. BrCNGC proteins were grouped according to their phylogenetic classification; B. The conserved motif of BrCNGC protein; C. Introns and exons structure of BrCNGC.
2.3 BrCNGC基因的染色体定位及保守结构域鉴定

通过Perl脚本将26个BrCNGC定位到10条染色体上,并绘制出BrCNGC的位置图谱(图 3)。在这10条染色体中除了8号染色体外都含有BrCNGC,且这些基因在染色体上呈不均匀分布。1号染色体上BrCNGC数量最多,有5个(约占19.2%),而5号染色体上只含有1个BrCNGCBrCNGC单独或成簇地分布于单个染色体上的所有区域(即端粒末端和着丝粒附近以及两者之间)。白菜基因组三倍化事件将基因组分为3个差异分离的亚基因组,包括最少分离亚组(LF)、中等分离亚组(MF1)和最多分离亚组(MF2)[17]。本研究中,可以将26个BrCNGC分成这3个亚基因组(图 3)。

图 3 BrCNGC的染色体定位 Figure 3 Chromosomal locations of BrCNGC genes LF:最少分离亚组Least fractionated;MF1:中等分离亚组Medium fractionated;MF2:最多分离亚组Most fractionated.

Zelman等[21]将20个AtCNGC蛋白的PBC和“hinge”区域进行多重比对,并得到以下特征序列:[21]-X(2)-[GS]-X-[FYIVS]-XGX(0,1)-[DE]-LL-X(8,25)-[1]-X(9)-[VLIT]-EXF-[62]。为了检验BrCNGC蛋白是否具有与拟南芥相似的特征序列,本研究进一步分析了BrCNGC蛋白的PBC和“hinge”区域,结果在PBC内发现了1个保守的(100%)二脂亮氨酸(I)和芳香色氨酸(W),同时还检测到假定的“hinge”区域也包含1个保守的(100%)亮氨酸(L)(图 4)。在26个BrCNGC蛋白的PBC以及“hinge”区域发现了1条高度保守的序列:X(4)-[DE]-LL-XWX-[LQ]-X(9,20)-SX(9)-[VT]-[DE]-[-[FL]-XL]。

图 4 BrCNGC蛋白的保守结构域分析 Figure 4 Conserved motifs analysis of BrCNGC proteins
2.4 BrCNGC在植物生长调节剂和芜菁花叶病毒(TuMV)共同处理下的表达量分析

荧光定量PCR结果(图 5)显示:BrCNGC的表达水平在不同处理下明显不同,脱落酸(ABA)+TuMV处理后,BrCNGC4BrCNGC15BrCNGC23BrCNGC24的相对表达量变化较明显,均呈先上升后下降的趋势;BrCNGC18的表达量变化也较显著,呈先降低后上升的趋势。水杨酸(SA)+TuMV处理后,BrCNGC2BrCNGC11BrCNGC14的相对表达量呈逐渐上升的趋势,BrCNGC4BrCNGC17BrCNGC23的表达量呈先上升后下降的趋势,BrCNGC5BrCNGC15BrCNGC16的相对表达量呈逐渐降低的趋势。茉莉酸甲酯(MeJA)+TuMV处理后,BrCNGC2BrCNGC4BrCNGC11BrCNGC14BrCNGC23的表达量呈先上升后下降的趋势,而BrCNGC18的表达量呈逐渐下降的趋势。抗坏血酸(AsA)+TuMV处理后,BrCNGC2BrCNGC11BrCNGC14的相对表达量呈逐渐上升的趋势,BrCNGC3BrCNGC4BrCNGC17BrCNGC23的相对表达量呈先上升后下降的趋势,BrCNGC5的相对表达量呈逐渐下降的趋势,BrCNGC8相对表达量呈先下降后上升的趋势。总之在这4个处理下,大部分BrCNGC在一定时间内表达量上调,但是上调量不明显,只有少数BrCNGC明显上调。同时也有几个基因表达量下调,例如BrCNGC7BrCNGC25在这4个处理下表达量均下调。总体而言,SA+TuMV和ASA+TuMV处理下BrCNGC的表达模式相似,基因相对表达量较高,ABA+TuMV和MeJA+TuMV处理下的BrCNGC表达模式相似。植物生长调节剂与TuMV相互作用能够诱导某些BrCNGC的高表达,并且这几种处理下BrCNGC的表达模式不同,说明响应每个处理的BrCNGC也不同,同时也说明了BrCNGC的功能多样性。

图 5 BrCNGC基因在不同胁迫处理下的表达模式 Figure 5 Expression patterns of BrCNGC genes under different stresses TuMV:芜菁花叶病Turnip mosaic virus;ABA:脱落酸Abscisic acid;SA:水杨酸Salicylic acid;MeJA:茉莉酸甲酯Methyl jasmonate;AsA:抗坏血酸Ascorbic acid.
3 讨论

环核苷酸门控通道(CNGC)被认为是植物Ca2+传导通道,在植物生长发育以及生物与非生物胁迫中起着重要的调控作用。AtCNGC1主要参与携带Ca2+,调节钙信号[13]AtCNGC4参与植物抗病性[22]AtCNGC10参与植物生长[23];番茄第Ⅳb亚组CNGC基因对植物真菌病害与病毒病有不同的调节作用[24];水稻中的CNGC基因在植物发育中也起着重要的作用,水稻CNGC基因启动子序列中含有许多对激素及不同生物和非生物因子的顺式作用调控元件[25]。这些基因的功能研究为后期研究BrCNGC功能奠定了理论基础。

本试验中共鉴定出26个BrCNGC基因。以前的研究表明,大多数被子植物都经历了一轮或多轮基因组加倍事件,大白菜的基因组大小几乎是拟南芥的3倍[19],但是在进化过程中发生了一些遗传丢失,因此,在大白菜数据库中只搜索到了26个BrCNGC基因。通过对基因结构和系统进化的分析,发现BrCNGCAtCNGC具有相似的结构,可以推测这些基因功能也相似。大白菜基因组共携带26个BrCNGC基因,与AtCNGC类似,它们可以分为4个主要组和2个亚组,但大白菜中每个亚组的基因数量与拟南芥不同,这一结果表明,不同进化分支的重复保留在物种之间有所不同。

研究表明,植物生长调节剂处理植株后再接种TuMV会降低植物体中TuMV的积累[26-27]。本试验中,选取4种在逆境胁迫过程中起重要作用的植物生长调节剂处理植株后再接种TuMV,通过荧光定量PCR分析BrCNGC在这些处理下的表达差异,结果发现在不同处理下BrCNGC的表达模式不同,说明BrCNGC能够响应这几种植物生长调节剂与TuMV处理,但其响应机制有待进一步研究。

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