我国是世界上肉鸭生产和消费量最大的国家，肉鸭生产已成为我国畜牧业重要组成部分。现代肉鸭生产中，饲料成本大约占生产总成本的60%~70%，因此提高饲料效率、降低生产成本是提高肉鸭生产效率和养殖效益的重要手段。近年来，剩余采食量(residual feed intake，RFI)作为重要经济指标首次引入到肉鸭的育种工作中^[1]。RFI是指动物实际采食量与用于维持生长的预期采食量之差，RFI反映的是由畜禽本身遗传背景决定的代谢差异^[2]，与畜禽的体型大小及生产性能等性状相互独立，因此RFI是衡量畜禽饲料效率的有效指标。国内外学者研究表明，影响RFI的因素主要包括机体组成、营养物质的吸收率、新陈代谢能力、免疫反应、能量代谢与利用率等^[3-5]，其中能量利用率是影响RFI的重要因素^[6]。

单磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是真核生物细胞内一种重要的能量调节器^[7]。AMPK是由α、β、γ 3种亚基组成的高度保守的异源三聚体蛋白激酶，α亚基含有激酶活性调控区，具有α1、α2两种异构形式，主要通过N-端Thr¹⁷²的磷酸化调控AMPK的活性。PRKAA1 (AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-1)基因和PRKAA2基因分别编码AMPK α1和α2亚基，在细胞中充当细胞能量感受器，负责调控细胞内AMP/ATP值，在能量平衡的调节过程中起重要作用^[8]。Apoorv等^[9]在小鼠中研究发现，PRKAA1和PRKAA2基因参与机体的能量代谢过程。田万强^[10]研究报道，PRKAA1基因多态性与肌内脂肪含量显著相关，PRKAA2基因第4外显子多态性与背膘厚、眼肌面积等生长性状显著关联。Zhong等^[11]研究表明，PRKAA1和PRKAA2基因可通过磷酸化调控乙酰辅酶A的活性，从而感受机体的能量变化。Jin等^[12]在黄羽肉鸡中研究发现，AMPK家族基因的多态性与肉鸡的生长、采食量和饲料效率性状显著相关。因此，PRKAA1和PRKAA2是影响饲料效率的重要候选基因。

目前，关于PRKAA1与PRKAA2基因的表达水平与肉鸭饲料效率的相关性报道较少。因此，本试验以具有完整系谱记录的H系肉鸭为研究对象，采用荧光定量PCR法(qPCR)检测PRKAA1和PRKAA2在高、低饲料效率组间肉鸭胸大肌、腿肌和肝脏中的差异表达水平及其与剩余采食量性状的相关性，为研究PRKAA1和PRKAA2基因对饲料效率的调控以及选育高饲料效率肉鸭提供试验依据。

供试材料由黄山强英鸭业有限公司提供，试验鸭具有4个世代完整的系谱记录。挑选1日龄体质量相近的H系肉公鸭混合饲养至21日龄，所有试验鸭饲养于同一栋鸭舍，统一饲养管理。试验期间自由采食和饮水，正常免疫。基础日粮参考我国《肉鸭饲养标准：NY/T 2122—2012》，饲料配方由2阶段组成。2阶段日粮营养水平见表 1。

21日龄时全群称体质量，并挑选健康强健、体质量相近的1 000只肉公鸭转至单笼饲喂。试验鸭自由采食和饮水，参照黄山强英鸭业有限公司饲养管理规程和免疫程序，试验至42日龄。记录所有个体21日龄体质量(BW21)、42日龄体质量(BW42)、日采食量(ADFI)和日增重(ADG)。根据采食量和日增重，计算代谢体质量(MBW^0.75)、饲料转化率(FCR)和剩余采食量(RFI)。RFI=ADFI-(a₀+a₁ × MBW^0.75+a₂ × ADG)，其中a₀为截距，a₁、a₂为回归系数。RFI的计算由SAS 9.4线性拟合函数完成。

根据所有个体RFI的排序并综合考虑FCR等性状，筛选出高、低RFI个体各8只，断颈屠宰后采集胸大肌、腿肌和肝脏，将采集的组织样放入1.5 mL装有RNA Later(Ambion，美国)的冻存管中，4 ℃过夜后迅速置于-80 ℃冰箱中保存备用。

采用OMEGA试剂盒(R6834，美国)提取胸大肌、腿肌和肝脏中的总RNA。利用NanoDrop 2000分光光度计(ThermoFisher Scientific，美国)测定总RNA浓度、A₂₃₀、A₂₆₀与A₂₈₀，用10 g · L^-1琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品完整性。

以总RNA为模板，按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix(TransGen Biotech，北京)合成cDNA第1链。反应体系：总RNA 1.0 μg，Oligo(dT)₁₈1.0 μL，2×ES Reaction Mix 10.0 μL，EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1.0 μL，加ddH₂O至20.0 μL。摇匀后42 ℃孵育15 min；85 ℃5 s，温度降至4 ℃，终止反应，产物置于-20 ℃保存备用。

根据GenBank中PRKAA1、PRKAA2和β-actin的mRNA序列，按照荧光定量PCR(qPCR)跨内含子引物设计原则，采用在线Primer 3.0软件设计引物，采用NCBI Primer-BLAST进行引物特异性检测。引物序列由上海生工生物科技有限公司合成(表 2)。

PCR扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34个循环；72 ℃ 5 min。PCR反应体系：cDNA模板1.5 μL，上、下游引物(10 μmol · L^-1)各1.0 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，加ddH₂O至总体积25.0 μL。PCR反应产物经20 g · L^-1琼脂糖凝胶电泳检测，分析内参基因和目的基因反转录质量；采用DNA纯化回收试剂盒切胶回收目的片段，将其用pGM-T载体连接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取转化子接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，连接过夜后，挑选阳性转化子进行测序。用质粒提取试剂盒提取序列比对正确的阳性克隆质粒pGM-T-PRKAA1和pGM-T-PRKAA2，采用NanoDrop 2000分光光度计测其浓度后作为标准品备用。

采用SYBR Green Ⅰ嵌合荧光检测法制作标准曲线。将每个待测样品反转录产物等体积混合，用cDNA混合样优化qPCR反应的退火温度、引物浓度和模板浓度等条件, 最终确定的qPCR引物浓度为0.25 μmol · L^-1，退火温度为60 ℃，模板10倍稀释。将构建的标准品质粒进行10¹、10²、10³、10⁴、10⁵和10⁶系列稀释，以其作为标准品进行qPCR反应，每个样品3个重复，并设置阴性对照，按照C_T及标准品浓度分别对目的基因和内参基因制作标准曲线。利用ABI PRISM 7500荧光定量仪(Applied Biosystem，美国)进行qPCR反应。qPCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。qPCR反应体系(15.0 μL)：2 × SYBR Green PCR Mater Mix 7.5 μL, cDNA 1.0 μL, 上、下游引物(10 μmol · L^-1)各0.25 μL，RNase-free ddH₂O 6.0 μL。每个试验样品3个重复，每组用RNase-free ddH₂O代替模板作阴性对照。

所有数据经过Excel 2010预处理，根据目的基因和内参基因的C_T值，采用2^-ΔΔC_T法计算目的基因的相对表达量^[13]。采用SAS 9.4软件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)中t检验分析基因差异表达规律。用Bivariate Correlation程序分析目的基因表达量与剩余采食量性状的相关性。试验数据以x±SE表示。

由图 1-A可见:提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，分为清晰的18 S和28 S条带，表明提取的总RNA完整性较好。经NanoDrop 2000检测，所有样品A₂₆₀/A₂₈₀值为1.8~2.0，A₂₆₀/A₂₃₀值大于2.0，表明总RNA纯度较好。以β-actin为内参基因，通过琼脂糖凝胶检测能够看到清晰的139 bp目的条带，表明反转录生成的cDNA完整性好(图 1-B)。

	图 1 总RNA(A)和β-actin的PCR产物(B)的电泳检测 Figure 1 The agarose electrophoresis of total RNA(A)and PCR products of β-actin(B) M. DNA标准品DNA marker；1-5.总RNA Total RNA；6-10. β-actin.
图选项

由图 2可知:目的基因PCR扩增产物条带特异性好，片段大小与预计片段长度157 bp和147 bp相符。PCR鉴定的阳性转化子送公司进行测序，测序结果与GenBank数据库中的PRKAA1和PRKAA2序列进行比对，同源性为100%，表明目的片段标准品构建成功，可以满足后续定量PCR试验的需要。

	图 2 PRKAA1 (A)和PRKAA2 (B)基因PCR产物的电泳图 Figure 2 PCR products of the PRKAA1 (A)and PRKAA2 (B)gene by agarose electrophoresis M. DNA标准品DNA marker；1-5. PRKAA1基因的PCR产物PCR products of PRKAA1；6-10. PRKAA2基因PCR产物PCR products of PRKAA 2.
图选项

根据RFI排序，选择高、低RFI个体各8只，2组个体日采食量、日增重、代谢体质量、饲料转化率和剩余采食量的描述性统计分析见表 3。结果表明，高RFI组肉鸭日采食量、饲料转化率和剩余采食量极显著高于低RFI组(P < 0.01)，日增重显著低于低RFI组(P < 0.05)。

由图 3-A可知：PRKAA1 mRNA在高、低RFI组肉鸭胸大肌、腿肌和肝脏中均有表达，在低RFI组肉鸭胸大肌中表达量极显著高于高RFI组(P < 0.01)，在腿肌中表达量显著高于高RFI组(P < 0.05)。高、低RFI组肝脏中PRKAA1 mRNA表达水平差异不显著。由图 3-B可见：PRKAA2 mRNA在高、低RFI组胸大肌、腿肌和肝脏中均有表达，低RFI组肉鸭胸大肌和腿肌中相对表达量显著高于高RFI组(P < 0.05)，肝脏中两组PRKAA2 mRNA表达量无显著差异。

	图 3 高、低RFI组肉鸭胸大肌、腿肌和肝脏中PRKAA1 (A)与PRKAA2 (B)mRNA的差异表达 Figure 3 Differential expression of PRKAA1 (A)and PRKAA2 (B)mRNA in the pectoralis major muscle, leg muscle and liver in meat-type ducks between HRFI and LRFI group *，* *表示差异显著(P < 0.05)和差异极显著(P < 0.01)。下同。 *, * * indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels. The same as follows.
图选项

由表 4可知：PRKAA1 mRNA在胸大肌中表达量与日采食量、饲料转化率和RFI均呈显著负相关(P < 0.05)，腿肌中表达量与日采食量和RFI显著负相关(P < 0.05)。PRKAA2 mRNA在胸大肌中表达量与日采食量和RFI显著负相关(P < 0.05)，腿肌中表达量与RFI呈显著负相关关系(P < 0.05)。

饲料效率性状是现代肉鸭育种中重要经济性状，剩余采食量(RFI)作为衡量饲料效率的重要指标被引入到肉鸭育种中。RFI是一个负向选择性状，RFI值越小，则动物饲料利用率越高。RFI的遗传力值为0.25~0.45，是一个中等遗传力性状，因而可以通过遗传选育方法对RFI进行改良^[14-15]。近年来，随着测序技术和全基因组关联分析策略的快速发展，国内外学者对影响RFI的基因及其信号通路进行分析，发现调控能量代谢的基因是影响饲料效率的重要候选基因^[16-17]。

AMPK是机体内能量代谢的重要参与者，其活性主要受细胞内能量状态(AMP/ATP)的调控^[7]，在机体能量平衡过程中起重要作用。PRKAA1和PRKAA2属于AMPK家族的重要成员，其含有AMP和ATP结合位点，并可通过磷酸化过程调控AMPK活性，进而影响细胞的能量平衡^[18]。早期研究表明，PRKAA1和PRKAA2基因敲除的小鼠通过抑制胰岛素分泌进而调控机体的能量代谢^[19]，PRKAA2基因单倍型与人的2型糖尿病显著相关^[20]。Kelly等^[21]在肉牛中研究表明，PRKAA1基因与剩余采食量性状有关，是影响饲料效率的重要候选基因。

目前，关于PRKAA1和PRKAA2的研究主要集中在人类疾病、模式生物及大家畜中，在肉鸭中报道较为少见。本试验结果表明，PRKAA1基因在低RFI组(高饲料效率)胸大肌中表达量极显著高于高RFI组，低RFI组腿肌中表达量显著高于高RFI组；PRKAA2基因在低RFI组胸大肌和腿肌中表达量显著高于高RFI组。因PRKAA1和PRKAA2基因含有AMP和ATP结合位点，低RFI组PRKAA1和PRKAA2基因表达量显著上调，可引起AMP/ATP值上升，进一步激活AMPK活性，使机体能够快速感受细胞的能量变化状态，提高能量利用效率，从而提高饲料利用率^[22-23]。Dyck等^[24]研究报道，PRKAA2基因可通过磷酸化转录因子来调控机体的能量变化，从而保持机体能量平衡。Young等^[25]对猪RFI研究表明，猪饲料利用率与能量代谢密切相关，饲料效率高的猪能量利用率也高。相关性分析表明，胸大肌PRKAA1基因表达量与日采食量、FCR和RFI显著负相关，腿肌中表达量与日采食量和RFI显著负相关；胸大肌RPKAA2基因表达量与日采食量和RFI显著负相关，这与Bottje等^[6]研究结果一致。此外，Kelly等^[21]研究也表明，ADP控制的氧化磷酸化基因在低RFI组肉牛中表达量显著高于高RFI组。因此，提高能量利用率，减少能量消耗，能够提高肉鸭饲料效率。