文章信息
- 田时祎, 王珏, 汪晶, 朱伟云
- TIAN Shiyi, WANG Jue, WANG Jing, ZHU Weiyun
- 早期低聚半乳糖干预对哺乳仔猪回肠形态、功能发育相关基因及回肠菌群的影响
- The effect of early intervention with galacto-oligosaccharides on the morphological structure, functional development, and microbial community in ileum of suckling piglets
- 南京农业大学学报, 2018, 41(5): 917-924
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(5): 917-924.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201711031
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文章历史
- 收稿日期: 2017-11-21
与成年猪发育成熟的胃肠道相比,新生仔猪的胃肠道发育不完善[1],导致其消化吸收、屏障功能及免疫能力偏低,从而增加患病的风险,制约了哺乳阶段的猪业生产,并可能对后续生长阶段产生不利影响。目前已有体内外试验证明乳源活性物质可以促进肠道发育,改善肠道功能[2-3]。低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides,GOS)是一种具有天然属性的功能性寡糖,也是乳中重要的活性物质。低聚半乳糖可以调节肠道菌群、改善脂质代谢和改善矿物质的吸收[4-5]。目前,关于GOS的研究多数关注其益生作用,对其与肠道发育和增强肠道屏障的研究报道较少,且大多集中在大肠上,在小肠上的研究较少[3, 6-7]。
回肠是小肠组成的一部分,它既是营养物质消化吸收的重要场所,也是微生物定殖的重要场所。此外,在仔猪新生时期,仔猪胃肠道发育快速且处于发育的关键时期[8]。因此,本试验在仔猪出生后7 d对新生仔猪进行低聚半乳糖干预,旨在探讨哺乳仔猪的回肠上皮在低聚半乳糖对其作用后产生的生理性变化,即其对哺乳仔猪回肠形态结构、功能发育相关基因及回肠菌群的影响,为低聚半乳糖对幼龄动物肠道发育的调控作用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及设计试验选取6窝(每窝10头)杜×长×大“三元”杂交新生仔猪,采用窝内分组,2组平均体质量相同,每窝5头对照组(CON)、5头试验组(GOS)。出生后1~7 d,每天称体质量,根据体质量配制不同浓度的低聚半乳糖溶液,试验组仔猪分2次灌喂共10 mL的低聚半乳糖溶液,使其低聚半乳糖的有效灌喂量为1 g · kg-1 · d-1[5, 9-10],对照组仔猪灌喂相同剂量的生理盐水。
1.2 试验材料低聚半乳糖来源于广东量子高科生物股份有限公司,由质量分数分别为90%、8.5%、1.5%的低聚半乳糖、乳糖和葡萄糖组成。
1.3 饲养管理试验于江苏省泰州市三寸草猪场完成。试验期间采取自由采食、饮水,其他饲养管理如断牙、断尾、去势、常规补铁与免疫等均按照猪场相关规程操作。
1.4 测定指标在仔猪8日龄和21日龄(断奶)时,从6窝仔猪中随机屠宰对照组和试验组各1头仔猪。采集回肠中段组织用于观察肠道形态变化,回肠中段黏膜用于功能发育的相关指标分析,回肠中段食糜用于菌群定量分析。
1.4.1 回肠黏膜形态的观察截取回肠中段2 cm组织,用生理盐水冲洗后迅速放入预先配制好的4%多聚甲醛溶液中固定,按常规方法制作石蜡切片染色,利用图像分析系统对绒毛高度和隐窝深度进行测量,每张切片中至少选取6个视野进行统计。
1.4.2 回肠黏膜隐窝中PCNA阳性细胞数量的测定利用鼠抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)对切片进行免疫组化染色。每组内每张切片随机挑选至少6个200倍视野进行拍照,在光学显微镜下计数每个隐窝中的PCNA阳性细胞数,求其平均值,作为表达强度的指标。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色细胞核作为判断阳性细胞的统一标准。
1.4.3 回肠黏膜二糖酶和二胺氧化酶活性的测定取回肠黏膜制备体积分数为10%的组织匀浆液,于4 ℃、4 000 r · min-1条件下离心15 min,分离上清液,用蛋白定量法(BCA法)对组织匀浆上清液进行总蛋白定量后,按照试剂盒(南京建成生物工程有限公司)说明测定回肠黏膜组织中乳糖酶、蔗糖酶、麦芽糖酶和二胺氧化酶(DAO)的活性。
1.4.4 回肠黏膜基因的表达分析利用试剂盒(Invitrogen)提取回肠黏膜中总RNA,然后用反转录试剂盒(TaKaRa)将1 μg RNA转录为cDNA。利用StepOne-Plus定量PCR仪(Applied Biosystems,USA)及StepOne软件(version 2.2.2,Applied Biosystems)进行实时荧光定量PCR(qPCR)。PCR反应体系(20 μL):10 μL SYBR Premix,0.4 μL上游引物,0.4 μL下游引物,0.4 μL ROX Reference Dye(50×),6.8 μL灭菌水, 2 μL cDNA。PCR扩增程序:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,共40个循环,然后熔解曲线程序为95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。测定回肠黏膜葡萄糖转运体相关基因:钠依赖性葡萄糖转运蛋白1(SGLT1)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2);肠道发育相关基因:胰高血糖素样肽2(GLP-2)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、血管内皮生长因子A(VEFGA);肠道屏障相关基因:ZO-1、occludin、黏蛋白2(Muc2)、β防御素(β-defensin)以及内参基因β-actin(表 1)。参照Livak等[11]的方法,用2-ΔΔCT法计算每个基因相对于β-actin的相对表达量。
基因 Gene |
引物对序列(5′→3′) Primer pairs sequence |
产物大小/bp Product length |
序列号 Accession No. |
SGLT1 | CCACTTTCCCTATAAAACCTCAC/CTCCATCAAACTTCCATCCTCAG | 151 | NM_001164021.1 |
GLUT2 | CCTGCTTGGTCTATCTGCTGTG/TTGATGCTTCTTCCCTTTCTTT | 194 | NM_001097417.1 |
IGF-1 | CCTGCGCAATGGAATAAAGTC/GCAAAGTCTGGAAATGAATTGGT | 120 | XM_021091140.1 |
IGF-1R | GGGATGACGAGAGACATCTATGAG/GAAGGACCAGACTCAGAGTGC | 131 | XM_021082920.1 |
GLP-2 | ACTCACAGGGCACGTTTACCA/AGGTCCCTTCAGCATGTCTCT | 150 | XM_005671883.3 |
VEGFA | GACGTCTACCAGCGCAGCTACT/ACACAGGACGGCTTGAAGATGT | 101 | NM_214084.1 |
ZO-1 | GAGGATGGTCACACCGTGGT/GGAGGATGCTGTTGTCTCGG | 169 | XM_021098896.1 |
occludin | ATGCTTTCTCAGCCAGCGTA/AAGGTTCCATAGCCTCGGTC | 176 | NM_001163647.2 |
Muc2 | CTGCTCCGGGTCCTGTGGGA/CCCGCTGGCTGGTGCGATAC | 101 | XM_021082584.1 |
β-defensin | GTGCAGAAGGGGCAATGGTCG/GTTGCAGGTCTCATCGAGTAAGCA | 81 | NM_214443.1 |
β-actin | ATGCTTCTAGACGGACTGCG/GTTTCAGGAGGCTGGCATGA | 109 | XM_003357928.4 |
利用蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂提取回肠黏膜中总蛋白,然后用BCA法检测蛋白浓度。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白样品进行分离。待蛋白样品分离完毕,在50 g · L-1脱脂乳中室温封闭1 h。加入抗ZO-1抗体(1 : 500)、抗Occludin抗体(1 : 250)、抗β-actin抗体(1 : 1 000), 4 ℃孵育过夜,脱色摇床上用TBST洗膜3次后,加入二抗(1 : 4 000)室温孵育1 h,化学发光试剂ECL放射自显影。利用Image J软件处理分析蛋白条带灰度值。
1.4.6 回肠食糜中菌群荧光定量PCR参照罗振等[12]的方法,对回肠食糜中的总菌、乳酸杆菌、大肠杆菌进行荧光定量。所用引物:总菌[13](Total bacteria,5′-GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA-3′/5′-ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC-3′), 乳酸杆菌[14](Lactobacillus,AGCAGTAGGGAATCTTCCA/ATTCCACCGCTACACATG), 大肠杆菌[15](Escherichia coli,CATGCCGCGTGTATGAAGAA/CGGGTAACGTCAATGAGCAAA)。PCR反应体系(20 μL):10 μL SYBR Premix,0.4 μL上游引物,0.4 μL下游引物,0.4 μL ROX Reference Dye(50×),6.8 μL灭菌水, 2 μL DNA。PCR扩增程序:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,共40个循环,然后熔解曲线程序为95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。利用各类菌群代表菌的16S rRNA基因克隆作为模版制作相应定量标准曲线,每个样品重复3次。
1.5 数据统计分析利用Excel 2007对数据进行处理,采用SPSS 20.0统计软件进行方差分析和差异显著性t测验。
2 结果与分析 2.1 早期低聚半乳糖干预对哺乳仔猪回肠黏膜形态的影响由图 1(A)和表 2可知:在8日龄时,与对照组相比,试验组仔猪回肠绒毛高度增加(P=0.075),但隐窝深度以及绒毛高度/隐窝深度值2组间无显著差异(P>0.05);21日龄时,2组间绒毛高度无显著差异,但试验组仔猪的隐窝深度低于对照组(P=0.066),绒毛高度/隐窝深度值显著高于对照组(P < 0.05)。说明低聚半乳糖在一定程度上可以促进仔猪回肠发育。
日龄Day old | 项目Items | 对照组CON | 试验组GOS |
绒毛高度/μm Villus height(V) | 756.04±72.99 | 960.38±70.01 | |
8 | 隐窝深度/μm Crypt depth(C) | 78.26±4.55 | 81.53±8.10 |
绒毛高度/隐窝深度V/C | 9.66±0.83 | 11.78±1.67 | |
绒毛高度/μm Villus height(V) | 209.63±20.03 | 237.46±25.48 | |
21 | 隐窝深度/μm Crypt depth(C) | 97.95±9.24 | 79.78±2.23 |
绒毛高度/隐窝深度V/C | 2.14±0.10 | 2.93±0.28* |
由表 3可知:8日龄时,早期低聚半乳糖干预有提高哺乳仔猪回肠麦芽糖酶(P=0.054)和蔗糖酶(P=0.071)活性,但对乳糖酶无显著影响;21日龄时,早期低聚半乳糖干预显著提高哺乳仔猪回肠蔗糖酶活性,但对乳糖酶、麦芽糖酶活性无显著影响。在8和21日龄2组间二胺氧化酶活性均无显著差异, 表明低聚半乳糖可以促进二糖酶的分泌。
U · mg-1 | |||
日龄Day old | 项目Items | 对照组CON | 试验组GOS |
8 | 乳糖酶活性Lactase activity | 48.08±4.22 | 51.35±6.17 |
麦芽糖酶活性Maltase activity | 21.95±4.26 | 40.01±6.98 | |
蔗糖酶活性Sucrase activity | 2.43±0.41 | 3.72±0.42 | |
二胺氧化酶活性DAO activity | 2.07±0.04 | 2.16±0.05 | |
21 | 乳糖酶活性Lactase activity | 19.58±3.16 | 27.67±4.92 |
麦芽糖酶活性Maltase activity | 86.06±14.74 | 111.93±10.97 | |
蔗糖酶活性Sucrase activity | 11.44±1.54 | 18.43±2.39* | |
二胺氧化酶活性DAO activity | 2.19±0.06 | 2.24±0.04 |
比较肠道发育相关基因的结果(表 4)表明,在8日龄时,低聚半乳糖干预显著提高IGF-1R、VEGFA的相对表达量,有增加GLP-2相对表达量的趋势(P=0.094),而对于IGF-1无显著影响;在21日龄时,低聚半乳糖干预显著增加发育相关基因IGF-1的相对表达量,有增加GLP-2相对表达量的趋势(P=0.068),但对IGF-1R、VEGFA的表达量无显著影响。
基因Gene | 对照组CON | 试验组GOS |
8日龄8 day old | ||
GLP-2 | 1.00±0.02 | 1.14±0.07 |
IGF-1 | 1.00±0.10 | 1.01±0.06 |
IGF-1R | 1.00±0.11 | 1.35±0.07* |
VEGFA | 1.00±0.05 | 1.38±0.15* |
SGLT1 | 1.00±0.12 | 1.04±0.10 |
GLUT2 | 1.00±0.07 | 1.46±0.19* |
ZO-1 | 1.00±0.06 | 1.04±0.14 |
occludin | 1.00±0.05 | 1.10±0.13 |
Muc2 | 1.00±0.08 | 1.39±0.13* |
β-defensin | 1.00±0.07 | 1.49±0.11* |
21日龄21 day old | ||
GLP-2 | 1.00±0.12 | 1.48±0.25 |
IGF-1 | 1.00±0.11 | 1.36±0.09* |
IGF-1R | 1.00±0.08 | 0.96±0.08 |
VEGFA | 1.00±0.15 | 0.95±0.10 |
SGLT1 | 1.00±0.11 | 1.22±0.11 |
GLUT2 | 1.00±0.05 | 1.12±0.09 |
ZO-1 | 1.00±0.10 | 1.16±0.12 |
occludin | 1.00±0.10 | 1.26±0.13 |
Muc2 | 1.00±0.10 | 1.18±0.09 |
β-defensin | 1.00±0.16 | 1.63±0.15* |
对于葡萄糖转运体相关基因(SGLT1、GLUT2)的测定结果显示:与对照组相比,试验组仔猪在8日龄时, GLUT2的相对表达量显著增加,但对SGLT 1的表达量无显著影响;在21日龄时,2组间的SGLT1、GLUT2的相对表达量均无显著差异。此外,比较2组组仔猪回肠黏膜屏障相关基因相对表达量的结果发现,在8日龄时试验组仔猪Muc2、β-defensin的相对表达量显著增加,但ZO-1、occludin基因的相对表达量无显著变化;在21日龄时,与对照组相比,试验组仔猪β-defensin的相对表达量显著增加,occludin基因的相对表达量有增加趋势(P=0.087)。表明低聚半乳糖可以促进肠道发育、葡糖糖转运体和屏障相关基因的表达。
2.4 早期低聚半乳糖干预对哺乳仔猪回肠黏膜PCNA阳性细胞和紧密连接蛋白表达的影响由图 1-B和图 2-A可知:在8日龄,2组仔猪回肠隐窝中PCNA阳性细胞无显著差异;与对照组相比,21日龄试验组仔猪回肠隐窝中PCNA阳性细胞显著下降。表明低聚半乳糖在一定程度上降低隐窝中PCNA阳性细胞的表达。
由图 2-B可知:早期低聚半乳糖干预有提高8日龄试验组仔猪回肠黏膜Occludin蛋白相对表达量的趋势(P=0.092),并显著提高21日龄试验组仔猪回肠黏膜Occludin蛋白的相对表达量。但对8日龄和21日龄仔猪回肠黏膜ZO-1蛋白的相对表达量(图 2-C)均无显著影响。表明低聚半乳糖可以提高紧密连接的蛋白表达。
2.5 早期低聚半乳糖干预对哺乳仔猪回肠食糜菌群数量的影响由表 5可知:在与对照组相比,8日龄试验组仔猪回肠食糜中总菌、乳酸杆菌的数量显著增加,大肠杆菌的数量无显著变化;与对照组相比,21日龄试验组仔猪回肠食糜中乳酸杆菌的数量显著增加,总菌的数量有增加的趋势(P=0.058),大肠杆菌的数量无显著变化。表明低聚半乳糖可以增加回肠食糜有益菌的丰度。
lg[c/(copies · g-1)] | ||
项目Items | 对照组CON | 试验组GOS |
8日龄8 day old | ||
总菌Total bacteria | 8.96±0.16 | 10.19±0.47* |
乳酸杆菌Lactobacillus | 6.83±0.30 | 8.87±0.34* |
大肠杆菌Escherichia coli | 6.73±0.46 | 6.75±0.38 |
21日龄21 day old | ||
总菌Total bacteria | 9.25±0.16 | 10.47±0.26* |
乳酸杆菌Lactobacillus | 7.31±0.28 | 8.48±0.26* |
大肠杆菌Escherichia coli | 6.85±0.30 | 6.89±0.33 |
肠道不仅是机体消化吸收营养物质的主要场所,还是机体重要的免疫器官和内分泌器官。研究表明,小肠的黏膜形态是衡量其消化吸收能力的重要指标,小肠绒毛高度增加能小肠的吸收能力增加[16]。小肠隐窝加深,反映了细胞生成加快,肠绒毛上皮细胞的分化程度相应降低,消化吸收功能减弱[17]。小肠绒毛隐窝比则综合反映其消化吸收功能,绒毛隐窝比增大,消化吸收功能增强[18]。相关研究表明,低聚半乳糖可以增加新生仔猪回肠的绒毛高度、绒毛表面积,此结果与本文检测到的结果一致[7]。在本试验中,8日龄试验组仔猪回肠的绒毛高度有增加趋势,而21日龄试验组仔猪回肠的隐窝深度有降低趋势,绒毛隐窝比显著增加。这可能是由于肠道细胞增殖能力降低,分化能力相应增加,从而有助于回肠黏膜的发育。PCNA是反映细胞增殖能力的重要标志物,因此,本试验通过免疫组化对回肠黏膜中的PCNA水平进行了检测,结果表明21日龄试验组仔猪回肠隐窝中的PCNA阳性细胞显著降低,这与试验组仔猪隐窝深度下降相吻合。此外,GLP-2也是一种重要的肠道激素,它可以特异性刺激肠黏膜的生长,提高肠道绒毛高度[19]。在本试验中,早期低聚半乳糖干预提高了回肠黏膜中GLP-2基因的表达量,这可能是回肠形态结构发育提高的原因。以上结果表明,低聚半乳糖干预改善了哺乳仔猪回肠的形态结构并促进回肠黏膜发育。
3.2 早期低聚半乳糖干预对哺乳仔猪回肠二糖酶活性及单糖转运体的影响研究表明,绒毛高度与肠道黏膜二糖酶活性之间存在正相关关系[20]。在本试验中,与回肠形态的变化一致,8日龄试验组仔猪的蔗糖酶、麦芽糖酶活性在低聚半乳糖干预后有提高趋势。此外,早期低聚半乳糖干预显著提高21日龄试验组仔猪蔗糖酶活性。相关文献报道,小肠二糖酶的分泌和释放过程其实是小肠上皮细胞的更新过程[21],其中乳糖酶是新生仔猪主要的二糖酶。在仔猪出生时,乳糖酶活性较高,但随着日龄的增长,乳糖酶的活性逐渐降低。而蔗糖酶和麦芽糖酶在出生时活性较低,随着日龄的增长,其活性逐渐升高,最终达到稳定[21]。本试验的结果一方面暗示早期低聚半乳糖干预可能促进回肠黏膜的发育,将二糖酶呈现高活性的时间提前,另一面表明低聚半乳糖干预可能提高回肠对碳水化合物的利用能力。因此,我们进一步对回肠黏膜上葡萄糖转运体基因的相对表达量进行了检测。结果显示,低聚半乳糖干预显著提高了8日龄试验组仔猪GLUT2基因的相对表达量,但对8日龄仔猪SGLT1和21日龄仔猪SGLT1、GLUT2基因的相对表达量无显著影响。这表明低聚半乳糖干预可以提高回肠对碳水化合物的利用能力,有利于仔猪充分利用乳中的碳水化合物,但随着低聚半乳糖干预的消失,其效果也逐渐消失。
3.3 早期低聚半乳糖干预对回肠黏膜屏障的影响完整的肠道黏膜结构可以有效防止肠道内细菌和内毒素等有害物质通过肠黏膜进入体内,正常的肠道黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障共同组成。其中机械屏障的基础结构是相邻肠上皮细胞之间的紧密连接[22]。已有研究报道ZO-1和Occludin是与紧密连接形成相关的2种主要蛋白。ZO-1对于维持和调节上皮屏障有重要的作用,并参与调节细胞物质转运;Occludin是紧密连接的主要结构蛋白,其主要功能是维持肠道屏障的完整性并降低细胞膜的通透性,使有害物质无法通过细胞膜。因此ZO-1和Occludin常被用来作为观察肠道屏障功能和通透功能的指标。Alizadeh等[6]在新生仔猪的试验中发现,低聚半乳糖可以上调ZO-1和occludin基因的水平,但却没有影响到ZO-1和Occludin蛋白的水平。在本试验中,早期低聚半乳糖干预有上调21日龄仔猪occludin基因的相对表达量的趋势,显著提高21日龄仔猪Occludin蛋白的表达量。此外,肠道黏膜中的DAO水平可以间接反映肠道屏障的渗透性[23],在本试验中,试验组仔猪回肠黏膜中DAO水平高于对照组仔猪,但差异不显著,这表明试验组仔猪DAO渗透到血液中的含量相对对照组而言可能较少,即低聚半乳糖干预可能在一定程度上降低肠道的渗透性。以上结果表明早期低聚半乳糖干预可以在一定程度上提高肠道黏膜的机械屏障功能。
在体外试验中发现,低聚半乳糖可以通过维持紧密连接和调节杯状细胞分泌特殊化学物质来保护肠道屏障[24],其中以肠型杯状细胞分泌黏蛋白形成的黏胶层最为关键,其与消化液及肠腔内正常寄生菌产生的抑菌物质构成肠道的化学屏障。黏蛋白2是由肠型杯状细胞合成和分泌的主要黏蛋白。对沙门菌感染成年猪的研究中,发现低聚半乳糖和海藻衍生多糖共同作用可以显著增加回肠组织的Muc2蛋白含量[25]。β-defensin是分布在胃肠道上的一种抑菌物质,体内试验结果表明,低聚半乳糖可以显著增加哺乳期仔猪结肠上皮中β-defensin基因的相对表达量[6]。有研究报道,低聚半乳糖可以通过调节杯状细胞增高Muc2等化学物质的分泌来提高肠道屏障功能[24]。在本试验中,早期低聚半乳糖干预提高哺乳期仔猪回肠黏膜中Muc2和β-defensin基因的相对表达量,可能是由于低聚半乳糖干预后,细胞的分泌能力增强,促使杯状细胞和潘氏细胞分泌更多的Muc2和β-defensin蛋白。以上结果表明,早期低聚半乳糖干预可以提高肠道黏膜的化学屏障。
通常情况下,肠道常驻菌与宿主的微空间结构之间易形成一个相互依赖又相互作用的微生态系统,其在肠道内构成一个对抗病原体的重要保护屏障,对外来菌定殖有抵抗作用。对小鼠的研究表明,高纯度低聚半乳糖可以显著增加乳酸杆菌的丰度[4]。在本试验中,早期低聚半乳糖干预显著增加乳酸杆菌的数量,这与先前的研究结果一致。此外,在本试验中,早期低聚半乳糖干预后8日龄仔猪总菌数量显著增加,21日龄仔猪的总菌数量也有增加的趋势,但对大肠杆菌的数量无显著影响。以上结果表明,早期低聚半乳糖干预提高了肠道黏膜的生物屏障。
综上所述,早期低聚半乳糖干预能改善回肠形态结构,提高回肠黏膜二糖酶活性,这可能是由于早期低聚半乳糖干预刺激回肠上皮细胞产生GLP-2蛋白,从而促进回肠发育;此外,早期低聚半乳糖干预在一定程度上提高回肠的屏障功能,包括机械屏障、化学屏障和生物屏障。这有利于机体对肠道消化吸收及屏障功能的维持,从而有助于仔猪适应断奶后日粮的转变。
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