南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (5): 825-831   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201711011
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申浩冉, 肖栋, 侯喜林
SHEN Haoran, XIAO Dong, HOU Xilin
不结球白菜调控开花时间候选基因BcVIL1的克隆与表达分析
Cloning and expression analysis of flowering time candidate gene BcVIL1 in non-heading Chinese cabbage
南京农业大学学报, 2018, 41(5): 825-831
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(5): 825-831.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201711011

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收稿日期: 2017-11-06
不结球白菜调控开花时间候选基因BcVIL1的克隆与表达分析
申浩冉 , 肖栋 , 侯喜林     
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在克隆和研究不结球白菜BcVIL1基因在春化过程中的表达情况,初步了解不结球白菜BcVIL1基因的结构及功能。[方法]以普通白菜PC-175和菜心‘CX-49’为试验材料,利用RT-PCR技术克隆BcVIL1基因全长,并采用生物信息学方法进行氨基酸序列比对和进化分析。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析2种材料春化过程中BcVIL1的表达情况。构建亚细胞定位载体pEZS-NL-BcVIL1,利用亚细胞定位技术,分析BcVIL1基因在真核细胞中表达的位置。[结果]2种材料中BcVIL1基因序列基本一致,开放阅读框为1 020 bp,编码339个氨基酸。进化分析表明:BcVIL1基因与大白菜进化关系最近,同源性最高(99%)。在PC-175中,春化处理7 d就可以诱导BcVIL1基因的表达,且在整个春化过程及春化之后都有较高的水平表达,而在‘CX-49’中,BcVIL1基因在春化过程中的表达与未春化处理相比无显著差异。亚细胞定位结果表明:BcVIL1主要在细胞核与细胞膜上表达。[结论]BcVIL1基因在春化过程中其表达具有品种特异性,且在不结球白菜中该基因主要在细胞核与细胞膜上发挥作用。
关键词不结球白菜   BcVIL1   克隆   基因表达   亚细胞定位   
Cloning and expression analysis of flowering time candidate gene BcVIL1 in non-heading Chinese cabbage
SHEN Haoran, XIAO Dong, HOU Xilin    
State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in Eastern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] BcVIL1 gene had been cloned and some experiments had been producted to better understand the characteristics and structure of BcVIL1. [Methods] To explore the function of the VIL1 gene in non-heading Chinese cabbage, PC-175 and 'CX-49' were chosen as materials which belong to typical different genotypes. The BcVIL1 gene in PC-175 and 'CX-49' was cloned by RT-PCR, and bioinformatics analysis was conducted. The expression patterns of BcVIL1 in PC-175 and 'CX-49' during the course of vernalization were analyzed by RT-qPCR. The vector pEZS-NL-BcVIL1 was constructed and the spatial expression of BcVIL1 was analyzed by sub-cellular localization. [Results] The sequences of BcVIL1 were consistent in two materials of non-heading Chinese cabbage, and BcVIL1 containing a 1 020 bp open reading frame encoded 339 amino acid residues. The bioinformatics analysis showed that the homology between Brassica campestris ssp. chinensis Makino and B. rapa ssp. pekinensis was very high at 99%. The BcVIL1 gene in PC-175 could be induced by 7 days of vernalizaing and the expression of BcVIL1 gene was at high level during and after the course of vernalization. While the expression of BcVIL1 gene in 'CX-49' had no obvious differentce compared with non-vernalization condition. The BcVIL1 gene was verified to be located in cell nucleus and membrane by sub-cellular localization. [Conclusions] The vernalization in PC-175 can induce the expression of BcVIL1, and the expression of BcVIL1 also was at high level after vernalization. However the expression of BcVIL1 gene in 'CX-49' didn't have this profile. The expression of BcVIL1 gene was different in two genotypes. BcVIL1 gene in non-heading Chinese cabbage mainly had a function at cell nucleus and membrane.
Keywords: Brassica campestris ssp. chinensis Makino    BcVIL1    clone    gene expression    subcellular location   

不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis Makino)是十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)重要的蔬菜作物[1],在我国栽培十分广泛,在农业生产中占据着重要地位[2]。不结球白菜包括5个变种:普通白菜类、塌菜类、菜薹类、分蘖菜类、薹菜类,遗传资源十分丰富[1]。不同品种在抽薹开花性状上存在广泛的遗传变异,开花早晚直接影响不结球白菜的产量与品质[3]。因此,不结球白菜抽薹开花时间机制及相关开花时间候选基因的深入研究,对不结球白菜产量的提高及种质创新都具有重要的指导意义。

开花是指植物从营养生长向生殖生长的转变过程[4-5]。植物开花的分子机制非常复杂,包括多种开花诱导途径[6-7]。其中,春化途径是诱导植物开花的一条重要途径[8]。在高等植物中,低温诱导或促进植物成花的效应被称为春化作用,它是一些二年生植物和一年生冬性植物成花所必需的[9-11]。在模式植物拟南芥中,研究人员对春化作用的分子机制已经进行了较为详尽的研究,并且取得了很大的进展[12-15]。这对同是芸薹属十字花科的不结球白菜开花时间机制的研究具有重要参考价值。

在拟南芥中,VIL1(VIN3-LIKE1)属于春化途径重要基因VIN3(VERNALIZATION INSENSITIVE 3)家族基因,该家族成员均可编码1个PHD锌指结构蛋白[16]。PHD结构域是一类由约60个氨基酸残基组成的具有C4HC3(cys4-His-cys3)保守序列的结构[17],该类蛋白能够改变染色质的空间结构,从而使该基因沉默[18]FLC(FLOWERING LOCUS C)是春化过程中的关键基因,编码1个MADS-box[19]FLOWERING LOCUS C通过抑制下游基因SOC1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS)和FT(FLOWERING LOCUS T)的表达,延迟植物开花,是开花过程中的主要抑制因子[20]。Sung等[21]发现VIN3VIN3-LIKE1在春化过程中可以与PRC2(polycomb repression complex 2)复合体结合,抑制FLC及其同源基因FLM/MAF1的表达。而经过Kim等[16]进一步研究发现,拟南芥中vil1突变体春化期间FLCFLM的表达仍会受到抑制,而春化之后转移到正常生长条件下这种抑制作用却不能保持,说明VIL1基因可能在春化之后继续维持FLCFLM的抑制作用。然而,关于不结球白菜中VIL1基因在春化过程中及春化后所发挥的作用目前还未见报道。

本研究针对春化途径中的上游基因VIL1 进行研究,从不结球白菜PC-175和‘CX-49’中克隆了BcVIL1 基因序列,利用生物信息学方法对BcVIL1 基因进行序列分析,通过实时荧光定量PCR分析了春化过程中及春化后的表达情况,并利用亚细胞定位技术鉴定了BcVIL1 基因在细胞中的表达位置,为进一步研究不结球白菜春化途径的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

PC-175为两年生普通白菜品系,开花时间较迟,平均开花时间为137 d。‘CX-49’为一年生菜心品种,是一个极早开花的类型,平均开花时间为51 d。2种材料均来自南京农业大学园艺学院白菜系统生物学实验室。

1.2 试验处理

种子于培养皿中催芽2 d后播种于32孔穴盘中,放置于人工气候室中:光照16 h/黑暗8 h,温度22 ℃/18 ℃,相对湿度70%,光照强度72 μmol · m-2 · s-1。待幼苗长到5~6片真叶时,将2种材料的幼苗放入移动人工气候室中进行4 ℃低温春化处理(除温度外其他培养条件与人工气候室中一致),另一部分继续在人工气候室中正常生长作为对照。春化处理28 d后转移至春化之前的人工气候室中生长,直至开花。于春化处理0(未春化)、7、14、21、28 d及春化处理后转移到正常生长环境中7 d时取样。每次取3株幼苗的混合叶片0.2 g,3次重复。取好的叶片迅速放入液氮中,冷冻后转移至-70 ℃冰箱中备用。

1.3 BcVIL1 基因的克隆

参照RNA Simple Total RNA Kit说明书提取总RNA。使用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA,作为基因扩增所需的模板。根据模式植物拟南芥中有关VIL1 基因的报道[4, 16],参考大白菜基因组A07号染色体上的BrVIL1 基因序列(序列号:Bra015040),利用CE-desgin V1.03设计特异性扩增引物(表 1)。PCR扩增体系总体积为40 μL:正、反引物各2 μL,模板cDNA 1 μL,高保真酶MIX 20 μL,ddH2O 14 μL。反应程序:95 ℃ 5 min;98 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃保存。扩增片段用12 g · L-1琼脂糖凝胶电泳检测,目的片段胶回收后连接到pEAZY-Blunt载体上,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,选择阳性单克隆送擎科生物公司测序。

表 1 所用引物序列 Table 1 Primers used in this study
引物名称Primer names 引物序列(5′→3′)Primer sequence 用途Usage
BcVTL1-F/R ATGGATACGAAAAGGAAGATCTCG/TTAATGTCTTTCTCCTATACCATCCAC BcVIL1基因克隆Cloning of BcVIL1 gene
Cell-F/R TCGAGCTCAAGCTTCGAATTCATGGATACGAAAAGGAAGATCTCG/AGCCGGATCCCGGGCCCGCGGAATGTCTTTCTCCTATACCATCCAC 亚细胞定位Subcellular localization
RT-qPCR-F/R CGCAAGAGGCAGCAACAAGAAG/CTGGCATCGTAAGGTCACTGAG BcVIL1实时荧光定量PCR RT-qPCR of BcVIL1
GAPDH-F/R AGAGCCGCTTCCTTCAACATCATT/TGGGCACACGGAAGGACATACC 实时荧光定量PCR内参Reference gene in RT-qPCR
注:下划线为EcoRⅠ和Sac Ⅱ酶切位点序列;酶切位点之前碱基为15 bp载体序列。
Note:Underlined site are the sequence of EcoRⅠand Sac Ⅱ. The front of the restriction sites are 15 bp of pEZS-NL vector.

pEAZY-Blunt载体及大肠杆菌感受态细胞DH5α购自全式金生物公司,高保真酶Mix购自TaKaRa公司,琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生物公司。

1.4 BcVIL1 基因生物信息学分析

用DNAMAN 6.0软件对BcVIL1 基因的氨基酸序列进行序列比对。使用MEGA 5.0软件进行分析,采用邻近相连法(Neighbor-joining method)构建系统进化树。BootStrap设定为500次。

1.5 实时荧光定量分析

利用RT-qPCR技术检测BcVIL1 基因在不同春化时间的表达水平。参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa)说明书进行反转录合成cDNA。PCR反应程序:95 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 10 s,40个循环;设置60 ℃到95 ℃的熔解曲线。反应体系为:正、反向引物各0.4 μL,SYBR GREEN PCR MasterMix 10 μL,模板100 ng。3次重复。采用2-ΔΔCT法分析试验数据,选用GAPDH基因作为内参基因[22]。采用单因素方差分析进行显著性检验。

1.6 BcVIL1 基因的亚细胞定位分析

利用亚细胞定位在线预测软件WoLF PSORT(http://www.genscript.com/psort.html)对BcVIL1 基因在细胞中表达的位置进行预测,根据PC-175中克隆出的BcVIL1 基因序列和亚细胞定位载体pEZS-NL序列,设计含有EcoRⅠ和SacⅡ酶切位点的特异引物(表 1)。用One Step Cloning Kit构建载体pEZS-NL-BcVIL1 ,具体操作方法参照说明书。用基因枪法[23]转化洋葱表皮细胞并略有改进:取洋葱表皮,将其靠叶肉面向上铺于MS固体培养基上培养4 h待用,取8 μL金粉悬浮液于1.5 mL离心管中,依次加入5 μg质粒DNA、50 μL 2.5 mol · L-1 CaCl2、20 μL 0.1 mol · L-1亚精胺,冰浴20 min,期间间歇振荡混匀。10 000 r · min-1离心5 s,弃上清液,再加入无水乙醇漂洗2次,弃上清液,最后加入20 μL无水乙醇,悬浮待用。用基因枪轰击洋葱表皮,轰击后暗培养16 h,制片,用激光共聚焦显微镜进行观察并记录拍照。

2 结果与分析 2.1 不结球白菜BcVIL1 基因的克隆与序列比对

以不结球白菜2种材料PC-175和‘CX-49’的cDNA为模板,参考大白菜BrVIL1 基因序列(Bra015040),设计特异引物扩增BcVIL1 基因片段,扩增得到的片段大小与目的序列一致,约1 000 bp(图 1)。

图 1 不结球白菜BcVIL1 基因的扩增 Figure 1 The amplification of BcVIL1 gene in non-heading Chinese cabbage M. DL2000 marker; 1. PC-175;2. CX-49.

通过测序及分析得到:BcVIL1 开放阅读框为1 020 bp,编码339个氨基酸。PC-175和‘CX-49’中BcVIL1 基因序列一致,但与参考序列(Bra015040)相比在第641位、第800位、第1 015位上存在G/C、T/A、G/C的碱基差异(图 2-A)。氨基酸序列在第214位、第267位、第339位上存在丝氨酸/苏氨酸(S/T)、缬氨酸/谷氨酸(V/E)、天冬氨酸/组氨酸(D/H)的差异(图 2-B)。BcVIL1 基因编码的蛋白质相对分子质量为38.6×103,其理论等电点为7.6。利用蛋白结构在线预测软件Pfam(http://pfam.xfam.org/)分析发现,BcVIL1蛋白存在1个PHD锌指结构域,位于氨基酸第28~148位。

图 2 不结球白菜BcVIL1 基因核苷酸(A)及氨基酸(B)序列比对 Figure 2 Nucleotide comparison(A)and amino acid comparison(B)of BcVIL1 gene in non-heading Chinese cabbage 方框内为PHD锌指结构域。 The PHD finger protein is indicated by a red box.
2.2 不结球白菜BcVIL1 基因系统进化分析

从NCBI中下载同源性较高的其他物种的VIL1蛋白序列,用DNAMAN 6.0软件对不同物种的VIL1蛋白进行序列比对,结果发现BcVIL1 与大白菜的亲缘关系最近,为99%,与野甘蓝(原变种)、甘蓝型油菜、萝卜、拟南芥、亚麻荠、大豆和蔓花生同源性分别为98%、97%、95%、91%、88%、67%和63%,表明VIL1 序列在进化上具有较高的保守性(图 3图 4)。

图 3 不结球白菜与其他物种BcVIL1蛋白的同源序列比对 Figure 3 Homology alignment of BcVIL1 protein between non-heading Chinese cabbage and other species
图 4 不结球白菜与其他植物BcVIL1蛋白的氨基酸序列进化分析 Figure 4 Phylogenetic analysis of amino acid sequences encoded by BcVIL1 protein in non-heading Chinese cabbage and other plants
2.3 BcVIL1 基因在春化过程中的表达分析

为研究BcVIL1 基因在春化过程中的表达情况,对PC-175和‘CX-49’进行了春化处理,春化处理后转移到正常生长环境中,直至开花(图 5)。利用RT-qPCR技术,测定了BcVIL1 基因在PC-175和‘CX-49’中的表达情况。在PC-175中,与未春化(0 d)相比,春化7 d时BcVIL1 的表达量明显升高,是未春化的1.5倍,之后BcVIL1 均保持较高的表达水平(图 6);转移到正常生长环境中7 d后(28VT7)BcVIL1 的表达量是未春化处理的1.3倍,表明在普通白菜PC-175中BcVIL1 基因可以被春化诱导,并且在春化结束之后也保持较高的表达水平。而在‘CX-49’中,与未春化相比,其他处理条件下BcVIL1 基因的表达量无显著差异,表明BcVIL1 的表达可能具有品种特异性,在不同品种中表达量不同,可能会影响开花的时间。

图 5 不结球白菜PC-175和‘CX-49’春化后开花情况 Figure 5 The flowering situation of PC-175 and'CX-49'after vernalization
图 6 PC-175和‘CX-49’春化过程中BcVIL1 基因的相对表达量 Figure 6 The relative expression level of BcVIL1 gene during the course of vernalization in PC-175 and'CX-49' 28VT7:春化处理后转移到正常生长环境中7 d Transfer to normal growth environment for 7 days after vernalization. * *P < 0.01.
2.4 BcVIL1 基因的亚细胞定位分析

亚细胞定位结果显示:BcVIL1 基因可能定位在细胞核上。而通过在洋葱表皮中进行的亚细胞定位试验发现,在阳性对照中,细胞膜、细胞质和细胞核上都能观察到绿色荧光,而在PC-175中BcVIL1蛋白的荧光信号主要集中在细胞核与细胞膜上(图 7),说明BcVIL1 基因主要在细胞核与细胞膜上发挥功能。

图 7 GFP蛋白和BcVIL1-GFP蛋白在洋葱表皮细胞中的定位 Figure 7 Subcellular localization of GFP protein and BcVIL1-GFP protein in onion epidermal cell
3 讨论

不结球白菜中许多品种或变种属于多年生冬性蔬菜作物,只有通过春化作用才能够抽薹开花。本研究从不结球白菜中克隆出春化途径候选基因BcVIL1 ,通过序列分析发现,不结球白菜BcVIL1 基因与芸薹属及拟南芥中的同源基因具有很高的相似性,说明BcVIL1 进化上有较高的保守性。

在拟南芥中,VIL1基因属于VIN3基因家族,此外,该家族还包括VIN3VIL2VIL3 [16]VIN3 基因是春化过程中的一个重要基因,可以被持续低温诱导,在春化过程中VIN3 通过和多梳蛋白复合体PRC2结合[24],作用在FLC染色质上引起组蛋白H3K9、H3K27的甲基化,使FLC所在的染色质结构从松弛状态转变为高度凝缩状态从而抑制FLC的表达[25]。然而VIN3 基因只在春化过程中表达,春化结束以后便不再对FLC基因产生抑制作用,因而对FLC基因的持续抑制可能就需要其他基因来发挥作用。VIL1 基因也可以编码一段锌指结构域,研究表明在拟南芥中,VIL1 基因在春化期间及春化后均有所表达,且可以和PRC2复合体结合从而参与FLC的组蛋白修饰而抑制其表达,但VIL1PRC2复合体的结合依赖于VIN3基因[4]。本研究发现在PC-175中,春化过程中BcVIL1 在春化7 d时就可以被诱导,而春化结束之后BcVIL1 的表达量是春化前的1.3倍,仍保持较高的表达水平,表明在不结球白菜中,BcVIL1 基因可能在春化期间及春化结束之后都发挥作用,这与在拟南芥中的研究结果相一致[16]。而在一年生菜心‘CX-49’中,与未春化相比,BcVIL1 基因在春化期间及春化之后表达量变化不大,说明BcVIL1 基因的表达可能具有品种特异性。在拟南芥中,发现VIL1 (登录号:AT3G24440)定位在细胞核上,并且可以与VIN3 基因在细胞核中发生互作形成异源二聚体[26]。本研究通过亚细胞定位试验发现,不结球白菜PC-175中的BcVIL1 基因在细胞核与细胞膜上均有表达,这表明在拟南芥到不结球白菜进化过程中,不结球白菜BcVIL1 基因除了在细胞核中发挥原有的作用,可能在细胞膜上也有了新的功能。

在不同类型的不结球白菜中BcVIL1 基因的表达量不同,同时亚细胞定位试验为进一步分析BcVIL1 基因的生物学功能奠定了基础。BcVIL1 基因很可能是通过春化途径影响开花,但具体调控机制有待于进一步研究。这些工作对不结球白菜春化途径调控开花的研究具有一定的参考价值。

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