南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (5): 775-777   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201808100
0

文章信息

吴巨友, 李启明, 王鹏, 张绍铃
WU Juyou, LI Qiming, WANG Peng, ZHANG Shaoling
梨自交不亲和性反应S-RNase新靶点——微丝骨架
Actin cytoskeleton is a new target of S-RNase in self-incompatibility of pear
南京农业大学学报, 2018, 41(5): 775-777
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(5): 775-777.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201808100

文章历史

收稿日期: 2018-08-28
梨自交不亲和性反应S-RNase新靶点——微丝骨架
吴巨友 , 李启明 , 王鹏 , 张绍铃     
南京农业大学园艺学院, 江苏 南京 210095
摘要:S-RNase是梨等配子体型自交不亲和性的雌蕊决定因子,属于RNase T2家族核糖核酸酶,其经典的功能是降解RNA。我们研究证实了S-RNase可以与微丝骨架蛋白PbrAct1互作,解聚花粉管微丝骨架。同时,S-RNase诱导花粉管产生磷脂酸,抑制微丝骨架的解聚,减缓自交不亲和花粉管细胞程序性死亡的进程。
关键词   自交不亲和   花粉管   微丝骨架   
Actin cytoskeleton is a new target of S-RNase in self-incompatibility of pear
WU Juyou, LI Qiming, WANG Peng, ZHANG Shaoling    
College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: S-RNase, which belongs to RNase T2 family ribonuclease, is the female determining factor of S-RNase-based gametophytic self-incompatibility, such as in pear. The classic function of S-RNase is to degrade RNA. In this study, we confirmed a new function of S-RNase that interacts with PbrAct1 to depolymerize actin cytoskeleton in pollen tube. On other hand, the S-RNase increases the concentration of phosphatidic acid in pollen tube, inhibits the depolymerization of actin cytoskeleton and delays the process of programmed cell death in self-incompatibility pollen tube.
Keywords: pear    self-incompatibility    pollen tube    actin cytoskeleton   

生命最重要的功能是繁衍后代。在长期进化过程中, 植物形成一系列增强其后代杂合度, 有利于在复杂多变环境中实现有效生存的繁衍机制, 如自交不亲和性(self-incompatibility, SI)。自然界中, 大约有60%的植物表现为自交不亲和性, 促进了异交, 避免了近亲繁殖, 从而保证植物的遗传多样性, 是形成丰富多彩植物物种的重要驱动力。达尔文认为自交不亲和性是他看到过的最神奇现象。

从遗传上来说, 自交不亲和性的控制位点称之为S位点(S-locus), 可以分为异型自交不亲和性和同型自交不亲和性。同型不亲和性又可以分为孢子体型自交不亲和性(sporophytic self-incompatibility, SSI)和配子体型自交不亲和性(gametophytic self-incompatibility, GSI)。配子体型自交不亲和性又可以分为基于S-RNase的类型(S-RNase-based GSI)和不依赖于S-RNase的类型。

在分子水平上研究较为深入的自交不亲和物种有十字花科(Brassicaceae)的孢子体自交不亲和性, 罂粟科(Papaveraceae)的不依赖于S-RNase活性的配子体型自交不亲和性, 以及蔷薇科(Rosaceae)、茄科(Solanaceae)和车前科(Plantaginaceae)的基于S-RNase的配子体型自交不亲和性。在S-RNase-based GSI研究领域, 1986年澳大利亚Clarke实验室克隆出了雌蕊S蛋白的全长, 并在1989年发现其具有核酸酶的活性, 命名为S-RNase。1994年, 美国McClure和Kao实验室通过遗传转化的方法, 证实了S-RNase是自交不亲和雌蕊决定因子; 2000年加拿大Cappadocia实验室证实了S-RNase进入花粉细胞内起作用; 2004年美国Kao实验室通过遗传转化的方法证实了自交不亲和花粉决定因子; 2006年美国McClure实验室证实HT-B和120kD等非S因子参与调控了S-RNase-based GSI反应。这些里程碑性的突破奠定了解析S-RNase-based GSI分子机制的基础。

蔷薇科的多种果树, 包括梨、苹果、李、杏、甜樱桃等, 均表现为S-RNase-based GSI, 决定了其自花授粉不能坐果, 只有异花授粉才能获得应有的产量和品质。人工授粉用工量大、投入成本高。因此, 克服自交不亲和性, 实现自花结实是梨等果树可持续生产需要解决的重要问题。为此, 从20世纪30年代起, 国际上就有许多学者开展了自花、异花授粉生物学,自交不亲和性的细胞形态学,生理生化学及自交亲和品种选育等方面的研究工作。尤其是最近20余年来, 随着分子生物学发展及研究的深入, 果树自交不亲和性分子机制研究取得了许多突破性进展, 丰富了S-RNase-based GSI机制等学术理论。

从表型上来看, 在梨自交不亲和反应中, 花粉管在花柱的中部停止生长, 不能延伸到子房完成受精。控制梨自交不亲和的S位点分别编码控制雌蕊和花粉的S-RNaseS-locus F-box(SLF/SFB)基因。S-RNase和S-locus F-box分别在雌蕊和花粉中特异表达, 均表现为高度的序列多态性。栽培的梨品种一般为二倍体, 当花粉SLF/SFB与任一雌蕊S-RNase相匹配时, 花粉管不能正常生长完成受精, 表现为自交不亲和性; 当花粉SLF/SFB与雌蕊2个S-RNase均不匹配时, 花粉管能生长到子房并完成受精, 表现为亲和反应。S-RNase是一种碱性糖蛋白, 相对分子质量大约为30×103, 主要分布于柱头和花柱的引导组织中。传统观点认为, 雌蕊控制因子S-RNase的主要功能是降解自交不亲和花粉RNA, 但除此之外, 在自交不亲和花粉中, S-RNase是否还有其他攻击靶点,应对S-RNase的胁迫自交不亲和花粉如何作出应对,这些都是S-RNase-based GSI研究领域长期关注的重点。

针对上述科学问题,我们首先通过花柱原位提取和体外表达S-RNase、花粉管活体荧光染色、花粉离体培养等方法,建立了活体和离体相结合的梨自交不亲和研究技术体系。利用S-RNase的全长序列作为诱饵,构建酵母杂交文库,通过杂交筛选发现花粉微丝骨架蛋白PbrAct1是梨S-RNase的新靶点(图 1)。S-RNase通过位于其特异保守区RC4(Rosaceae conserved region 4)的第156位点的脯氨酸与PbrAct1直接互作后,将花粉管的微丝骨架从丝状结构解聚成点状结构。运用全内反射荧光(total internal reflection fluorescence,TIRF)显微镜技术对单根微丝动态结构进行分析,发现S-RNase可以直接切割微丝,微丝骨架解聚程度达到50%左右即可诱导花粉管发生细胞程序性死亡。已有研究表明,S-RNase降解花粉RNA依赖于其116位点的组氨酸活性。为了验证S-RNase解聚微丝骨架是否需要其核酸酶活性,我们将116位点的组氨酸突变为精氨酸,发现H116R突变的S-RNase依然具有切割微丝骨架的功能,因此认为S-RNase与PbrAct1的互作及其解聚微丝骨架的活性不依赖于其核酸酶的活性。另一方面,P156A突变的S-RNase依然具有核酸酶活性。这些结果说明S-RNase发挥其核酸酶活性和解聚微丝骨架可能是2个独立的生化反应过程。应对S-RNase解聚微丝骨架的胁迫,我们发现磷脂酶D(PLD)及其催化产生的磷脂酸(phosphatidic acid,PA)参与了自交不亲和花粉管启动的自我保护程序。通过同位素标记,发现自交不亲和反应早期(5 min内)花粉中PA的浓度显著升高,在随后的1 h内PA浓度持续增加,而在亲和处理的对照中没有观察到这一现象。磷脂酶D裂解结构磷脂是产生PA的主要途径。梨PLD家族有18个基因,其中有7个PLD基因在花粉中表达。在不亲和S-RNase处理下,只有PbrPLDδ1 的表达量显著升高,与亲和反应差异明显。将PbrPLDδ1用反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, as-ODN)技术抑制表达后,发现自交不亲和花粉管的微丝骨架解聚速率及其死亡速率均显著加快。这些研究结果说明了梨自交不亲和反应中,花粉管PbrPLDδ1催化产生的PA参与抵御S-RNase胁迫的反应,降低自交不亲和花粉管的死亡速率。我们鉴定了自交不亲和反应中S-RNase新的目标靶点,探明了花粉的应对策略,为深入了解梨自交不亲和反应信号转导机制提供了新的观点。

图 1 PbrPLDδ1诱导产生的磷脂酸(PA)通过稳定细胞微丝骨架介导梨自交不亲和早期信号转导反应[1] Figure 1 The schematic of the reaction of PbrPLDδ1-derived phosphatidic acid(PA)mediates early signaling in the self-incompatibility pollen by stablilizing the actin cytoskeleton[1]

该研究以“Phosphatidic acid counteracts S-RNase signaling in pollen by stabilizing the actin cytoskeleton”为题在《The Plant Cell》上发表,被遴选为该刊2018年第5期封面文章重点推介,同时配发了评论文章“Live and let die: phosphatidic acid modulates the self-incompatibility response”。

参考文献(References)
[1] Chen J, Wang P, de Graaf B H J, et al. Phosphatidic acid counteracts S-RNase signaling in pollen by stabilizing the actin cytoskeleton[J]. The Plant Cell, 2018, 30: 1023-1039. DOI: 10.1105/tpc.18.00021