南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (4): 736-741   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201708007
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刘梅, 黄艳, 刘佳, 叶可萍, 李春保, 周光宏
LIU Mei, HUANG Yan, LIU Jia, YE Keping, LI Chunbao, ZHOU Guanghong
绿色魏斯氏菌对单增李斯特菌毒力特性的影响
Effect of Weissella viridescens on the virulence property of Listeria monocytogenes
南京农业大学学报, 2018, 41(4): 736-741
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(4): 736-741.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201708007

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收稿日期: 2017-08-05
绿色魏斯氏菌对单增李斯特菌毒力特性的影响
刘梅 , 黄艳 , 刘佳 , 叶可萍 , 李春保 , 周光宏     
南京农业大学国家肉品质量安全控制工程技术研究中心/农业农村部肉及肉制品质量监督检验测试中心(南京)/江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在研究绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌共存对单增李斯特菌的生长能力、毒力基因表达及细胞黏附能力的影响,揭示乳酸菌与单增李斯特菌之间的交互作用机制。[方法]采用膜隔离装置,取4℃贮藏条件下放置0、12、24、48和96 h的菌悬液分别测定单增李斯特菌和绿色魏斯氏菌的数量,同时提取单增李斯特菌的RNA进行反转录和荧光定量PCR,分析单增李斯特菌6种主要毒力基因(hlyA、prfA、bsh、actA、sigBinlA)的表达情况。利用Caco-2细胞进行绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌的竞争、排斥和置换试验,观察单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附效果。[结果]产细菌素绿色魏斯氏菌C1可降低单增李斯特菌的数量,而不产细菌素绿色魏斯氏菌C2对单增李斯特菌的生长影响不大。C1和C2的代谢产物使单增李斯特菌6种毒力基因表达量下调,且C1导致的下调趋势比C2大。C1主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附,而C2的作用较弱。[结论]产细菌素绿色魏斯氏菌C1比不产细菌素绿色魏斯氏菌C2能够更好地控制单增李斯特菌的生长,抑制相关毒力基因的表达,并主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附。产细菌素绿色魏斯氏菌C1可作为单增李斯特菌的防控菌株。
关键词单增李斯特菌   绿色魏斯氏菌   基因表达   细胞黏附   
Effect of Weissella viridescens on the virulence property of Listeria monocytogenes
LIU Mei, HUANG Yan, LIU Jia, YE Keping , LI Chunbao, ZHOU Guanghong    
National Center of Meat Quality and Safety Control/Supervision, Inspection and Testing Center for Quality of Meat-products(Nanjing), Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Quality and Safety Control, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] Under coexistence conditions, the effects of Weissella viridescens on the virulence property, virulence gene expression and cell adhesion ability of Listeria monocytogenes were studied, aiming to provide a theoretical basis for further supplementation mechanism between lactic acid bacteria and L. monocytogenes. [Methods] The number of colonies of L. monocytogenes and W. viridescens was determined by using membrane isolator at 4℃, in 0, 12, 24, 48 and 96 h. At the same time, the RNA of L. monocytogenes was extracted and subjected to reverse transcription and quantitative real-time PCR. Six virulence genes including hlyA, prfA, bsh, actA, sigB in L. monocytogenes were studied. The effect of L. monocytogenes on Caco-2 cells was studied by competition, exclusion and displacement. [Results] The results showed that the bacteriocinogenic W. viridescens C1 was able to inhibit L. monocytogenes at the initial concentration while the non-bacteriocinogenic W. viridescens C2 had little effect. The metabolition of C1 and C2 could decline virulence gene of L. monocytogenes, and W. viridescens C1, compared with W. viridescens C2, had larger downward trend. W. viridescens C1 inhibited the adherence of L. monocytogenes to Caco-2 cells mainly through replacement and competition, while C2 had a weaker effect. [Conclusions] Bacterial toxin of W. viridescens C1 had a better control than non-bacterial toxin of W. viridescens C2 on the growth ability, virulence gene expression and adhesion to Caco-2 cells which was mainly realized through the replacement and compition effect. Bacteriocinogenic W. viridescens C1 can be used as bio-protective culture for L. monocytogenes.
Key words: Listeria monocytogenes    Weissella viridescens    gene expression    cell adhesion   

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种重要的食源性病原菌, 可引起严重的食源性疾病[1]。免疫力低下的人群更易被单增李斯特菌感染, 感染后较轻症状为胃肠炎, 较重为脑膜炎、败血症、坏死性肝炎、单核细胞增多和神经症状等[2]。单增李斯特菌病发病率不高, 但死亡率却高达20%~30%[3]。人类食源性李斯特菌病主要与肉类和家禽的消费有关[4]。单增李斯特菌在对细胞的侵袭与感染过程中受到多种毒力基因调控及表达蛋白的影响, 其中许多毒力基因已被鉴定和分析[5], 如hlyAprfAbshactAsigBinlA[6]。细菌利用与黏附和侵袭相关的毒力因子, 入侵细胞。hlyA基因参与了单增李斯特菌在细胞吞噬体膜上形成孔洞逃离吞噬体的过程, 促进菌体进入胞液, 是一种不可或缺、最重要的毒力因子之一[7]inlA基因是内源性基因之一, 其在单增李斯特菌侵袭宿主细胞中起作用[8]。编码表面蛋白的actA基因刺激单增李斯特菌在细胞间的扩散。bsh基因可以分解胆酸盐, 并对单增李斯特菌在胃肠道定殖中发挥作用[9]。作为调节因子prfA基因调控并控制许多毒力基因的表达[10]sigB基因作为控制因子[11], 负责在极端pH、极端渗透压、极端温度条件下调控100多种抗逆蛋白质生成[12]

乳酸菌和致病菌之间可以通过不同的机制进行交互作用。乳酸菌可以通过与致病菌竞争, 抢夺细胞表面的黏附受体[13]。它们可以争夺黏附位点的空间, 从而抑制单增李斯特菌的黏附[14]。乳酸菌也可以与一些致病菌共聚集, 产生抑菌物质(如乳酸、过氧化氢、细菌素或是表面活性剂), 从而抑制致病菌的生长[15-16]。目前已发现某些乳酸菌如双歧杆菌、乳酸杆菌可黏附在黏膜组织表面, 限制病原菌进入上皮细胞[17]; 有的乳酸菌可以在肠道环境下存活, 甚至可以定殖, 并对肠道菌群产生积极影响[18]; 有的乳酸菌其代谢产物对病原菌具有拮抗作用, 可以直接抑制致病菌[19]。由于在致病菌开启感染细胞的过程中黏附是首要条件[20], 因此有报道采用Caco-2模型来评估乳酸菌对致病菌黏附小肠上皮细胞的影响[21]。目前, 已报道有6种可以产生细菌素的魏斯氏菌, 包括Weissellicin 110、Weissellin A、Weissellin L、Weissellin D、Weissellin M、Weissellin Y[22-24], 然而绿色魏斯氏菌(Weissella viridescens)对单增李斯特菌的具体影响尚未见报道。本研究选取产细菌素绿色魏斯氏菌C1和不产细菌素绿色魏斯氏菌C2, 通过膜隔离试验研究其对单增李斯特菌生长及重要毒力基因表达的影响, 并通过竞争、排斥和置换试验来检查单增李斯特菌对体外Caco-2细胞的依从性, 探讨绿色魏斯氏菌对单增李斯特菌的毒力特性是否存在影响以及存在何种影响。

1 材料与方法 1.1 试验材料和仪器

单增李斯特菌ATCC 19115标准菌株购自美国典型培养物保藏中心; 2株绿色魏斯氏菌由本实验室分离、鉴定并保存, 其中产细菌素的绿色魏斯氏菌标记为C1, 不产细菌素的绿色魏斯氏菌标记为C2[25]

溶菌酶购自北京索莱宝生物有限公司; 通用引物27F、1492R和毒力基因引物由上海生物生工有限公司合成; 细菌DNA提取试剂盒购自北京天根生化有限公司; 荧光定量反转录PCR试剂盒PC04-50T购自南京钟鼎生物技术有限公司; 胎牛血清、青霉素和pH7.2的PBS缓冲液购自Gibco美国赛默飞世尔科技有限公司; MRS Broth肉汤培养基、MRS Agar培养基和BHI液体培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

Universal Hood Ⅱ凝胶成像仪和Power Pac HC电泳仪购自美国Bio-Rad公司; QuantStudioTM 6 Flex实时荧光定量PCR系统购自美国Thermo Fisher Scientific公司; SPX-250B-Z生化培养箱购自上海博讯实业有限公司; DMI6000B荧光倒置显微镜购自德国Leica公司; ABI 7500 Real-Time PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.2 膜隔离试验

菌液准备:将绿色魏斯氏菌和单增李斯特菌分别接种至MRS Broth肉汤培养基和BHI液体培养基中, 37 ℃条件下培养15 h; 取活化第1次的菌液, 按照2%的比例接入新鲜的MRS Broth、BHI液体培养基中, 37 ℃下振荡4 h, 得到处于指数期的菌体约为108 CFU·mL-1

膜隔离培养体系的设置:将处于稳定期的108 CFU·mL-1绿色魏斯氏菌培养在截留相对分子质量为1×103的即用型透析装置中, 利用浮标使透析装置悬浮于浓度为107 CFU·mL-1的单增李斯特菌透析容器中。将透析容器放在磁力搅拌器上, 调整搅拌速度使其形成涡流, 这样乳酸菌实时代谢产物可实时透过膜进入单增李斯特菌培养液, 且2种菌没有直接的细胞接触。透析装置放置于4 ℃, 0、12、24、48、96 h时取2种菌液待测。

2种细菌计数:对不同取样时间点的单增李斯特菌和绿色魏斯氏菌进行选择性平板计数。取1 mL样品在8.5 g·L-1 NaCl中进行梯度稀释。将单增李斯特菌涂布于含1%添加剂P-104的选择性琼脂PALCAM Agar, 绿色魏斯氏菌涂布于测定乳酸菌的琼脂MRS Agar上。涂布使用螺旋接种仪, 所有涂布好的平板放置在37 ℃条件下培养48 h后计数。

单增李斯特菌RNA的提取:在不同取样时间点从每个体系里取10 mL单增李斯特菌菌液, 8 500 r·min-1、4 ℃离心5 min。将菌体沉淀放置于液氮罐中15 min, 然后置于-80 ℃保存。根据试剂盒说明书提取细菌RNA。纯化后的RNA置于-80 ℃冰箱冻存备用。

采用荧光定量反转录PCR试剂盒进行反转录。为保证反转录效率, 同时使用Oligo(dT)和随机引物。2 μL RNA模板(250 ng·μL-1), 2 μL PrimeScript RT Master Mix, 再用RNase Free水补齐至10 μL。反转录程序:25 ℃10 min; 42 ℃ 30 min; 85 ℃ 5 min。合成的cDNA冻存于-20 ℃冰箱里以备后续试验使用。Real-time PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(Perfect Real Time)预混液。用于扩增单增李斯特菌的inlApfrAhlyAbshsigBactA 6种毒力基因, 内参基因为rpoB基因, 引物详见表 1。反应体系为:SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)12.5 μL, 上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL, cDNA模板2 μL, ddH2O 8.5 μL。

表 1 所用引物及其片段大小[26-29] Table 1 The primers used and the products length
引物Primer 序列(5′→3′) Sequence 大小/bp Length
rpoB-F/R TCGTCGTCTTCGTTCTGTTG/GTTCGCCAAGTGGATTTGTT 221
inlA-F/R ATAGGCACATTGGCGAGTTT/GTGCGGTTAAACCTGCTAGG 160
prfA-F/R CGGGAAGCTTGGCTCTATTTG/GCTAACAGCTGAGCTATGTGC 150
hlyA-F/R CTTTTAACCGGGAAACACCA/TCTTGCGTTACCTGGCAAA 302
bsh-F/R IGAGATTGATTTGGATGCTTATAGTC/AGACATAGAAGATAAATCICCAGGTAA
actA-F/R CGGGTAAATGGGTACGTGAT/TGGTCAATTAACCCTGCACTT 85
sigB-F/R TCATCGGTGTCACGGAAGAA/TGACGTTGGATTCTAGACAC 310
1.3 绿色魏斯氏菌对单增李斯特菌Caco-2细胞黏附能力的测定

细胞准备:Caco-2细胞传代培养于完全DMEM培养液中, 隔天换液。当细胞覆盖培养瓶底80%~90%时, 使用0.025 g·L-1胰蛋白酶消化液进行传代。黏附试验前, 使用血细胞计数板将细胞的浓度调整为105 mL-1, 接种于96孔板中, 每孔100 μL, 待其长成单层进行后续试验。

菌体处理:取稳定期的绿色魏斯氏菌菌液5 mL, 4 500 r·min-1离心5 min, 收集菌体。用1 mL PBS(pH7.2)洗涤3次。将菌体扩散在细胞不完全培养基DMEM(不含青霉素和链霉素, 只含胎牛血清)中。将2株绿色魏斯氏菌的浓度均调整为108 CFU·mL-1。取其稳定期的单增李斯特菌菌液5 mL, 用1 mL PBS(pH7.2)洗涤3次。将菌体扩散在细胞不完全培养基DMEM(不含青霉素和链霉素, 只含胎牛血清)中。将单增李斯特菌的浓度调整为108 CFU·mL-1

排斥试验:将96孔板中的单层Caco-2细胞用PBS清洗1次。每孔加入108 CFU·mL-1绿色魏斯氏菌悬浮液50 μL, 置于5%(体积分数)二氧化碳培养箱37 ℃孵育1 h, 然后用PBS清洗3次除去未能黏附的绿色魏斯氏菌。每孔再加入108 CFU·mL-1的单增李斯特菌50 μL。5%二氧化碳培养箱37 ℃孵育1 h后用PBS清洗3次, 除掉未能黏附的单增李斯特菌。只添加单增李斯特菌的细胞设为对照组。每个孔再加入含有0.001 g·L-1 Triton-X-100的PBS, 常温下振荡5~10 min。选择适宜的稀释度平板涂布至添加了1%(质量分数)P-104单增李斯特菌选择性添加剂的PALCAM Agar上。置于37 ℃培养箱培养48 h后计数, 并计算绿色魏斯氏菌对单增李斯特菌黏附的排斥抑制率(N)。N=(C-T)/C×100%, 其中:C为对照组黏附数量; T为试验组黏附数量。

竞争试验:将96孔板中的单层Caco-2细胞用PBS清洗1次。在96孔板中同时加入50 μL 108 CFU·mL-1的绿色魏斯氏菌和单增李斯特菌。只添加单增李斯特菌的细胞设为对照组。置于37 ℃孵育2 h后, 用PBS对每一个孔清洗3次。再用与排斥试验相同的方法对单增李斯特菌的活菌数计数, 计算绿色魏斯氏菌对其黏附的竞争抑制率(J)。J=(C-T)/C×100%, 其中:C为对照组黏附数量; T为试验组黏附数量。

置换试验:按照排斥试验的方法对黏附的单增李斯特菌计数, 并计算绿色魏斯氏菌对其黏附的置换抑制率(Z)。Z=(C-T)/C×100%, 其中:C为对照组黏附数量; T为试验组黏附数量。

1.4 数据统计与分析

使用SAS 9.2软件进行数据统计分析, 使用One-way ANOVA进行方差分析。数值用x±SD表示。

2 结果与分析 2.1 膜隔离生长试验

图 1可见:产细菌素绿色魏斯氏菌C1可降低单增李斯特菌的数量。12 h时, 单增李斯特菌的数量缓慢下降; 48 h时已下降至约106 CFU·mL-1, 96 h时下降至约105 CFU·mL-1。不产细菌素绿色魏斯氏菌C2对单增李斯特菌的生长影响不大。

图 1 绿色魏斯氏菌C1(A)和C2(B)对单增李斯特菌生长特性的影响(n=3) Figure 1 Effects of Weissella viridescens C1(A)and C2(B)on the growth characteristics of Listeria monocytogenes C1:产细菌毒素的绿色魏斯氏菌The bacteriocinogenic W. viridescens; C2:不产细菌毒素的绿色魏斯氏菌The non-bacteriocinogenic W. viridescens; L:单增李斯特菌L. monocytogenes; TL:膜隔离试验的单增李斯特菌Membrane isolation test of L. monocytogenes.下同。The same as follows.
2.2 绿色魏斯氏菌对单增李斯特菌基因表达的影响

与绿色魏斯氏菌共存条件下, 单增李斯特菌主要毒力基因表达情况如图 2所示。与对照相比, 所有时间点的所有毒力基因表达量均呈下调趋势, 且C1导致的单增李斯特菌毒力基因表达量下调趋势比C2大。与对照相比, 受到C1和C2的影响, 单增李斯特菌的inlAprfAhlyAactA基因表达量在整个过程中呈先下降后上升的趋势, 其中inlA基因表达量在24 h时达到最低点, prfAactA基因均在48 h时达到最低点。受到C1和C2影响的bshsigB基因表达量持续下降。

图 2 绿色魏斯氏菌C1和C2对单增李斯特菌毒力基因表达的影响(n=3) Figure 2 Effects of W. viridescens C1 and C2 on the expression of the virulence genes in L. monocytogenes 不同小写字母表示不同处理组间差异显著(P < 0.05)。下同。 Different small letters in different treatments mean significant difference at 0.05 level. The same as follows.
2.3 绿色魏斯氏菌对单增李斯特菌Caco-2细胞黏附能力的影响

图 3可知:竞争试验中, 绿色魏斯氏菌C1和C2可显著降低单增李斯特菌对Caco-2细胞的竞争黏附, 其抑制率分别为72.97%和49.20%。C1比C2的竞争抑制黏附效果强。排斥试验中, C1能够显著降低单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附, 抑制率为38.42%, 而C2对单增李斯特菌排斥抑制Caco-2细胞的黏附没有起到作用。置换试验中, C1和C2对单增李斯特菌的抑制效果显著, 黏附抑制率分别达到93.40%和90.40%, 说明绿色魏斯氏菌C1和C2抑制单增李斯特菌黏附主要通过置换作用来实现。

图 3 在竞争(A)、排斥(B)和置换(C)试验中绿色魏斯氏菌C1和C2对单增李斯特菌黏附Caco-2细胞的影响 Figure 3 Effects of W. viridescens C1 and C2 on the growth of L. monocytogenes adhered to Caco-2 cells in competition(A), rejection(B)and displacement(C)experiments
3 讨论与结论

本试验中, 产细菌素的绿色魏斯氏菌C1抑制单增李斯特菌生长, 使其处于初始浓度, 而绿色魏斯氏菌C2对单增李斯特菌生长没有影响, 这与Coelho等[30]从奶酪中分离的产细菌素的肠球菌菌株能够抑制单增李斯特菌的生长并使之处在初始浓度的结果相似。

本研究中, 在绿色魏斯氏菌C1连续代谢产物的影响下, inlA基因表达量在0~24 h与对照相比持续下降, 表明绿色魏斯氏菌的代谢产物可能影响了单增李斯特菌穿越细胞屏障的过程, 证明inlA基因表达在介导单增李斯特菌穿越宿主屏障的过程中起重要作用[8]bsh基因的表达量持续下降, 会导致单增李斯特菌在胃肠道中的定殖作用降低。prfA基因在0~48 h表达量与对照组相比持续下降, 推测绿色魏斯氏菌的代谢产物抑制单增李斯特菌细胞膜的形成。Cabanes等[31]研究表明, actA基因能够诱导细胞肌动蛋白分子聚合, 促进细胞间的细菌转移, 这说明在一定程度上单增李斯特菌的转移受到了抑制。sigB基因表达在0 h时与对照相比发生不同程度抑制, 可能是单增李斯特菌受到了C1代谢产物的胁迫后而作出了应激反应。

在细胞黏附试验中, 产细菌素绿色魏斯氏菌C1主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附, 而不产细菌素绿色魏斯氏菌C2的作用较弱, 且产细菌素的菌株在竞争试验中抑制率较高, 这与Ortiz等[15]的研究结果类似。由此可见, 产细菌素绿色魏斯氏菌C1在与单增李斯特菌共存条件下对单增李斯特菌的生长、毒力基因表达和细胞黏附有抑制作用。绿色魏斯氏菌C1具有作为生物防护菌株的潜力, 其抑制作用机制还需要进一步研究。

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