文章信息
- 许长萌, 王志建, 王咪, 刘倩玉, 王先炜
- XU Changmeng, WANG Zhijian, WANG Mi, LIU Qianyu, WANG Xianwei
- 猪伪狂犬病毒引起PK-15细胞自噬的研究
- The study on autophagy induced by pseudorabies virus in PK-15 cells(PRV)
- 南京农业大学学报, 2018, 41(4): 701-707
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(4): 701-707.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201801015
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文章历史
- 收稿日期: 2018-01-11
伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科, 是伪狂犬病(pseudorabies, PR)或奥耶斯基病(Aujeszky’s disease, AD)的重要病原[1-3]。PRV宿主范围广泛, 可以感染大多数哺乳动物, 猪是本病的传染源及自然贮存宿主。PRV感染猪引起的主要症状为妊娠母猪流产, 产死胎及胎儿干尸化; 初生仔猪则会出现神经症状, 病死率达100%;成年猪多呈隐性感染, 但可引起呼吸道症状。临床上, 多以疫苗免疫预防该病, 但近年来由于变异毒株的出现, 疫苗对变异毒株的免疫预防效果较差, 临床发病猪群明显增多, 造成严重经济损失[4-5]。此外, 该变异毒株在进化过程中能够产生免疫逃避, 使感染宿主的免疫系统不能完全将其清除, 增加了PR的防控难度[6]。
自噬(autophagy)是真核细胞对不利环境或刺激产生的自我保护反应, 在维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定等方面起着重要作用[7-8]。据报道, 自噬在抗感染天然免疫的调控和适应性免疫的抗原提呈过程中也发挥了重要作用[9]。另外, 一些病毒还可以利用自噬调节自身感染和复制, 从而产生免疫逃避, 如单纯疱疹病毒(HSV-1)、人巨细胞病毒(HCMV)和卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)均可以表达自身蛋白来抑制自噬体的形成[10]; 艾滋病病毒(HIV)则可以通过阻止自噬的成熟阶段而保护HIV不被降解[11]; 流感病毒(IAV)可以通过调节自噬而使病毒蛋白和RNA蓄积, 从而有利于病毒的复制[12]。因此, 病毒与宿主自噬的相互作用是影响病毒感染的主要机制之一, 也是病毒致病性和感染后诱发宿主反应的主要因素之一。
因此, 本试验以猪伪狂犬病变异毒株ZJ01和传统毒株LA为研究对象, 利用细胞和病毒培养技术、Western blot、透射电子显微镜、激光共聚焦等技术, 对ZJ01和LA引起的细胞自噬、自噬对病毒感染、复制的影响进行研究, 明确变异毒株ZJ01和传统毒株LA引起的细胞自噬特性的差异, 阐明自噬在PRV感染和免疫逃避中的作用, 为进一步了解PRV的致病机制提供新的见解。
1 材料与方法 1.1 细胞与毒株猪肾传代细胞系(PK-15)由笔者所在实验室保存。PRV LA(GenBank登录号:KU552118.1)由中国动物流行病学中心范伟兴研究员惠赠。PRV ZJ01(KM061380.1)由笔者所在实验室分离并保存。通过病毒感染PK-15细胞, 并进行增殖, 测定病毒TCID50滴度分别为109.29 mL-1和109.43 mL-1。
1.2 主要试剂DMEM购自美国Gibco公司; 新生牛血清、雷帕霉素(rapamycin)和LC3B抗体均购自美国Sigma-Aldrich公司; 3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)、β-actin抗体购自上海优宁维生物科技公司; 4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔/抗小鼠抗体均购自上海碧云天公司; Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司; 重组双标签(mRFP-GFP-LC3)腺病毒载体购自上海汉恒生物公司; gB病毒蛋白的单克隆抗体由笔者所在实验室制备并保存。
1.3 病毒感染用D-hank’s清洗单层细胞3次, 加入适量的病毒液, 置于37 ℃、5% CO2培养箱吸附1 h后, 加入含2% FBS细胞营养液继续培养, 每天观察细胞病变。待细胞病变达90%左右, 将细胞病毒液反复冻融3次, 充分混匀, 4 ℃、6 000 r·min-1离心5 min, 收集上清液, 分装, -80 ℃冰箱保存备用。
1.4 Western blot检测LC3-Ⅱ蛋白的表达用预冷的PBS洗涤细胞2次, 裂解细胞后, 4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min, 收集上清液, 并用BCA蛋白定量试剂盒测定上清液中蛋白浓度以进行定量。目的蛋白经120 g·L-1 SDS-PAGE电泳分离后通过半干转印法转移至0.22 μm NC膜上, 5%脱脂乳室温封闭2 h, PBS洗涤3次, 加兔抗LC3抗体4 ℃孵育过夜; 经PBS洗涤3次后, 羊抗兔IgG-HRP室温孵育1 h, 通过蛋白成像仪拍照。用Image J软件分析各泳道内条带总灰度值及各条带灰度值占总灰度值的比例, 并计算LC3-Ⅱ/β-actin值。
1.5 透射电子显微镜观察自噬体的产生将PK-15细胞接种于6孔细胞培养板中, 待细胞汇合率达到80%左右, 用PRV感染细胞, 同时设置空白对照组。培养24 h, PBS洗涤细胞2次, 去除非特异性结合的病毒。将待检测的细胞收集到1.5 mL EP管中, 以1 500 r·min-1离心10 min; 弃上清液后迅速用新鲜配制的体积分数为2.5%的戊二醛溶液对细胞进行固定; 其后对样本进行脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等处理, 在透射电子显微镜下观察。
1.6 细胞毒性测定使用非放射性毒性检测试剂盒(Promega)检测Rapamycin和3-MA对细胞是否具有毒性作用。具体操作方法见试剂盒说明书。
1.7 激光共聚焦荧光显微镜观察LC3阳性斑点的产生将无菌细胞爬片预先置于24孔细胞培养板中, 在其上接种PK-15细胞。待细胞汇合率达到70%左右时转染双标签(红色、绿色荧光)腺病毒载体(mRFP-GFP-LC3)。转染24 h后进行以下处理:阳性对照组, 用雷帕霉素(100 nmol·L-1)处理PK-15细胞24 h; 阴性对照组, 先用3-甲基腺嘌呤(5 mmol·L-1)预处理PK-15细胞4 h, 再接种PRV(感染复数MOI=0.5);试验组, PRV LA和PRV ZJ01(MOI=0.5)分别感染PK-15细胞。培养24 h后, PBS洗涤细胞2次。4%多聚甲醛室温固定30 min, PBS洗涤细胞2次; 用DAPI染色液作用细胞10 min, PBS洗涤细胞2次; 取干净的载玻片, 在其上滴加10 μL体积分数为50%的甘油, 再将爬片倒置于甘油上, 封片剂封片, 激光共聚焦显微镜观察并拍照。
1.8 siRNA干扰方法检测自噬对病毒复制的影响设计并合成特异性靶向Beclin-1和非特异性随机片段(NC)的小干扰RNA(siRNA)片段。将PK-15细胞在24孔细胞培养板中培养至融合达到60%~70%, 然后按照Lipofectamine 3000转染试剂操作说明进行瞬时转染。转染24 h后, 用Western blot和半数感染量(TCID50)方法分别测定gB蛋白的表达和病毒滴度。
1.9 数据分析所有试验均进行3次重复, 使用GraphPad Prism 6.0软件分析组间差异性(Two-way ANOVA)。
2 结果与分析 2.1 PRV感染PK-15细胞对LC3蛋白表达的影响LC3是微管相关蛋白家族(MAP)成员, 是重要的自噬相关蛋白, 现已被广泛用于监测自噬体的合成和降解过程[13-15]。为了研究PRV感染PK-15细胞对自噬的影响, PRV LA和ZJ01分别以0.5感染比(multiplicity of infection, MOI)感染PK-15细胞, 分别于2、6、12和24 h收取细胞样品, 采用Western blot方法检测LC3的表达水平。Western blot分析表明, PRV LA毒株随着病毒复制时间的延长, PK-15细胞内的LC3-Ⅰ逐渐向LC3-Ⅱ转化(图 1)。而PRV ZJ01毒株在感染12 h前LC3-Ⅱ表达量低于对照和PRV LA; 感染24 h时, LC3-Ⅱ的表达量却显著升高, 且高于PRV LA传统毒株。此结果表明, PRV感染PK-15细胞诱导自噬的产生。
2.2 透射电子显微镜观察自噬体的产生透射电子显微镜(TEM)也是用来监测自噬的方法之一[16-17]。本试验中, PRV LA和PRV ZJ01分别以0.5 MOI感染PK-15细胞, 并同时于感染24 h时收取并制备细胞样品, 利用TEM观察细胞形态和超微结构的变化。从电镜图可以看出, 正常未处理组(图 2-a)的细胞内未见到明显的自噬小体结构, 而PRV感染的PK-15细胞中却可见到明显增多的自噬小体结构(图 2-b和图 2-c, 白色箭头所示)。
2.3 自噬调节剂对细胞活力的影响自噬调控药物对细胞可能存在毒性作用, 从而间接影响病毒在细胞中的增殖, 对试验结果造成干扰。为了观察这类药物对细胞有无毒性作用, 根据非放射性细胞毒性测定法分析了雷帕霉素(100 nmol·L-1)和3-MA(5 mmol·L-1)对细胞活力的影响。统计分析显示:雷帕霉素和3-MA对PK-15细胞活力均没有显著影响(P>0.05)(图 3)。
2.4 激光共聚焦荧光显微镜观察PRV感染PK-15细胞后LC3阳性斑点的产生为了证实PRV感染是否可以诱导完整的自噬流反应, 利用串联的GFP-RFP-LC3腺病毒做进一步研究。根据自噬溶酶体和自噬体之间的pH差异以及从自噬体向自体溶酶体过程中绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)对pH敏感性的差异, 来监测自噬流的发生过程。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体时, 绿色荧光淬灭, 此时仅检测到红色荧光自噬[18-19]。雷帕霉素(rapamycin)作为一种阳性诱导剂, 可以诱导自噬的发生, 使LC3阳性斑点明显增加; 而3-MA作为自噬抑制剂, 可以抑制自噬的发生, 并使LC3斑点数量减少。从图 4可以看出:阳性对照组和PRV感染组的LC3阳性斑点数明显高于空白对照组和3-MA预处理组。以上试验表明, 经PRV感染的PK-15细胞可以诱导完整的自噬流反应。
2.5 利用雷帕霉素和3-MA分析自噬对PRV复制的影响在证实了PRV感染可以诱导细胞自噬后, 为研究自噬对PRV复制的影响, PK-15细胞经自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA分别预处理4 h后, 再同时接种0.5 MOI的PRV, 感染24 h后分别通过Western blot和TCID50方法测定病毒结构蛋白(gB)的表达量和病毒滴度。由图 5可见:经雷帕霉素诱导自噬后, 不仅提高了PRV gB的表达(图 5-A), 而且子代病毒产量增加(图 5-B), 而经自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后, 其结果与之相反。这些结果表明, 自噬对PRV的复制具有促进作用。
2.6 沉默自噬相关基因Beclin-1对PRV复制的影响为了进一步研究自噬对PRV复制的影响, 利用siRNA沉默了PK-15细胞上自噬相关基因Beclin-1的表达, 分别感染变异毒株PRV ZJ01和传统毒株PRV LA, 感染24 h后, 利用Western blot和TCID50方法分别测定gB蛋白的表达和病毒滴度。由图 6可见:与未感染病毒组相比, PRV感染组的Beclin-1表达水平明显提高, 并且PRV ZJ01感染组高于PRV LA感染组。此外, 与空白对照和阴性对照(siRNA)相比, 转染siRNA-Beclin-1的细胞中Beclin-1、LC3、gB蛋白表达量均显著降低(图 6-A), 相对应的子代病毒产量也明显减少(图 6-B), 2株病毒在Beclin-1沉默细胞中的复制水平与对照细胞相比均有显著变化。这表明自噬相关基因Beclin-1参与自噬对PRV复制的促进作用。
3 讨论细胞自噬在清除病原体, 维持细胞内稳态等方面起着至关重要的作用[20-21]。大量文献报道了自噬在疱疹病毒感染中的作用。例如, HSV-1通过ICP34.5和US11这2种编码蛋白来抑制自噬[22-23]。Sun等[24]的研究表明PRV通过US3蛋白抑制自噬从而减少病毒复制。另一种重要的病原体水痘-带状疱疹病毒(VZV), 因缺乏ICP34.5和US11两种蛋白, 可以诱导自噬以促进VZV糖蛋白的合成和加工[25-27]。PRV和VZV同属于水痘病毒亚科, 其基因组中都不含有ICP34.5蛋白及其同系物。在本研究中, 采用Western blot、透射电子显微镜以及激光共聚焦方法证实PRV感染可以诱导PK-15细胞产生自噬, 与文献[25-27]报道结果一致, 但与Sun等[24]结果不同, 这可能与毒株差异有关。
在证实PRV感染PK-15细胞可以增强细胞自噬的基础上, 继续研究自噬对PRV复制的影响。利用自噬诱导剂雷帕霉素和抑制剂3-MA诱导或抑制PK-15细胞的自噬, 病毒蛋白或滴度会相对应的增加或降低。通过沉默自噬相关基因Beclin-1试验, 进一步证实了PRV感染PK-15细胞所诱导的自噬可以促进PRV的复制。然而, 自噬在PRV复制中的具体作用和相关通路仍需进一步研究。
PRV感染的能力与毒力相关[28-29]。为了比较不同毒力的毒株诱导自噬的差异, 本试验选用了传统毒株LA和变异毒株ZJ01两种不同毒力的毒株分别以相同感染量同时感染PK-15细胞, 结果发现不同毒力的PRV毒株所诱导自噬水平存在着差异。推测自噬的差异也有可能是导致变异毒株和传统毒株免疫学差异的一个重要原因。PRV引起PK-15细胞自噬的具体机制及不同毒株引起自噬差异的原因尚需要进一步研究。
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