切花菊以设施连作为主, 随着连作年份的增加, 枯萎病发生频繁, 并有逐年加重的趋势^[1]。菊花枯萎病是一种常见的土传病害, 病菌一般从根部侵入, 引起维管束病害。枯萎病发病初期植株下部叶片变黄、脱落, 最终整株枯死, 且在作物的全生育期内均会发生, 给农民和生产企业带来严重的经济损失^[2]。

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是枯萎病的主要致病菌^[3-4], 是一种世界性分布的土传病原真菌, 寄主范围广, 对不良环境抵抗力强, 可以在土壤中长时间存活, 可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生^[5]。近年来, 关于尖孢镰刀菌致病性和枯萎病的致病机制受到国内外研究者的广泛关注。Chakrabarti等^[6]研究发现马铃薯中分离的尖孢镰刀菌毒力与镰刀菌酸产量呈正相关; 田雪亮等^[7]研究表明黄瓜枯萎菌粗毒素对不同抗性的黄瓜胚根生长和侧根分化均有抑制作用; 韩鲁明等^[8]研究表明西瓜砧木种传尖孢镰刀菌粗毒素对西瓜砧木幼苗有致萎焉作用。这些研究均表明尖孢镰刀菌能分泌毒素, 通过毒素对植物产生化感作用, 影响植物的健康生长。尖孢镰刀菌在代谢过程中产生的镰刀菌酸是一种非寄主专化性病原真菌毒素, 这种毒素被认为是引起寄主植物发生病害的重要致病因子之一^[9-10]。

目前, 有关枯萎病病原菌毒素的研究与利用已有报道, 如胡忠亮等^[11]通过测定尖孢镰刀菌毒素滤液对转基因香石竹抗枯萎病的性能, 发现镰刀菌毒素可用于筛选抗枯萎病的优良转基因香石竹, 为转基因抗性品系选育和转基因香石竹抗病品系的推广种植提供依据; 胡颖慧等^[12]研究了枯萎病菌毒素培养滤液对唐菖蒲幼苗的毒性, 发现枯萎病菌毒素培养滤液是唐菖蒲枯萎病的致病因子, 可以利用其筛选唐菖蒲抗枯萎病品种。然而, 有关菊花枯萎病病原菌粗毒素在切花菊上的研究与利用很少。因此, 本试验分离、鉴定了菊花枯萎病的病原菌并研究其粗毒素对切花菊幼苗生长的影响, 旨在揭示尖孢镰刀菌毒素引起菊花枯萎病时菊花幼苗的生理响应, 为探索尖孢镰刀菌引起菊花枯萎病的致病机制提供参考。

供试菌株CFD-B2, 2016年夏季从南京农业大学湖熟菊花实验基地发病的切花菊‘神马’植株中分离所得。

取生长状态一致的切花菊‘神马’的插穗, 扦插于穴盘(长12 cm, 宽6 cm)中; 待其生根后, 移栽至一次性塑料杯(下口径4 cm, 上口径5 cm, 高9 cm, 底部打孔)中, 杯内基质为草炭和蛭石(质量比为3:1)。在塑料杯中培养5 d后, 即为供试菊花幼苗。

病原菌分离纯化采用PDA培养基, 毒素制备采用Czapek液体培养基^[13]。

病原菌分离:田间观察植株病害部位、病斑大小、形状和颜色, 并采集枯萎病发病植株, 用自来水冲洗, 取病健交界组织。采用组织块法分离真菌, 纯化后, 将真菌接种到PDA平板上, 观察菌落形态, 并在显微镜下观察孢子形态和大小等特征。

病原菌鉴定:先将分离到的菌株接种于PDA平板上, 25 ℃培养3 d, 然后切取直径约为0.7 cm的菌饼2~3个, 接种到50 mL PDB培养液中, 25 ℃、170 r·min^-1恒温摇床培养4 d, 最后将菌液放入50 mL的离心管, 9 000 r·min^-1离心1 min。采用真菌DNA提取试剂盒(Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit)提取真菌的基因组DNA。将提取后的DNA用引物ITS1F/ITS4^[14]进行PCR扩增, 产物通过20 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳检测, 切胶、纯化后, 由思普金生物公司进行测序。采用NCBI-BLAST进行序列比对, 采用Mega 5.05软件构建Neighbor-joining系统进化树。

病原菌回接验证:将病原菌接种到PDA平板上, 25 ℃培养4 d, 然后切取3~5个直径为约0.7 cm的菌饼, 接种到100 mL的PDB培养液中, 25 ℃、170 r·min^-1恒温摇床培养, 血球计数板测定孢子浓度达到1×10⁷ mL^-1。选取健壮且长势一致的切花菊‘神马’幼苗, 轻剪伤根, 采用灌根法, 每株幼苗每克土定量灌注1×10⁵个孢子。接种后观察幼苗的发病情况和发病症状。

将菌株接种在PDA平板上, 置于25 ℃恒温培养箱进行纯化培养。培养7 d后, 沿菌落边缘切取直径为0.7 cm的菌饼, 接入装有200 mL灭菌的PDB培养基的三角瓶中。每瓶内接3个菌饼, 并将三角瓶置于25 ℃、170 r·min^-1的恒温摇床中连续振荡培养14 d。培养液用四层纱布滤出菌丝体, 收集滤液, 5 000 r·min^-1离心15 min, 弃沉淀, 取上清液置于65 ℃水浴30 min, 得到粗毒素。参考Curir等^[15]的方法提取镰刀菌粗毒素中的镰刀菌酸, 并参照文献[12]使用高效液相色谱法对提取出的镰刀菌酸进行定量分析, 测得质量浓度为168.12 μg·mL^-1, 4 ℃冰箱保存备用。

试验于2016年7—8月在南京农业大学菊花实验室的温室内进行, 菊花培养室温度(25±2)℃, 相对湿度为40%, 光照度为1 500~2 000 lx(开灯)或200~500 lx, 光照时间为16 h。试验设5个不同稀释倍数的粗毒素处理:1)对照CK, 不添加粗毒素; 2)粗毒素原液, 镰刀菌酸质量浓度为168.12 μg·mL^-1; 3)粗毒素稀释5倍, 即33.62 μg·mL^-1; 4)粗毒素稀释10倍, 即16.81 μg·mL^-1; 5)粗毒素稀释25倍, 即6.72 μg·mL^-1。将健壮且长势一致的供试菊花幼苗‘神马’从塑料杯中连根拔起, 清洗干净, 轻剪伤根, 分别浸入不同质量浓度的尖孢镰刀菌粗毒素溶液中侵染48 h。每个处理40株, 随机分为4个重复。将植株移栽入塑料杯中, 进行毒素处理, 于7、12、17、22 d取样测定菊花幼苗相关生理指标。

用直尺测量菊花幼苗的株高和根长, 游标卡尺测量幼苗的茎粗。

将菊花幼苗的根系洗净晾干, 切成1 cm的小段, 取1 g根系放入装有10 mL超纯水的试管内, 35 ℃水浴30 min, 静置30 min, 测定每株根系浸出液的电导率; 再取1 g根系放入装有10 mL超纯水的试管内, 沸水浴30 min, 静置30 min, 测定每株根系浸出液的电导率。电导率由DDS-307电导率仪测定。根系细胞膜透性=35 ℃水浴条件下外渗液的电导率值/沸水浴条件下外渗液的电导率值×100%^[16]。过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性测定采用马国斌等^[17]的方法, 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定采用赵进红等^[18]的方法。丙二醛(MDA)、可溶性糖和脯氨酸含量的测定采用张志良等^[19]的方法。

采用Excel 2007对数据进行统计与整理, 并采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析和差异显著性分析。

由图 1-A可见:在PDA平板上菌落呈突起絮状, 大量孢子生成并呈粉质。菌落呈粉白色、浅粉色至肉色(图 1-B)。菌丝结构致密, 且有分枝(图 1-C)。孢子形态:单胞呈卵形、椭圆形或肾形; 多胞呈镰刀形, 略弯曲, 两端细胞稍尖(图 1-D), 这些形态学特征均符合镰刀菌属的特征。

	图 1 尖孢镰刀菌CFD-B2的形态学特征 Figure 1 Morphology of Fusarium oxysporum CFD-B2 A.菌落正面形态Front culture character; B.菌落背面形态Back culture character; C.菌丝形态Mycelial morphology; D.孢子形态Spore morphology.
图选项

为了进一步确定菌株种类和分类学地位, 提取病原真菌的基因组DNA, 对ITS基因进行PCR扩增以及测序。测序结果与NCBI核酸序列比对, 该菌株与Fusarium oxysporum isolate H3菌株的相似性为99%, 且在系统发育树上聚为一支(图 2), 结合菌株形态特征, 确定该菌株为尖孢镰刀菌, 命名为CFD-B2。

	图 2 基于ITS基因序列菌株CFD-B2的Neighbor-joining系统发育树 Figure 2 Neighbor-joining phylogenetic tree of CFD-B2 based on ITS gene sequence
图选项

由图 3可见:从菊花枯萎病株上分离出的尖孢镰刀菌菌株CFD-B2接种切花菊幼苗28 d后, 切花菊幼苗的叶片自下向上表现出枯黄、萎蔫的症状。采集病株进行病原菌分离, 再次获得与原分离菌一致的病原菌, 根据柯赫氏法则, 证明接种菌即为切花菊枯萎病病原菌。

	图 3 接种尖孢镰刀菌28 d后切花菊‘神马’的生长情况 Figure 3 The growth of chrysanthemum 28 days after inoculation of F. oxysporum CFD-B2 CK:对照, 不接种尖孢镰刀菌In contrast, non-inoculated with F. oxysporum CFD-B2;CFD-B2:切花菊幼苗接种尖孢镰刀菌CFD-B2 Chrysanthemum seedlings inoculated with F. oxysporum CFD-B2.
图选项

由表 1可见:与对照相比, 尖孢镰刀菌粗毒素不同稀释倍数处理后切花菊幼苗在7~22 d的生长过程中的根、茎生长均受到不同程度的抑制, 各处理抑制程度由强到弱依次为:粗毒素原液处理、稀释5倍处理、稀释10倍处理、稀释25倍处理。与对照相比, 粗毒素原液处理7、12、17和22 d时, 株高分别显著降低了28.87%、21.85%、12.62%和8.74%;茎粗分别降低了7.31%、11.91%、11.21%和13.51%;根长分别显著降低了42.48%、35.28%、25.07%和13.67%。尖孢镰刀菌CFD-B2粗毒素处理对切花菊‘神马’幼苗根长的抑制效果显著高于茎粗和株高。

由图 4-A可见:与对照相比, 不同稀释倍数的粗毒素处理后, 同期切花菊幼苗根系细胞膜透性显著增大。尖孢镰刀菌粗毒素处理能够增加细胞膜透性, 且效果从大到小依次为粗毒素原液处理、稀释5倍处理、稀释10倍处理、稀释25倍处理。粗毒素原液处理在7、12、17和22 d时菊花幼苗的根系细胞膜透性分别是CK的2.51、4.38、4.39和3.01倍。由图 4-B可见:与CK相比, 不同稀释倍数的粗毒素处理切花菊幼苗后, 根系组织中丙二醛含量显著增加, 且从大到小依次为粗毒素原液处理、稀释5倍处理、稀释10倍处理、稀释25倍处理。粗毒素原液处理7、12、17和22 d时根系组织中丙二醛含量比对照分别增加了21.69%、28.03%、23.86%和21.79%。

	图 4 不同稀释倍数粗毒素对切花菊幼苗根系细胞膜相对透性(A)和丙二醛含量(B)的影响 Figure 4 Effects of different dilution multiples crude toxin on the cell membrane relative permeability(A) and MDA content(B)of chrysanthemum seedling root
图选项

由图 5-A可知:与对照相比, 不同稀释倍数的粗毒素处理切花菊幼苗后, 根系中可溶性糖含量显著升高。在7和12 d时, 均为粗毒素原液处理的可溶性糖含量最高。在17和22 d时, 均为粗毒素原液稀释10倍根系组织中可溶性糖含量最高。由图 5-B可知:与对照相比, 不同稀释倍数的粗毒素处理切花菊幼苗7和12 d时, 根系中脯氨酸含量显著升高, 且均为稀释5倍处理的根系中脯氨酸含量最高。不同稀释倍数的粗毒素处理切花菊幼苗17和22 d时, 除粗毒素原液处理, 其他处理根系中脯氨酸含量显著升高, 且均为稀释25倍处理的根系中脯氨酸含量最高, 分别是对照的2.17和1.93倍。

	图 5 不同稀释倍数的粗毒素处理对切花菊幼苗根系中可溶性糖含量(A)和脯氨酸含量(B)的影响 Figure 5 Effects of different dilution multiples crude toxin on soluble sugar content(A)and proline content(B) of chrysanthemum seedling root
图选项

由表 2可知:与对照相比, 尖孢镰刀菌粗毒素不同稀释倍数处理根系中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性均有所升高。其中, 粗毒素原液处理后, 根系中PAL活性显著高于对照, 且在12 d时达最大值, 比CK增加了44.39%;根系中POD和PPO活性也在12 d达到最大值, 分别比CK增加了36.96%和35.38%。

根际环境存在病原微生物时, 根系环境受病原微生物影响, 其所释放的分泌物较未受病原菌感染植株的数量大^[20], 这些分泌物对寄主植物或附近植物产生化感作用^[21]。尖孢镰刀菌产生的粗毒素作为化感物质, 对植物根茎生长有明显的抑制作用。田雪亮等^[7]在黄瓜枯萎病致病菌粗毒素的研究中发现粗毒素对黄瓜胚根生长和侧根分化均有抑制作用, 随着粗毒素处理浓度的升高, 抑制现象越明显。杨媚等^[22]的研究也证实了香蕉枯萎病菌对不同种类作物种子的萌发和萌芽生长都有不同程度的抑制作用。本试验结果也表明, 尖孢镰刀菌粗毒素处理能够抑制切花菊幼苗根、茎的生长, 且抑制程度与尖孢镰刀菌粗毒素浓度成正相关。

研究表明, 膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)、可溶性糖含量和小分子渗透物质脯氨酸含量可作为评价植物组织抗性指标进行研究^{[7, 23-24]}。本研究表明, CFD-B2粗毒素原液处理菊花幼苗后, 根系中MDA含量显著高于对照, 并且可溶性糖和脯氨酸含量均显著升高, 这与赵娟等^[25]在甜瓜幼苗上的研究结果一致。这可能是因为尖孢镰刀菌产生的尖孢镰刀菌毒素能改变寄主植物细胞的质膜系统, 使膜结构与功能受到损伤, 影响植物正常的生长代谢。在7~22 d时CFD-B2粗毒素原液处理的根系细胞膜透性均显著高于对照, 表明粗毒素处理能够破坏切花菊幼苗根系的细胞膜, 导致根系组织细胞膜透性增大, 植物体内MDA、可溶性糖和脯氨酸含量升高, 最终导致植株萎蔫死亡。

参与植物体内多种生理代谢过程的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)与植物防卫反应及抗病性密切相关, 是衡量植物体内防卫反应的重要指标^[26]。本研究表明, 与对照相比, 尖孢镰刀菌不同浓度的粗毒素处理根系中PAL、POD和PPO活性均有所增高, 表明镰刀菌粗毒素能够显著提高与抗病相关的根系保护酶活性, 在一定程度上增强植物根系的防病能力, 这与董鲜^[23]的研究结果一致。关于菊花枯萎病菌粗毒素的生物结构、组成、作用机制等方面还有待于进一步深入研究。