南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (4): 640-646   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201708031
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肖栋, 韦艳萍, 李英, 侯喜林
XIAO Dong, WEI Yanping, LI Ying, HOU Xilin
不结球白菜病程相关蛋白基因BcPR5的克隆及表达分析
Cloning and expression analysis of pathogenesis-related protein gene BcPR5 in non-heading Chinese cabbage
南京农业大学学报, 2018, 41(4): 640-646
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(4): 640-646.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201708031

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收稿日期: 2017-08-23
不结球白菜病程相关蛋白基因BcPR5的克隆及表达分析
肖栋 , 韦艳萍 , 李英 , 侯喜林     
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室/江苏现代园艺工程技术中心, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在研究不结球白菜病程相关蛋白基因BcPR5的结构与表达特征。[方法]通过RACE技术,从抗病品种‘苏州青’叶片克隆到BcPR5基因的全长cDNA序列。采用RT-qPCR方法分析该基因在霜霉病菌诱导,水杨酸(SA)、茉莉酸(MeJ)和脱落酸(ABA)等激素处理条件下的表达模式。SDS-PAGE技术分析该基因的原核表达特征。[结果]BcPR5基因的cDNA全长为954 bp,其中开放阅读框长度为732 bp,共编码243个氨基酸,相对分子质量为26.1×103,理论等电点是9.3。氨基酸同源系统进化分析表明,不结球白菜BcPR5基因与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜第6号染色体上的基因同源性最高(100%)。RT-qPCR分析表明,抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’在霜霉病菌和非生物胁迫(SA、MeJ和ABA)诱导过程中,BcPR5基因的表达量均呈先升高后降低的趋势,且抗病品种高于感病品种。原核表达结果表明,该蛋白在终浓度为1.0 mmol·L-1的IPTG诱导4 h后能实现融合蛋白的高效表达。[结论]BcPR5在不结球白菜抗霜霉病防御反应中发挥着重要作用,研究结果为该基因的功能验证提供理论基础。
关键词不结球白菜   病程相关蛋白基因(PR5)   霜霉病菌   实时定量PCR   原核表达   
Cloning and expression analysis of pathogenesis-related protein gene BcPR5 in non-heading Chinese cabbage
XIAO Dong, WEI Yanping, LI Ying, HOU Xilin    
State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in Eastern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Jiangsu Engineering and Technology Center for Modern Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] In present work, the characteristics of the sequence structure and expression pattern involving in pathogenesis-related protein gene(BcPR5)in non-heading Chinese cabbage(Brassica campestris ssp. chinensis), were investigated to explore its species-specific function in the tolerance of downy mildew defense. [Methods] The full length sequence of BcPR5 cDNA was cloned from the disease-resisted variety 'Suzhouqing' by performing the rapid amplification of cDNA ends(RACE)reactions. The RT-qPCR subsequently was done for investigating the expression pattern of BcPR5 gene under the induction of downy mildew and the treatment of plant hormones involving in MeJ, SA and ABA. Additionally, the prokaryotic expression of BcPR5 protein was performed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE). [Results] The full length of BcPR5 cDNA sequence is 954 bp, of which, 732 bp ORF is included which encodes a functional protein by 243 amino acid with the molecular weight of 26.1×103 and isoelectric point of 9.3. The phylogenetic analysis of amino acid homologous suggested that the BcPR5 from the non-heading Chinese cabbage has the highest similarity(100%)with the homologous in Chinese cabbage. The results of RT-qPCR showed that the expression level of BcPR5 gene increased at first and then decreased during infection by downy mildew and abiotic stresses(SA, MeJ and ABA)in the resistance variety 'Suzhouqing' and the susceptible variety 'Aijiaohuang', and the transcription at higher levels in resistance variety than that of in susceptible variety. Prokaryotic expression results showed that efficient expression of the protein could be realized after induced with 1.0 mmol·L-1 IPTG for 4 h. [Conclusions] These results suggest that BcPR5 plays an important role in response to the tolerance of downy mildew defense in non-heading Chinese cabbage, and will provide a theoretical basis for further functional verification for BcPR5 gene.
Key words: non heading Chinese cabbage    pathogenesis-related protein gene(BcPR5)    Peronospora parasitica    quantitative RT-PCR    prokaryotic expression   

近年来, 由于世界范围内广泛引种, 不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis)逐渐成为世界性蔬菜。霜霉病是不结球白菜较严重的真菌病害之一, 由病原菌Peronospora parasitica侵染引起, 常引起不结球白菜幼苗和成株叶片枯黄, 导致其产量下降, 品质降低。因此, 深入研究不结球白菜霜霉病菌遗传机制, 对于抗病育种及抗病品种合理布局具有十分重要的指导意义。

植物受到病原菌侵染后会积累一些新的蛋白, 被称为病程相关蛋白(PR)。研究表明, PR基因的表达水平和抗病性之间紧密相关, 甚至有些PR蛋白在体外仍具有抗菌活性[1-2]。依据氨基酸序列结构、生物化学和结构特征, PR基因被分为17类, 即PR1—PR17[1, 3-4]PR基因的表达受多种环境因素的诱导, 包括病原菌、生物激发子、植物激素、生理胁迫因子和化学诱导剂等[4-5]。植物激素水杨酸(SA)、茉莉酸(MeJ)和脱落酸(ABA)作为重要的内源信号物质, 在诱导植物抗病反应中发挥了重要作用[6-8]。外施激素SA、MeJ和ABA可以诱导植物体内PR基因表达, 使植物产生系统获得抗性(SAR)[9-12]。目前, 在不结球白菜中已经克隆了病程相关蛋白家族基因PR1PR2PR3PR4, 它们在抗病品种‘苏州青’中受到霜霉病和外源激素诱导表达[13-15]。尽管内源激素作为PR基因激活剂这一现象已被肯定, 但从激素到PR基因表达的信号传导途径及PR基因对病原菌的转录调控尚知之甚少。

本研究以采用cDNA-AFLP方法从不结球白菜中获得的霜霉病菌诱导的差异表达片段为探针[16], 从不结球白菜抗病品种‘苏州青’中利用RACE技术克隆了病程相关蛋白基因BcPR5, 并进行了结构特征分析。通过qRT-PCR分析BcPR5在不结球白菜响应霜霉病菌侵染和外源激素(SA、MeJ和ABA)诱导的表达模式, 以及通过原核表达对该基因的蛋白特征进行鉴定, 旨在为深入研究BcPR5基因在不结球白菜抗真菌防御反应中的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 植物材料

供试材料为不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis)抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’[17]。所有种子用1 g·L-1HgCl2消毒20 min, 再用蒸馏水冲洗10次。将种子播种于灭菌基质中, 置于人工气候箱中培养, 每日22 ℃光照培养16 h, 16 ℃暗培养8 h, 相对湿度(85±5)%。待幼苗长至5片真叶时, 整株植物用于诱导处理。

1.2 真菌接种液和外源激素诱导液的制备与接种方法

从感病的不结球白菜上分离霜霉病菌(Peronospora parasitica), 配制1×105 mL-1孢子囊悬浮液, 霜霉病病原菌接种液的制备参照陈晓峰[15]的方法。配制2 mmol·L-1 SA(pH6.5)、100 μmol·L-1 MeJ和50 μmol·L-1 ABA外源激素诱导液, 并将100 μL的诱导液喷于叶片表面, 对照为超纯水。将霜霉病菌接种液和外源激素诱导液分别喷施于20个单株, 接种后在人工气候箱20 ℃黑暗中保湿24 h, 然后揭掉遮光物, 再在22 ℃光照培养16 h, 16 ℃暗培养8 h, 相对湿度(85±5)%, 直至采样结束。每个处理3个重复。接菌后12、24、48、72和96 h观察(图 1)和取样(120 h感病严重没有取样), 用于RT-qPCR表达分析。所有样品用液氮速冻并保存在-80 ℃冰箱中备用。

图 1 接种霜霉病菌后不结球白菜第4片叶的感病情况 Figure 1 Susceptible condition of the 4th leaf inoculated with downy mildew in non-heading Chinese cabbage
1.3 RNA的提取和cDNA合成

采用Trizol reagentRNA提取试剂盒(TaKaRa), 提取样品总RNA。用核酸仪对提取的总RNA浓度和纯度进行检测。cDNA合成参照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒(TaKaRa)说明书完成。

1.4 BcPR5的cDNA克隆和序列分析

以霜霉病菌诱导后24 h的不结球白菜‘苏州青’叶片为试材, 使用3′/5′RACE System试剂盒(Invitrogen)克隆基因全长cDNA序列。具体操作过程参考陈晓峰[15]的方法。克隆BcPR5基因的引物见表 1, 引物设计用Primer Express 2.0软件, 引物由上海英骏生物技术有限公司合成。氨基酸序列结构特征分析在线完成(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; http://www.expasy.ch), 多序列比对采用DNAMAN 5.2软件完成。

表 1 本研究所用引物信息 Table 1 Primers used in this study
引物名称Primer name 引物序列Primer sequence 作用Function
AP 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17-3′ 接头引物
AAP 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′ Adaptor primers
AUAP 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′
BcPR5_3′RACE_F1 5′-GCTCAAAGGTAGAGGACA-3′ 3′RACE引物
BcPR5_3′RACE_F2 5′-CTTATTCTTATGCTTACG-3′ 3′RACE primers
BcPR5_5′RACE_R1 5′-GGGCAAAAGGTGACGATGTAGT-3′ 5′RACE引物
BcPR5_5′RACE_R2 5′-CTCTACCTTTGAGCGGCATTAT-3′ 5′RACE primers
BcPR5_RT_F 5′-CACGCAACGGGAAACGGGT-3′ 实时定量PCR检测和Southern blot
BcPR5_RT_R 5′-GCGATGGTGAGGGCAAAAG-3′ RT-qPCR and Southern blot
β-actin _F 5′-ATCAACTACCAGCCTCCAAC-3′ 内标基因
β-actin_R 5′-CTGCTGTGTTGTTGCTGATC-3′ Reference gene
BcPR5_Up 5′-AATCCATGGATGGCTTCACGAAACC-3′ 原核表达
BcPR5_Down 5′-CGCGAGCTCTCATTTACAGGTG-3′ Prokaryotic expressive
注:下划线为NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点序列; 酶切位点之前碱基为保护碱基。
Note:Underlined sites are the sequence of NcoⅠand BamHⅠ. The front bases of the restriction site are protective bases.
1.5 RT-qPCR分析BcPR5转录表达水平

cDNA的合成参照PrimeScriptTM RT试剂盒(TaKaRa)说明书。PCR程序采用两步法:95 ℃ 30 s; 94 ℃ 5 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s, 40个循环; 设置60~95 ℃的熔解曲线。3次重复, 用ddH2O作为对照。试验数据采用ΔΔCT方法[18]和Excel 2010软件分析。

1.6 原核表达

将克隆的BcPR5基因连接至pMD19-T载体, 再转化DH5α感受态细胞, 获得重组质粒pMD19-T-BcPR5。用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切及菌液PCR鉴定后, 含阳性重组质粒的菌液送上海英骏生物技术有限公司测序。以测序正确的重组质粒作为模板, 用上游引物BcPR5_Up和下游引物BcPR5_Down扩增BcPR5基因编码区(表 1)。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 割胶回收后用限制性内切酶NcoⅠ和BamHⅠ双酶切, 构建重组表达质粒pET29a-BcPR5, 转化大肠杆菌BL21(DE3)。挑取阳性菌落接种至5 mL LB液体培养基中(含200 μg·mL-1氨苄青霉素), 37 ℃振荡培养过夜, 以此作为种子液。取种子液用终浓度为0.6、0.8和1.0 mmol·L-1的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导BL21(DE3)表达融合蛋白, 设置取样时间为2、4、6和8 h。取菌液3 mL, 10 000 r·min-1离心30 s, 弃上清液, 用100 μL的1×SDS-PAGE加样缓冲液重悬菌体, 上清液参照文献[19]的方法进行SDS-PAGE分析。

2 结果与分析 2.1 不结球白菜BcPR5基因cDNA全长克隆以及序列分析

采用cDNA-AFLP方法从不结球白菜中获得霜霉病菌诱导的差异表达片段(397 bp), 以其为探针, 其与病程相关蛋白PR5基因的同源性最高达98%。采用RACE技术获得其全长, 命名为BcPR5(登录号为FJ605478)。该基因cDNA序列全长为954 bp, 含有732 bp的完整开放阅读框, 编码243个氨基酸(图 2)。BcPR5编码蛋白分子质量为26.1×103, 理论等电点是9.3。该基因在起始密码子ATG之前有A, 符合Kozak规律; 在3′端有poly(A)尾, 这些都符合有效翻译的基因全长cDNA的特征。SignalP 3.0 Server软件分析发现, N端信号肽由前22个氨基酸组成, 最有可能的切割位点在20~22(ASA)。该基因类甜蛋白保守结构域在第23~239个氨基酸处, C-端缺乏1个肽键, 说明其可能是1个分泌蛋白。

图 2 BcPR5核苷酸序列(上)及其翻译的氨基酸序列(下) Figure 2 The nucleotide(upper row)and amino(lower row)acid sequence of BcPR5 方框表示起始密码子, 虚线表示N端信号区, 灰色区域表示推断的多聚腺苷酸信号元件, 下划线表示Thaumatin family(THN)结构域, *表示终止密码子。 Square frame indicates the translation initiation codon, dotted line indicates the N-terminal signal sequence, gray area indicates the putative polyadenylation signals, underline indicates the amino acid sequence of the thaumatin family(THN), an asterisk(*)indicates the stop codon.

BcPR5编码的氨基酸序列及从GenBank中BLAST获取的其他植物PR5氨基酸序列(编码区)进行系统树分析, 结果(图 3)显示, 不结球白菜BcPR5与大白菜第7号染色体的基因(Bra015980)的同源性为100%, 与大白菜6号染色体基因(Bra025923)为98%, 其他双子叶植物小花南芥和亚麻荠同源性为87%。

图 3 不同植物病程相关蛋白的系统树分析 Figure 3 Phylogenetic tree analysis of pathogenesis-related proteins from different plants
2.2 霜霉病菌和非生物胁迫下不结球白菜BcPR5的表达分析

图 4可见:霜霉病菌和非生物胁迫处理均能诱导不结球白菜BcPR5基因的表达, 其表达量在抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’中均呈先升高后降低的趋势, 且抗病品种整体上高于感病品种。霜霉病菌侵染处理下, ‘苏州青’中BcPR5基因的表达量于24 h达到峰值, 而在‘矮脚黄’中其表达量于48 h达到峰值, 且在12~96 h时2个品种的表达量均差异极显著(P < 0.01)。在SA处理下, ‘苏州青’中的BcPR5基因表达量于48 h达到峰值, 而在MeJ和ABA处理下, ‘苏州青’中其表达量于24 h达到峰值, 且在‘矮脚黄’中的表达趋势与之相似。表明BcPR5基因在不结球白菜受霜霉病菌和外源激素的干扰后参与了防卫反应, 而且在抗病系植株上比感病系植株上表达更早、表达量更强。

图 4 不同处理对不结球白菜BcPR5基因表达量的影响 Figure 4 Effect of different treatments on the relative expression level of BcPR5 gene in non-heading Chinese cabbage *P < 0.05, **P < 0.01.
2.3 BcPR5基因的原核表达分析

BcPR5进行原核表达分析, 发现在37 ℃条件下, 0.6和0.8 mmol·L-1 IPTG诱导2、4、6和8 h后, 均没有融合蛋白表达。而1.0 mmol·L-1 IPTG诱导4 h后出现明显的表达特异条带, 随着诱导时间的延长, 表达量有所降低(图 5)。BcPR5E.coli BL21(DE3)中获得了表达, 表达蛋白质的相对分子质量约为26×103

图 5 BcPR5基因原核表达SDS-PAGE电泳 Figure 5 SDS-PAGE electrophoresis of the prokaryotic expression of BcPR5 gene 箭头表示目的蛋白。The arrowhead represents the target protein.
3 讨论与结论

病程相关蛋白(PR)基因的表达受病原菌侵染、生物激发子处理、植物激素等多种环境因素的诱导[20]。本研究通过cDNA-AFLP技术获得1个差异表达片段(397 bp), 在此基础上, 利用RACE技术克隆了BcPR5基因的全长序列。通过核苷酸和氨基酸序列分析, 发现BcPR5与其他植物的类甜蛋白保守结构域具有较高的同源性。对拟南芥的研究表明, Thaumatin-like proteins是1个酸性蛋白, 等电点为4.5[21-22], 但在不结球白菜中BcPR5等电点为9.3, 是1个相对分子质量约为26.1×103的碱性蛋白。

Egea等[23]研究黄瓜花叶病毒(CMV)接种辣椒抗病系‘Americano’和感病系‘Smith25’, 检测了PR5的家族基因几丁酶(PR3PR8PR11)和葡聚糖酶(PR2)的诱导表达特征, 认为葡聚糖酶参与了抗病系‘Americano’对CMV的抗性机制, 而几丁酶在2个品系中没有表达差异。不结球白菜抗病系‘苏州青’的BcPR1—BcPR4均受到霜霉病的诱导表达[13-15]。本研究结果表明, 不论在抗病系‘苏州青’还是感病系‘矮脚黄’上BcPR5均受到霜霉病菌的诱导, 且抗病系比感病系的表达量更早、更强。说明BcPR5的诱导与基因型的抗病或感病能力有一定的联系。在拟南芥中, SA、MeJ和ABA都是诱导病程相关蛋白基因表达和防卫反应基因表达的信号分子[6, 24]。且PR5在拟南芥中对病原菌的抗病性, 是通过SA信号途径传递完成的[25]。本研究在不结球白菜抗病系‘苏州青’和感病系‘矮脚黄’上, 外施SA、MeJ和ABA, BcPR5表达量出现了不同时间的诱导高峰。表明BcPR5涉及的防卫反应可能是在不同时间段, 通过产生不同的信号途径对病原菌的侵染发挥作用。

目前已发现了许多不同分子质量大小的PR5蛋白, 本研究发现不结球白菜BcPR5的结构序列具有其他PR5蛋白的典型特征[20-24]。另外, BcPR5原核表达分析发现, 在37 ℃、1.0 mmol·L-1 IPTG诱导4 h后, 检测到1条蛋白分子质量约为26×103的表达特异条带, 其与预期融合蛋白的相对分子质量的理论值26.1×103相符。而含有转化子但未经诱导的菌体在该蛋白条带处未出现此条带, 因此可以基本确定这一蛋白条带为表达的融合蛋白。

综上所述, 不结球白菜BcPR5基因受霜霉病菌和外源激素SA、MeJ和ABA诱导表达, 表明BcPR5基因在防御霜霉病菌侵染途径中发挥着一定的作用, 且BcPR5在大肠杆菌中成功实现融合表达, 这为下一步蛋白水平研究和转基因功能研究提供了条件。

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