文章信息
- 逯朋朋, 张越, 钟孝俊, 姚火春
- LU Pengpeng, ZHANG Yue, ZHONG Xiaojun, YAO Huochun
- 荚膜聚合酶Wzy对猪链球菌Chz型致病力的影响
- Oligosaccharide repeat unit polymerase Wzy affects the pathogenicity in Streptococcus suis serotype Chz
- 南京农业大学学报, 2018, 41(3): 489-495
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(3): 489-495.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201802009
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文章历史
- 收稿日期: 2018-02-04
猪链球菌(Streptococcus suis)是一种人畜共患病病原菌, 可引起猪发病, 主要临床症状为急性败血症、心内膜炎以及典型的脑膜炎等; 也可造成人类感染, 导致中毒性休克综合征(TSS)或者细菌性脑炎[1-2]。1998年, 江苏爆发的猪链球菌病导致数万头生猪发病死亡, 并造成231人感染, 其中52人死亡[3-4]。按照传统的细菌表面荚膜抗原的血清学分类方法, 猪链球菌被分成33个参考血清型、21个新血清型(NCL1—NCL20和Chz)及未定血清型[5-7]。南京农业大学世界动物卫生组织猪链球菌病参考实验室于2013年在断乳后仔猪脑部中分离到一株强致病菌株CZ130302, 定为猪链球菌新血清型Chz, 该菌株可引起猪头部震颤、共济失调、转圈等典型脑膜炎神经症状和极高的致死率。剖检病猪脑部有明显的出血和水肿。
猪链球菌致病机制研究是疾病防控的重点, 已知的致病力因子包括荚膜、胞外因子、纤连蛋白结合蛋白、溶血素, 以及二元调控系统等。荚膜(capsular polysaccharides, CPS)是细菌细胞外壁的一层黏液性结构, 在细菌生存和感染过程中发挥重要作用, 其化学组成主要是多糖, 部分含有多肽[8]。Smith等[9]研究了猪链球菌2型CPS合成相关基因簇, 发现该基因簇拥有25个开放阅读框, 依次为ORF2Z、ORF2Y、ORF2X及Cps2A—Cps2V。van Calsteren等[10-11]分离纯化猪链球菌CPS并解析出其分子式, 推测有7种酶参与CPS合成反应的关键作用位点。但是, 目前对于猪链球菌CPS的认知仍然有限。
对猪链球菌Chz型野生菌株CZ130302进行基因组分析, 我们发现其编码完整的荚膜合成基因簇, 主要依赖于Wzx/Wzy转运途径进行荚膜合成, 但在基因同源性上与已知血清型存在较大差异[5]。其中chzM(wzy)基因具有型特异性, 编码荚膜聚合酶Wzy。cpsA、cpsB、cpsC、cpsD为高度保守基因, cpsB缺失株不产生荚膜[12]。为探究特异性荚膜聚合酶Wzy对猪链球菌Chz型荚膜合成及致病力的影响, 本试验以荚膜合成保守基因chzB(cpsB)为对照, 分别构建基因缺失株Δwzy和ΔcpsB, 从生物学功能和致病特性两方面比较其与野生株CZ130302的差别, 为阐明猪链球菌Chz型菌株的致病机制提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 菌株及细胞试验菌株:猪链球菌Chz型野生菌株CZ130302, 分离自江苏省常州市某猪场, 由本实验室保存。wzy基因缺失株(Δwzy)和cpsB基因缺失株(ΔcpsB)为笔者构建(另文发表)。
试验细胞:小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3);小鼠肺巨噬细胞(RAW264.7)。
1.2 培养基及试验动物THB液体培养基和THB固体培养基(含5%绵羊血); A培养基(10 g·L-1葡萄糖、20 g·L-1蛋白胨、3 g·L-1 K2HPO4、2 g·L-1 KH2PO4·12H2O、0.1 g·L-1 MgSO4·7H2O、0.02 g·L-1MnSO4·6H2O和5 g·L-1 NaCl); 1640细胞营养液(含10%胎牛血清)。BALB/c小鼠(5~6周龄, 雌性, 扬州大学比较医学中心)。
1.3 试剂及仪器THB培养基购于美国Becton & Dickinson公司; 荚膜保护液(15 g·L-1葡萄糖, 含体积分数为10%无菌灭活兔血清)由笔者所在实验室配制; PCR高保真Mix、DNA片段回收试剂盒和胶回收试剂盒购于大连TaKaRa生物工程公司; PCR仪购于美国BIO-RAD公司; 生物样品均质仪购于杭州奥盛仪器有限公司。
1.4 荚膜合成基因簇比对和聚合酶Wzy进化树分析通过ACT基因组可视化软件对荚膜合成基因簇进行注释比对分析[13]。使用MEGA 7.0软件构建邻位相连法(NJ)系统进化树[14]。
1.5 细菌形态学观察使用接种环将CZ130302和Δwzy菌液划线于含5%绵羊血的THB平板上, 37 ℃、5% CO2条件下过夜培养, 次日观察细菌菌落形态和溶血性。
将菌株CZ130302和Δwzy培养至细菌生长对数期, 取适量菌液(约10 μL)均匀涂布于载玻片, 干燥固定之后进行革兰氏染色, 并用光学显微镜观察菌体形态。
1.6 生长曲线测定将菌株CZ130302和Δwzy过夜培养物稀释至约0.6×108 CFU·mL-1, 并以1:100的比例接种于含50 mL THB培养基的锥形瓶中, 在恒温摇床中(37 ℃, 160 r·min-1)振荡培养。每隔1 h测定培养液的吸光值(D600)。每次测定前, 以新鲜的培养液为空白对照。以培养时间(h)为横坐标, 以D600值为纵坐标, 绘制菌株CZ130302和Δwzy的生长曲线。以上菌株重复3管, 重复3次取平均值。
1.7 透射电子显微镜观察细菌荚膜将5 mL细菌重悬液经腹腔攻毒BALB/c小鼠; 小鼠濒死时, 注射1 mL荚膜保护液, 温柔按压腹部10 min后, 用无菌注射器抽取腹腔液。一半腹腔液低温保存, 另一半涂布血平板。次日, 用PBS洗脱单菌落, 将细菌悬液和腹腔液同时攻毒小鼠。细菌攻毒小鼠后经多次分离得到CZ130302和Δwzy菌体, 并用2.5%戊二醛溶液固定24 h后[15], 将样品送至南京军区总医院病理科电镜室进行后续处理。得到的超薄切片用JEOL JEM-1011型透射电子显微镜(日本电子株式会社)观察, Gatan 830型CCD数字成像系统(美国Gatan公司)拍照记录, 使用Image J软件测量细菌荚膜厚度。
1.8 生物被膜试验将菌株CZ130302和Δwzy培养至对数期, 取2 μL菌液以1:100的比例接种于含有A培养基的96孔平底培养板中, 每个细菌16个孔, 37 ℃静置培养72 h后取出, 用PBS洗涤3次。待风干后用0.1%结晶紫液200 μL染色生物被膜15 min。用PBS溶液清洗3次, 将96孔板置于70 ℃烘箱烘干后, 每孔加入200 μL乙醇孵育20 min, 测定595 nm处的吸光值(D595)[16]。以仅含培养基的16个孔为空白组。每个菌株重复3次并取平均值。
1.9 细胞试验细胞侵袭试验:bEnd.3细胞(每孔约105个)用细胞营养液洗涤3次; 将1 mL菌液(1×107 CFU·mL-1)加入24孔细胞板各孔中(感染指数MOI=100, 即细菌数与细胞数的比例为100:1)。细胞板800 g室温下离心15 min, 放入37 ℃培养箱孵育2 h后取出, 用1 mL PBS洗涤5次, 加入500 μL细胞营养液(含100 μg·mL-1溶菌酶和1 μg·mL-1万古霉素), 置于37 ℃孵育2 h。向每孔加入1 mL去离子水裂解细胞, 吸取40 μL细胞裂解液, 5倍比稀释后涂布THA培养基, 37 ℃过夜培养, 次日进行平板活菌计数, 即为侵袭的细菌数。试验结果以相对侵袭率表示, 相对侵袭率=侵袭的缺失株细菌数/侵袭的野生株细菌数×100%。
细胞黏附试验:方法与细胞侵袭试验类似, 细菌与细胞作用后, 用PBS漂洗5次并用去离子水裂解细胞。将细胞裂解液稀释后涂布THA培养基, 计算单菌落数量, 即为侵袭和黏附的细菌总数。黏附的细菌量等于侵袭和黏附的细菌总数减去侵袭的细菌数。试验结果以相对黏附率表示, 相对黏附率=黏附的缺失株细菌数/黏附的野生株细菌数×100%。
抗吞噬试验:将细胞培养液孔内的单层RAW264.7细胞用细胞营养液洗涤3次, 加入含有细菌(4×107 CFU·mL-1)的细胞营养液, 每孔500 μL, 使得MOI为100。将细胞板于800 g室温下离心15 min后, 置于细胞培养箱中共孵育2 h。PBS洗3次后加入500 μL细胞营养液。继续孵育2 h, PBS洗5~7次后每孔加入1 mL去离子水裂解细胞, 将细胞裂解液稀释后涂布THA培养基, 37 ℃培养过夜, 次日进行平板活菌计数, 计算细胞吞噬率。相对吞噬率=吞噬的缺失株细菌数/吞噬的野生株细菌数×100%。
1.10 BALB/c小鼠攻毒试验存活曲线:将40只BALB/c小鼠正常饲养1周确定健康后进行试验。细菌培养至生长对数期, PBS洗涤3次, 将细菌浓度调整至4×107 CFU·mL-1。小鼠随机分成3组, 试验组和空白组各有10只; 将CZ130302和Δwzy细菌悬液以及PBS分别腹腔注射小鼠, 每只0.5 mL。攻毒后正常饲喂, 连续1周早、晚各1次, 观察小鼠神经症状及死亡情况。
半数致死量(LD50):CZ130302和Δwzy细菌生长到对数期, 收集菌体, PBS洗涤3次, 并将浓度稀释为5.0×106~5.0×109 CFU·mL-1。BALB/c小鼠随机分为2组, 每组40只, 10只小鼠腹腔注射一定浓度的菌液, 每只0.2 mL。另外10只小鼠作为对照组, 腹腔注射等量PBS溶液。攻毒后正常饲喂小鼠, 连续1周早、晚各1次, 观察小鼠临床症状及死亡情况。以Reed-Muench法计算半数致死量。
小鼠血液和组织脏器活菌载量测定:将BALB/c小鼠分成3组, 空白组9只, 试验组各9只。试验组每只小鼠腹腔注射2×107 CFU的细菌悬液; 空白组小鼠注射等量无菌PBS。将剩余的细菌悬液倍比稀释, 进行平板记数, 以确定实际注射细菌量。分别于感染后5、10和15 h从各组取3只小鼠分别处死, 剖解, 采取小鼠肺脏、肾脏和脑组织称质量, 然后加入PBS匀浆; 同时眼眶采血取0.5 mL血液, 稀释后按10-2、10-3、10-4和10-5稀释度涂血平板。将平板倒置于37 ℃培养后进行平板活菌计数。各组织脏器中的活菌载量以CFU·g-1表示, 血液中的活菌载量以CFU·mL-1表示。
1.11 数据处理与分析采用Graph Pad Prism 5.0软件对数据进行整理, 再用Mann Whitney测试法进行统计分析。
2 结果与分析 2.1 荚膜合成基因簇比对结果CZ130302荚膜合成基因簇与猪链球菌其他血清型的比较结果(图 1-A)显示:1, 1/2和2血清型荚膜基因序列同源性较高, 其他血清型差异较大。chzA—chzD(cpsA—cpsD)基因为荚膜合成的保守基因, 存在于所有的猪链球菌中; chzJ—chzP基因的序列同源性非常低, 有典型的型特异性。其中, chzM(wzy)基因编码荚膜合成聚合酶, 并被选作检测猪链球菌Chz型的特异性序列区间。进化分析表明, 蛋白ChzM更接近serotype NCL-9的Wzy(图 1-B)。
2.2 荚膜聚合酶Wzy对细菌菌落、菌体形态及细菌生长特性的影响CZ130302和Δwzy的细菌菌落形态和革兰染色无明显差异。两者菌落皆为表面光滑、湿润、灰白色半透明的β溶血, 而镜检均为革兰阳性菌, 呈短链状分布(图 2-A和B)。相同培养条件下绘制CZ130302和Δwzy的生长曲线, 可以发现两者生长速度基本相同, 接种后约4 h进入细菌生长对数期; 培养9 h后进入细菌生长稳定期, 并无显著差异。因此, wzy基因敲除并未影响CZ130302的生长(图 2-C)。
2.3 荚膜聚合酶Wzy对细菌荚膜形成的影响为了进一步确定wzy基因缺失对细菌荚膜形成的影响, 选取生长对数期的野生菌株CZ130302、缺失株ΔcpsB和Δwzy进行透射电子显微镜观察。结果显示野生株表面形成散在疏松的荚膜, 而缺失株ΔcpsB和Δwzy表面荚膜结构明显减少, 说明猪链球菌Chz型野生菌株CZ130302荚膜聚合酶Wzy的缺失导致荚膜多糖合成障碍(图 3)。
2.4 荚膜聚合酶Wzy对细菌生物被膜形成能力的影响从图 4可以看出:CZ130302株的D595值极显著大于对照组D595值, 表明野生菌株CZ130302有较强的生物被膜形成能力。同时荚膜缺失株Δwzy的D595值约为野生株的2倍, 表明荚膜缺失之后, 生物被膜的形成能力极显著增加(P < 0.001)。
2.5 荚膜聚合酶Wzy对细菌黏附、侵袭和抗吞噬能力的影响细胞黏附和侵袭试验结果表明(图 5):缺失株Δwzy对bEnd.3细胞的相对黏附率为150%;对bEnd.3细胞的相对侵袭率为126%。说明缺失株对微血管内皮细胞的黏附能力显著增强, 同时对微血管内皮细胞侵袭能力也显著增强。可见wzy基因缺失对细菌的黏附与侵袭能力产生一定的影响。细胞吞噬试验结果表明, wzy基因缺失后, RAW264.7细胞对缺失株的相对吞噬率为156%, 即wzy基因缺失株的抗吞噬能力显著下降, 更容易被吞噬细胞所吞噬。
2.6 荚膜聚合酶Wzy对细菌致病力的影响小鼠存活率试验结果(图 6-A)显示:攻毒后24~48 h内, 野生菌株试验组出现典型神经症状和严重结膜炎, 10只小鼠均出现上述症状, 死亡4只; 72 h内, 野生菌株试验组死亡7只小鼠, 而缺失株试验组小鼠动作活跃; 5 d内, 野生菌株试验组小鼠全部死亡, 而缺失株试验组仅死亡2只。缺失株试验组的小鼠存活率为80%, 野生菌株试验组的小鼠存活率为0。初步证明wzy基因缺失后, 细菌致病力极显著下降。
LD50测定结果(图 6-D)显示:野生菌株CZ130302对BALB/c小鼠的LD50为2.06×106 CFU·只-1; 缺失株Δwzy对BALB/c小鼠的LD50为2.05×107CFU·只-1。这些说明Δwzy株的致病力较野生菌株显著下降。
小鼠感染细菌后12 h血液和组织脏器活菌载量结果(图 6-B、C、E、F)显示:野生株CZ130302在3种脏器和血液中活菌量都达到107 CFU·g-1或107 CFU·mL-1, 而缺失株Δwzy在血液中的活菌量极显著下降(P < 0.01), 表明wzy基因缺失之后, 细菌更容易被血液中的巨噬细胞吞噬, 进而被清除; 缺失株Δwzy在脑和肺中活菌量均显著下降(P < 0.05), 说明缺失株更易被血脑屏障阻隔, 不易到达脑, 同时不易转移扩散至肺; 缺失株Δwzy在肾脏中活菌量仅下降了1个数量级, 说明wzy基因缺失之后肾脏仍然是CZ130302主要的靶向器官。
3 讨论由于细菌荚膜多糖的差异, 猪链球菌表面存在大量的变异抗原[17]。荚膜基因簇的进化过程非常复杂(基因捕获、丢失和基因重排), 造成了基因簇序列的多样性[18]。荚膜聚合酶Wzy作为一种重要的膜整合蛋白, 在不同猪链球菌血清型中有很低的氨基酸同源性[19]。猪链球菌Chz型聚合酶Wzy变异较大, 因此构建wzy基因缺失株来探究其对荚膜合成及细菌致病力的作用。
本试验中生长曲线和菌体形态试验显示, wzy基因的缺失对细菌的生长无明显影响。透射电子显微镜观察显示缺失株表面未见疏松散在的荚膜样结构, 提示猪链球菌Chz型荚膜聚合酶Wzy的缺失导致荚膜多糖合成障碍。由于荚膜多糖是亲水性分子, 荚膜合成受阻增加菌体疏水性及沉降速度, 可能会使生物被膜的形成能力增加[20]。另有研究表明, 脑膜炎奈瑟氏菌[21]和大肠杆菌[22]的荚膜多糖阻碍生物被膜形成, 一些致病菌造成感染, 可能借助荚膜多糖的调节, 可以使细菌处于更利于形成生物被膜的无荚膜状态或者荚膜低包裹状态。处于生物被膜态的细菌可能缓慢生长或者不生长, 而当机体免疫力下降时, 生物被膜中存活的细菌被释放, 重新引起感染。本试验中, wzy基因缺失株生物被膜形成能力较野生菌株显著增强, 提示猪链球菌可通过调控荚膜多糖的合成水平改变细菌生物被膜形成能力去适应微环境, 这对细菌的生存和致病作用是非常关键的。
猪链球菌致病的第一步就是黏膜定殖, 而黏附侵入在这一步中发挥重要作用。Benga等[23]也发现猪链球菌在黏附侵袭过程中, 荚膜基因簇往往被下调表达。在本试验中, Δwzy菌株具有更强的微血管内皮细胞黏附和侵袭能力, 暗示荚膜并不参与细菌的细胞黏附和侵袭过程。此外, 猪链球菌在血液中存活和传播的前提是能够抵抗先天免疫系统的吞噬与杀伤。对肺炎链球菌的研究证实, 荚膜多糖可降低菌体与宿主细胞的亲和力, 可有效保护细菌免于宿主吞噬细胞的吞噬作用和补体介导的杀伤作用[24]。本试验中, 使用RAW264.7细胞检测缺失株Δwzy与野生株CZ130302的抗吞噬能力。吞噬率比较分析表明, RAW264.7细胞对缺失株的吞噬率显著高于野生株, 这一结果与肺炎链球菌一致, 荚膜多糖对于猪链球菌Chz型的抗吞噬能力具有重要作用。BALB/c小鼠动物模型中进一步印证了wzy基因在猪链球菌Chz型菌株入侵宿主并引起系统感染的过程中起到重要作用。wzy基因缺失之后, 菌株不能在宿主的血液和组织中内大量存活从而引起发病。综上所述, 猪链球菌Chz型的荚膜聚合酶Wzy不仅涉及细菌的荚膜合成和生物被膜形成, 同时也影响细菌对宿主细胞的黏附, 抵抗吞噬细胞的吞噬作用, 从而参与细菌的宿主感染过程。
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