南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (3): 429-439   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201706045
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崔梦杰, 王晨, 冷翔鹏, 吴伟民, 汤崴, 张文颖, 朱旭东, 贾海锋, 沈文飚, 房经贵
CUI Mengjie, WANG Chen, LENG Xiangpeng, WU Weimin, TANG Wei, ZHANG Wenying, ZHU Xudong, JIA Haifeng, SHEN Wenbiao, FANG Jinggui
葡萄SBP-box转录因子家族的生物信息学分析及其应答激素调控葡萄果实成熟的作用
Bioinformatic analysis of the SBP-box transcription factor and function of their regulation modes on berry ripening process by responding to hormones
南京农业大学学报, 2018, 41(3): 429-439
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(3): 429-439.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201706045

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收稿日期: 2017-06-29
葡萄SBP-box转录因子家族的生物信息学分析及其应答激素调控葡萄果实成熟的作用
崔梦杰1 , 王晨1 , 冷翔鹏1 , 吴伟民2 , 汤崴1 , 张文颖1 , 朱旭东1 , 贾海锋1 , 沈文飚3 , 房经贵1     
1. 南京农业大学园艺学院, 江苏 南京 210095;
2. 江苏省农业科学院, 江苏 南京 210014;
3. 南京农业大学生命科学学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在分析已知葡萄(Vitis vinifera L.)SBP-box家族基因基本信息,研究其在葡萄果实发育成熟过程中的调控作用。[方法]利用葡萄转录因子PlantTF数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Vvi)查询并获得SBP-box基因,采用ClustalX 2、DNAMAN 6、Web Logo 3、MEGA 4.1和Gene Structure Display Server等软件对其基因与蛋白序列进行生物信息学分析。利用Plantcare软件分析葡萄转录因子SBP-box家族成员的启动子元件,预测其与果实发育及成熟过程相关的潜在作用。采用RT-qPCR技术研究VvSBP基因在果实发育成熟过程中的作用。[结果]从转录因子数据库中共得到19个葡萄SBP-box基因。SBP-box结构域分析显示,多达61个位点氨基酸具有较高的保守性。进化树分析结果显示,葡萄SBP-box基因共分为3个亚组。染色体定位分析显示,VvSBP基因在1号染色体上分布最多(4个),其次是染色体5、15、4、7、8、10、11、12、14、17、18和19,染色体2、3、6、9、13和16则没有分布。启动子作用元件分析表明,SBP-box家族所有成员的启动子均含有与果实发育和成熟相关的作用元件。结合RT-qPCR结果,发现约9个成员可能促进了葡萄果实的成熟过程,且大部分成员属于第1亚组和第3亚组;约7个成员可能促进了葡萄果实的生长发育,但抑制了果实的转色与成熟过程,且大部分成员属于第2亚组。[结论]葡萄SBP-box基因结构高度保守,多数成员参与调控果实发育与成熟过程。
关键词葡萄   SBP-box   转录因子   生物信息学分析   表达分析   
Bioinformatic analysis of the SBP-box transcription factor and function of their regulation modes on berry ripening process by responding to hormones
CUI Mengjie1, WANG Chen1 , LENG Xiangpeng1, WU Weimin2, TANG Wei1, ZHANG Wenying1, ZHU Xudong1, JIA Haifeng1, SHEN Wenbiao3, FANG Jinggui1    
1. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
3. College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The aim of this paper is to analyze the basic information of SBP-box genes of grape(Vitis vinifera L.), and study their regulation function on berry ripening process. [Methods] SBP-box famiby genes in transcription factor database PlantTF(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Vvi) were queried and obtained, and the amino acid sequences were analyzed with ClustalX 2, DNAMAN 6, Web Logo 3, MEGA 4.1 and Gene Structure Display Server bioinformatics softwares. The potential function of SBP-box transcription factor members in grape development and maturation process was predicted by analyzing their promoter motif elements using the Plantcare software. And the regulation function on berry ripening process was studied by RT-qPCR. [Results] Totally 19 SBP-box genes were found in transcription factor database. The results of domain analysis indicated that 48 amino acids of grape SBP-box domain were highly conserved(except for VvSBP-like1 and VvSBP-like2). The results of phylogenetic tree revealed that grape SBP-box genes were divided into 3 subclasses. Chromosome mapping analysis showed that the largest number of grape SBP-box genes were found on chromosome 1(four genes), followed by chromosome 5, 15, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 17, 18 and 19, and no SBP-box genes on chromosome 2, 3, 6, 9, 13 and 16. All SBP-box members contained elements related to grape berry development and ripening. RT-qPCR results indicated that nine members, the first and second subclass, probably promote berry ripening process, and nearly seven members, the second subclass, promote the growth and development of grape berry but inhibit the berry ripening process. [Conclusions] VvSBP genes are highly and structurally conserved and most members participated in regulating berry development and ripening process.
Key words: grape(Vitis vinifera L.)    SBP-box    transcription factor    bioinformatic analysis    expression analysis   

葡萄(Vitis vinifera L.)是世界四大水果之一, 其栽培面积和产量位居世界第二[1], 是我国主要栽培果树。葡萄果实发育与成熟是果树生长发育的重要阶段, 是果实品质形成的生物学基础。所以, 利用分子生物学手段改善和改良葡萄外在和内在品质应该是今后的重点发展趋势。SBP-box是植物特有的调控生长发育的重要转录因子家族, 它最早是从金鱼草(Antirrhinum majus)花序cDNA文库中筛选到的, 因其能够识别并结合到SQUAMOSA(SQ-UA)的启动子上而得名[2-3]。SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是类似SBP-box的一类转录因子的总称。SPL基因编码了一个高度保守的SPL区, 该区域含有约80个氨基酸残基, 包括2个锌指结构和1个核定位信号, 2个锌指结构域Zn2+的顺序结合模式, Zn2+和核定位信号在蛋白与DNA结合过程中是必需的[4]。研究表明SBP-box转录因子在植物中广泛存在, 且在植物生长发育的多个方面起着重要作用[5-8]。据报道, SBP-box转录因子在植物花的形成及后期发育, 植物的育性, 营养生长向生殖生长的转型, 叶的形态建成, 环境信号应答等方面均发挥重要作用[7-8]。目前, 模式植物中已鉴定出大量的SBP-box家族成员, 但不同物种间家族成员的数量与功能存在重要差异, 且该类转录因子的研究主要集中在花器官形成与开花时间的发育调控方面。相比之下, 葡萄方面相关研究很少, 有关SBP-box调控葡萄果实成熟的研究更无报道。本研究对葡萄SBP-box基因进行系统分类并分析其在果实发育过程中的表达情况及其应答激素的模式, 旨在从转录因子角度认识葡萄果实成熟发育过程, 也为开展葡萄果实发育与成熟过程的分子调控提供一定的理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验处理及指标测定

试验于2016年5月31日—2016年9月4日在江苏省农博园葡萄园内进行。园区位于句容市, 属于亚热带季风气候, 年均气温15.4 ℃, 年降雨量1 150 mm。供试材料为5年生、欧亚种葡萄'魏可'(Muscat Bailey A×Rubel Muscat X), 株距为1.0 m, 行距为2.5 m, 双十字V型架, 避雨栽培。

选取生长势、负载量较为一致的'魏可'葡萄, 根据前人研究[9-11]和预试验结果, 用100 mg · L-1脱落酸(ABA)和200 mg · L-1萘乙酸(NAA)水溶液进行处理, 以清水处理作为对照。每个处理选定6株长势较为一致的植株, 每2株为1个重复, 共设3次重复。于果实转色前1周(7月28日)进行喷施果穗处理, 从上午08:00开始, 每小时喷施1次, 共喷施3次, 每次均喷施果穗至完全淋湿状态。

于葡萄幼果期(花后3 d, 5月31日)、第1次果实膨大期(花后13 d, 6月10日)、硬核期(花后37 d, 7月4日)、果皮褪绿期(花后47 d, 7月14日)、转色前1周(花后61 d, 7月28日)、转色初期(花后69 d, 8月5日)、转色中期(花后84 d, 8月20日)和完熟期(花后99 d, 9月4日)进行取样, 分别从对照与处理的植株中随机选择4果穗, 每穗上、中、下3个部位随机采取3个果粒。样品采集后立即投入液氮中速冻后带回实验室于-70 ℃冰箱中保存备用。

1.2 葡萄SBP-box基因在果实发育过程中的表达

采用CTAB方法[12]提取葡萄果实8个发育时期样品, 以及ABA和NAA处理及对照果实样品的总RNA。cDNA的合成以提取的果实总RNA为模板, 参考Prime ScriptTM RT-PCR试剂盒(TaKaRa)说明书进行反转录。采用葡萄VvActin(登录号:XM_002273532)作为内参基因。从葡萄转录因子数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Vvi)下载葡萄的19个SBP-box家族成员的基因序列, 通过NCBI中Nucleotide Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)找到每个基因对应的功能, 并对其编号为VvSBP1~19。根据定量PCR引物的设计原则, 利用Primer3 Input(http://primer3.ut.ee/), 对上述家族成员设计定量PCR引物(表 1)。按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(宝生物工程有限公司)操作指导, 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法, 检测基因的相对表达量。扩增体系20 μL:1 μL cDNA, 上、下游引物各0.4 μL, 10 μL 2×TransStart® Tip Green qPCR SuperMix, 8.2 μL ddH2O。反应程序为:94 ℃ 30 s; 94 ℃ 5 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s, 40个循环。试验3次重复。反应结束后分析荧光值变化曲线以及熔解曲线[13-14]。试验数据用ΔΔCT[15]分析, 采用Excel 2013软件绘图。

表 1 引物序列 Table 1 Primers of sequences
基因名称Gene name 引物对序列(5′→3′) Primer pairs sequence
VvSBP1-like1 CCTTGCTGGGAAAGTCGAAC/TTGGGATGCACGTTGGAAAG
VvSBP1-like2 CCTTGCTGGGAAAGTCGAAC/TTGGGATGCACGTTGGAAAG
VvSBP1-like3 TGCACTGCTGATCTCACTGA/TCATTGTGTCCTGCCAAACG
VvSBP1-like4 TGGGTTAGGGTTTGGAGAGG/GTGCCGCTTGTGGTATCTTT
VvSBP1-like5 TGCTTGATGGTACTGTGGGT/ATCCCTACCAGCTGCAATGT
VvSBP2 GCCAACAGTGTAGCAGGTTC/TGCTGCTTCCCACCATAGAA
VvSBP3-like1 AGAGGTACCACAGAAGGCAC/CTTCTGCGCTGGTTATGTCC
VvSBP3-like2 CCAAGTCTTCTACCACCCCA/CTTAAACAGCGCCCTACCAC
VvSBP6 TGCTTCCCAGTAACCCAAGT/ACAATCAGCCAATCTCCCCA
VvSBP7-like1 GAGGAGATTAGCAGGGCACA/AGTTCTGCTGAGGAAACCCA
VvSBP7-like2 ATCATCGACGGCATAGGGTT/TTCCTTTTCAACCGTGCCTC
VvSBP8 CCCGCTCATATTCACTCCCT/AATTCTCGCCGTGAAATCCG
VvSBP9 CGGGTTGAAATTTGGGCAGA/TGACCGTTGGAGACTTCGAA
VvSBP10 TTTGTCAACAGTGCAGCAGG/GGAGTTGCAACAGGGATTGG
VvSBP12 TGGGTTGGCTGCTTCATAGA/ATGAAGGAGGCACATGTCCA
VvSBP13 AAGGCTCGGGATTGTTACCA/GGTGGTCAGCTTGCAAGAAA
VvSBP14 TGAGGGAAAGAGAAGCTGCA/TGTTCCCTTGTGTACGAGCT
VvSBP16 AGCTTAGGAGGAGGACAGGA/CAGACTTTATGGCGACGGTG
VvSBP18 TTCCTCGGACTGTGCTTTCT/CTGGACTGATTGGCATGCTC
1.3 序列分析

利用序列分析软件ClustalX 2[16]、DNAMAN 6[17]和在线软件WebLogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi)分析VvSBP基因保守序列。利用同样的方法从转录因子数据库中得到拟南芥和杨树SBP-box蛋白。利用进化树分析软件MEGA 4.1(https://mega.co.nz/) [18]VvSBP进行亚组分类。葡萄SBP-box基因内含子、外显子和基因组定位均下载自葡萄功能基因组数据库(http://www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/ggb/vitis/12X/gbrowse/vitis/)。葡萄SBP-box基因内含子和外显子结构利用在线软件Gene Structure Display Server(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)制作完成。

1.4 葡萄SBP-box基因家族成员启动子作用元件分析

从葡萄转录因子数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)下载SBP-box家族成员的基因编号, 再在Grape Genome Browser(http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)中, 寻找到每一个基因序列上游1 500 bp的片段, 即获得基因的启动子序列, 将其放入PlantCARE中(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/), 即可查找到每个基因的启动子所对应的作用元件, 从而预测每一个基因潜在的生物学功能。

1.5 数据处理

对所有数据进行方差分析, 采用新复极差法进行显著性检验, 并采用Excel 2013软件绘图。

2 结果与分析 2.1 葡萄SBP-box转录因子家族成员序列分析

通过转录因子数据库得到葡萄SBP-box基因, 已在转录因子数据库中注册的葡萄SBP-box基因有19个, 下载其编码区并获得基因登录号。根据基因登录号, 在葡萄基因组数据库获得其相关的蛋白序列, 详细信息见表 2

表 2 葡萄中已知SBP-box基因家族成员 Table 2 The known SBP-box genes familly members in grape
基因名称
Gene name
登录号
Accession No.
染色体定位Chromosome localization 开放阅读框/bp
Opening reading frame
氨基酸
Amino acid
位置Location 染色体Chromosome
VvSBP1-like1 GSVIVT01020050001 11 124 690~11 127 549 1 351 116
VvSBP1-like2 GSVIVT01020051001 11 080 253~11 083 113 1 348 115
VvSBP1-like3 GSVIVT01020578001 4 108 297~4 110 237 12 510 160
VvSBP1-like4 GSVIVT01021087001 1 346 397~1 348 752 10 423 140
VvSBP1-like5 GSVIVT01028208001 4 628 142~4 637 596 7 2 583 860
VvSBP2 GSVIVT01010496001 21 064 305~21 071 687 1 1 257 418
VvSBP3-like1 GSVIVT01003836001 20 536 349~20 537 931 4 624 207
VvSBP3-like2 GSVIVT01014302001 2 484 297~2 485 658 19 615 204
VvSBP6 GSVIVT01012247001 230 334~235 218 1 1 497 499
VvSBP7-like1 GSVIVT01018205001 13 245 041~13 249 262 15 1 215 404
VvSBP7-like2 GSVIVT01017835001 3 885 149~3 896 071 5 2 079 693
VvSBP8 GSVIVT01018204001 13 256 865~13 259 160 15 1 167 388
VvSBP9 GSVIVT01033519001 20 046 489~20 051 103 8 1 050 350
VvSBP10 GSVIVT01032239001 13 588 595~13 606 856 11 981 326
VvSBP12 GSVIVT01017678001 2 565 343~2 574 143 5 2 943 981
VvSBP13 GSVIVT01008556001 904 847~907 405 17 1 134 378
VvSBP14 GSVIVT01013452001 347 645~353 985 18 2 766 922
VvSBP16 GSVIVT01010522001 21 412 776~21 417 820 1 1 266 422
VvSBP18 GSVIVT01033064001 25 486 818~25 489 754 14 1 137 378

利用ClustalX 2、DNAMAN 6序列分析软件和在线软件WebLogo3对葡萄SBP-box保守结构域进行分析, 结果发现, 17个SBP-box基因的SBP-box保守结构域含有74个氨基酸序列, 且大部分成员具有较高保守性; VvSBP 1-like1VvSBP1-like2不包含完整的SBP-box结构域, 其只含有完整结构域中的28个氨基酸, 缺少其他46个氨基酸(图 1图 2)。在SBP-box保守结构域中, 氨基酸1~4(CQVE)、6(C)、9~10(DL)、13~14(AK)、16~24(YHRRHKVCE)、26~28(HSK)、32(V)、34(V)、36(G)、39(Q)、40~49(QRFCQQCSRFH)、51(L)、53~55(EFD)、53~69(EFDEGKRSCRRRLAGHN)、71~74(RRRK)多达61个位点具有较高的保守性(图 1图 2)。

图 1 葡萄SBP-box蛋白家族的SBP-box保守结构域分析 Figure 1 Sequence analysis of the SBP-box conserved domain in grape SBP-box proteins
图 2 葡萄SBP-box蛋白家族的SBP-box保守结构域序列标签 Figure 2 The conserved domain logo of the SBP-box in grape SBP-box proteins
2.2 葡萄SBP-box蛋白家族进化树分析

通过进化树分析软件MEGA 4.1对已知19个葡萄SBP-box、30个拟南芥SBP-box、杨树32个SBP-box蛋白结构域序列进行进化分析。基于进化树亚组的分类标准, 即根据进化树中成员的聚类分支, 若成员位于同一分支, 具有较近的亲缘关系, 即定义为同一个亚组; 从进化树分析结果可以看出, 葡萄SBP-box家族共分为3个亚组。VvSBP1-like1、VvSBP1-like2、VvSBP2、VvSBP3-like1、VvSBP6、VvSBP8、VvSBP10、VvSBP13、VvSBP16、VvSBP18属于第1亚组; VvSBP1-like3、VvSBP1-like4、VvSBP1-like5、VvSBP3-like2、VvSBP7-like1、VvSBP9、VvSBP12、VvSBP14属于第2亚组; VvSBP7-like2属于第3亚组(图 3)。

图 3 葡萄、拟南芥和杨树SBP-box保守域进化关系和亚组分类 Figure 3 Phylogenetic relationship and subgroup division of SBP-box conserved domain of grape, Arabidopsis thaliana and Populus euphratica
2.3 葡萄SBP-box基因家族内含子与外显子分析

通过葡萄功能基因组数据库下载SBP-box家族每个基因的编码区序列及基因组信息, 并利用在线软件Gene Structure Display Server(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘图。从图 4可以看出:葡萄SBP-box家族的外显子和内含子数量各异, 且结合图 3发现, 第2亚组中基因成员的外显子和内含子数量普遍多于第1和第3亚组。

图 4 葡萄SBP-box基因内含子和外显子结构图 Figure 4 Intron-extron structures of grape SBP-box genes
2.4 葡萄SBP-box基因染色体定位分析

通过葡萄功能基因组数据库下载葡萄SBP-box相关染色体定位信息, 绘制染色体定位分布图。从图 5可以看出:葡萄SBP-box基因分布于葡萄13条染色体上, 呈不均匀分布。其中, 染色体1分布最多, 为5个; 其次是染色体5和15, 均分布2个; 染色体4、7、8、10、11、12、14、17、18和19均分布1个; 染色体2、3、6、9、13和16则没有分布。

图 5 葡萄SBP-box基因染色体定位 Figure 5 Chromosome locations of grape SBP-box genes
2.5 葡萄SBP-box基因家族成员启动子作用元件分析

表 3可见:SBP-box启动子元件可分为5个类型, 分别为光反应相关响应元件、激素相关的响应元件、胁迫相关响应元件、组织特异性响应元件、周期节律相关的元件。葡萄SBP-box基因家族中每一个成员均含有这5种作用元件类型, 其中光响应元件数量最多, 激素相关响应元件和胁迫相关响应元件的数量次之, 再次是组织特异性响应元件, 周期节律性相关元件数量最少, 甚至个别基因为0。不同转录因子不仅含有不同数量的激素相关响应元件, 如VvSBP 7-like1有14个, VvSBP 8VvSBP18分别有2个, 而且元件的类型也存在一定差异, 如VvSBP2分别含有脱落酸类(如ABRE)、乙烯类(如ERE)、赤霉素类(如GARE)等作用元件, 而VvSBP 3-like2则含有乙烯类(如ERE)、生长素类(如TGA-box)、赤霉素类(如GARE、TATC)等作用元件, 且各类型作用元件的数量不同(图 6), 说明它们可能通过响应不同的激素信号, 在果实发育成熟过程起不同的调控作用。

表 3 SBP-box家族不同成员基因的启动子元件分类及功能数量分析 Table 3 Promoter motif elements classification and function quatification analysis of SBP-box family members
基因名称
Gene name
光响应元件
Light-relatedelements
激素响应元件
Hormone-relatedelements
胁迫响应元件
Stress-relatedelements
组织特异性元件
Tissue specificelements
周期节律相关元件
Circadian-relatedelements
VvSBP1-like1 11 7 10 5 2
VvSBP1-like2 10 6 8 4 2
VvSBP1-like3 18 7 8 4 0
VvSBP1-like4 18 13 9 6 0
VvSBP1-like5 16 6 7 3 0
VvSBP2 13 3 5 2 2
VvSBP3-like1 15 8 6 2 1
VvSBP3-like2 19 10 8 4 1
VvSBP6 21 11 0 6 2
VvSBP7-like1 33 14 3 4 0
VvSBP7-like2 27 9 4 8 3
VvSBP8 19 2 3 1 1
VvSBP9 11 5 7 5 1
VvSBP10 16 8 6 2 0
VvSBP12 14 7 7 9 0
VvSBP13 24 4 9 3 0
VvSBP14 20 7 6 7 3
VvSBP16 29 5 14 8 1
VvSBP18 14 2 6 3 3
图 6 SBP-box基因家族不同成员激素相关启动子元件的功能分析 Figure 6 Functional analysis of hormone-related motif elements of SBP-box gene family members

进一步分析SBP-box家族成员启动子激素响应元件的类型发现, 总共有7类元件, 这些元件可分为萘乙酸(NAA)、赤霉素(GA)、水杨酸(SA)、细胞分裂素(CTK)、脱落酸(ABA)、乙烯(Ethylene)和茉莉酸甲酯(MeJA), 其中前4类主要促进生长发育列为第1组, 而后3类主要促进转色成熟列为第2组。VvSBP 7-like2VvSBP8VvSBP16只含有第2组元件, 表明其可能在促进果实成熟方面的潜在作用较强, 正调控果实的成熟过程; 相比之下, VvSBP 1-like1VvSBP9含有较多的第1组元件, 表明其可能起着抑制果实成熟而促进果实生长发育的作用。

2.6 SBP-box家族不同成员在葡萄果实发育不同时期的表达图谱 2.6.1 葡萄SBP-box家族基因在果实发育不同时期的表达

葡萄SBP-box家族基因的RT-qPCR结果表明, 它们在果实发育不同时期的表达具有时空特异性(图 7), 所有的家族成员在果实发育的不同阶段均有一定的表达。综合分析其表达图谱可以归为4类:1)VvSBP 1-like4VvSBP3-like2VvSBP9在果实膨大期具有表达高峰; 2)VvSBP 7-like1VvSBP7-like2VvSBP12VvSBP13VvSBP14在第2次果实膨大期和转色中期具有表达高峰; 3)VvSBP 2VvSBP3-like1VvSBP8VvSBP18 只在果实转色中期高表达; 4)VvSBP 1-like1VvSBP1-like2VvSBP6VvSBP10在幼果中高表达, 硬核期表达出现低谷, 之后随着果实的发育及成熟, 表达量逐渐升高, 但在果实完熟期表达量骤降。与上述4种表达模式不同, VvSBP 16在果实转色前, 其表达量逐渐降低, 果实转色前1周, 出现表达量低谷, 之后表达量骤然升高, 完熟期降至最低; VvSBP 1-like3只在果实生长发育前期具有较高的表达, 其余时期的表达量均很低; VvSBP1-like5在整个果实发育期, 表达量呈现递减的趋势。SBP-box家族基因的差异表达图谱表明, 不同成员在葡萄果实发育成熟过程中起不同的调控作用, 个别基因在果实的特定发育时期具有组织特异性的调控作用。

图 7 19个SBP-box家族不同成员基因在'魏可'葡萄果实8个典型生长时期的表达模式 Figure 7 Expression modes of 19 SBP-box family members genes during'Wink'eight typical developments stages 1)BPP:幼果期, 花后3 d; BBT:第1次果实膨大期, 花后13 d; SHS:硬核期, 花后37 d; BTC:果皮褪绿期, 花后47 d; BPR:转色前1周, 花后61 d; ECP:转色初期, 花后69 d; CCP:转色中期, 花后84 d; BRP:完熟期, 花后99 d。2)不同小写字母表示在0.05水平差异显著。下同。 1)BPP:Berry pea size period/young berry, 3 days after anthesis; BBT:Stage of the first enlargement of berry, 13 days after an athesis; SHS:Stone hardening stage/small hard, 37 days after anthesis; BTC:Berry touch complete/peel green fading stage, 47 days after anthesis; BPR:Initial period of ripening/one week before veraison, 61 days after anthesis; ECP:Early color-change period, 69 days after anthesis; CCP:Mid color-change period, 84 days after anthesis; BRP:Berry ripening period, 99 days after anthesis. 2)Values followed by different small letters are significantly different at 0.05 level. The same as follows.
2.6.2 SBP-box家族基因对ABA、NAA的应答模式

在果实转色前1周利用ABA或NAA处理葡萄果穗, 结果发现NAA处理葡萄果实后, 果实转色进程慢于对照组, 而ABA处理促进果实转色和成熟。由图 8可见:果实经过ABA和NAA处理后, 所有的SBP-box转录因子成员的表达量与对照相比均有较大的差异。ABA在果实转色初期促进了SBP-box家族中VvSBP 1-like1VvSBP3-like1VvSBP6VvSBP13VvSBP16的表达, 在果实转色中期促进了SBP-box家族中VvSBP 7-like1VvSBP7-like2VvSBP12VvSBP14的表达, 而NAA则分别在相应时期抑制了这些基因的表达; 此外, NAA在果实转色初期, 促进了SBP-box家族中VvSBP 1-like2VvSBP9的表达, 在果实转色中期, 促进了SBP-box家族中VvSBP 1-like3VvSBP1-like5VvSBP3-like2VvSBP10VvSBP18的表达, 而ABA则抑制这些基因的表达。结合ABA、NAA对葡萄果实的生理作用, 可推测SBP-box家族大部分成员可能参与调控葡萄果实的转色与成熟。

图 8 ABA和NAA处理'魏可'葡萄果实SBP-box家族不同成员基因的表达 Figure 8 Expression level of SBP-box family members genes after the treatment of ABA and NAA
3 讨论

SBP-box是植物特有的一类转录因子, 广泛存在于植物中, 并在植物生长发育的多个方面起着非常重要的调控作用, 除了调控花器官的发育、植物育性、叶形态建成等, 还参与调节果实的发育与成熟过程, 并且同一家族中不同成员之间的功能存在差异[19-21]

随着不同物种全基因组测序的相继完成, 转录因子数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中, 在拟南芥中发现30个SBP-box基因, 杨树中发现32个SBP-box基因, 水稻中发现29个SBP-box基因, 大豆中发现111个SBP-box基因, 苹果中发现42个SBP-box基因[22], 葡萄发现的SBP-box基因相对较少, 远低于上述5种物种, 且这些SBP-box基因均含有SPL保守结构域。本研究在进化树分析中, 加入拟南芥和杨树SBP-box基因对VvSBP进行系统鉴定并分类, 说明不同物种间SPL结构域保守性较高。

迄今为止, 对已知葡萄SBP-box基因参与果实发育成熟的研究很少。因此, 本文结合VvSBP的基因组基本信息、保守结构域、进化关系、内含子与外显子、染色体定位等信息对VvSBP参与葡萄果实发育与成熟进行了详细分析, 结果显示, 葡萄转录因子SBP-box家族成员在果实的生长发育与成熟的特定时期起着重要的调控作用。葡萄转录因与SPB-box中有9个成员(VvSBP 1-like1VvSBP3-like1VvSBP6VvSBP7-like1VvSBP7-like2VvSBP12VvSBP13VvSBP14VvSBP16), 多属于第1亚组和第3亚组, 在果实转色特定时期可能对葡萄果实的转色与成熟起促进作用; SBP-box家族中7个成员(VvSBP 1-like2VvSBP1-like3VvSBP1-like5VvSBP3-like2VvSBP9VvSBP10VvSBP18), 多属于第2亚组, 可能在果实转色特定时期抑制果实的转色与成熟。该研究为进一步探讨已知葡萄SBP-box基因在植物果实发育过程中相关功能的了解奠定了基础。

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