小麦籽粒是由多种具有不同生理功能的组织组成的复杂器官, 从外到内依次分为皮层、糊粉层、淀粉质胚乳和胚。胚乳是人类利用的最主要部位, 胚乳的发育是一个复杂的动态过程, 其发育状况决定着小麦的产量与品质^[1]。淀粉和蛋白质是籽粒的主要成分, 胚乳的发育过程就是淀粉体和蛋白体不断形成淀粉粒和蛋白质的过程。在胚乳发育早期蛋白体为球状小颗粒, 随后体积扩大并发生融合, 后期则完全融合为蛋白质基质, 并填充在淀粉粒间的缝隙中^[2]。淀粉积累在胚乳细胞的淀粉体内, 分为大淀粉粒和小淀粉粒。花后4~16 d为大淀粉粒的快速增殖和生长阶段, 随后小淀粉粒快速增加^[3]。小麦胚乳的发育不仅受基因型影响, 还受环境和栽培措施的共同作用。胚乳细胞的分裂速率因花后高温而提高, 但胚乳细胞总数和粒重则降低^[4]。胚乳细胞数、细胞长度和宽度因孕穗期施氮而提高, 同时细胞壁厚度、淀粉体和蛋白体数也有所增加^[5]。

硫是植物必需中量矿质元素, 近年由于作物产量的大幅度提高, 而含硫肥料施用却在减少, 加上大气对土壤硫供应的降低, 土壤缺硫已成为常态。抽样调查结果显示我国北方约有30.3%的土壤缺硫, 南方约有26.5%的土壤缺硫^[6-7]。Randall等^[8]认为当植株硫含量低于0.12%或N/S大于17时为缺硫状态。缺硫会导致植株矮化、幼嫩器官黄化褪色, 叶片气孔开度下降, 降低光合作用, 进而造成作物产量下降^[9-11]。缺硫也会影响作物品质, 有研究显示小麦缺硫利于籽粒中贫硫、低硫贮藏蛋白的合成和积累, 不利于富硫蛋白的积累, 改变蛋白组分的比例, 影响其品质^[12]。施硫可提高灌浆籽粒中淀粉合成酶活性, 促进淀粉的积累^[13]。但硫肥对小麦颖果和胚乳发育的影响还缺乏报道。本试验以'扬麦16'为材料, 研究了不同时期施硫对小麦颖果形态、胚乳细胞形态数及蛋白体和淀粉粒空间分布的影响, 为小麦的调优栽培及育种提供一定的参考。

1 材料与方法 1.1 供试材料与试验设计

试验于2015—2016年小麦生长季进行, 地点位于南京市浦口区汤泉镇汤泉农场(118°27′E, 32°05′N)。供试土壤为黏质壤土, 前茬为水稻。供试品种为'扬麦16', 播种时间为2015年11月1日。试验田土壤养分含量为:全氮1.13 g · kg^-1, 碱解氮57 mg · kg^-1, 速效磷40.3 mg · kg^-1, 速效钾288.07 mg · kg^-1, 有机质15.7 g · kg^-1, 有效硫16.38 mg · kg^-1。

试验设4个施硫时期:播种期(basal, BA)、拔节期(jointing, JT)、孕穗期(booting, BT)和开花期(anthesis, AT), 以不施硫(S0)为对照, 硫肥的施用量为60 kg · hm^-2, 施用形式为硫磺。试验采用随机区组设计, 3次重复。小区面积为17.5 m²(3.5 m×5 m)。氮、磷、钾的施用量分别为240、120和180 kg · hm^-2, 氮肥施用形式为尿素, 磷肥施用形式为磷酸二氢钾, 钾肥施用形式为氯化钾和磷酸二氢钾。氮肥按基肥和追肥的质量比为1 : 1比例施用, 磷、钾肥全部基施, 均匀撒施在土壤表层。

于开花期选择生长一致且同天开花的麦穗挂牌标记, 于花后取基部相同穗位颖果, 用于胚乳发育动态观察。于2016年6月2日成熟期收获籽粒, 完成后熟后用FSJ-1型粮食实验粉碎机(河北涿州市粮油机械厂)磨粉, 用YES-08验粉筛(150 μm)过筛后保存备用; 同时选取成熟期饱满籽粒100 g用AEVF型籽粒分层碾米机(STRECKEL SCHRADER, 德国)将小麦籽粒从外到内按果种皮(7%)、糊粉层(13%)、外胚乳(20%)、中胚乳(20%)、内胚乳和胚(40%)的比例分层制粉, 用于蛋白质和淀粉含量测定。

1.2 测定项目与指标 1.2.1 颖果干、鲜质量测定

取花后不同发育时间的颖果30粒, 测定鲜质量、干质量, 计算含水率。

1.2.2 颖果发育形态观察

取穗中部小穗基部相同穗位的颖果, 用OLYMPUS sz61体视显微摄影装置拍摄不同发育时间颖果形态; 分别取花后8、12、15、20、23和28 d中部小穗基部颖果10粒用SmartGRAIN软件分析颖果面积、周长和长宽比。

1.2.3 胚乳细胞观察和计数

参考郭文善等^[14]和顾蕴洁等^[15]的方法, 稍加改进。取花后15和28 d穗中部小穗基部颖果2粒, 用FAA固定液固定24 h, 蒸馏水中放置1 h, 在解剖镜下于有水的载玻片上剥去皮层和胚, 胚乳放入干净试管中, 加入1 mL苏木精染液, 染色24 h后滤掉染液, 移至水中分色至水清, 加入4 mL 0.3%纤维素酶液(由pH4.0磷酸-柠檬酸缓冲液配制), 于40 ℃恒温摇床中振荡酶解8 h, 分散胚乳, 吸取0.025 mL混合液至滴有1滴甘油的载玻片上, 光学显微镜下镜检观察并计算视野下胚乳细胞数。胚乳细胞数=视场细胞数×视场数×稀释体积/抽取量。

1.2.4 颖果显微结构观察

于花后12、20 d取穗中部小穗基部相同穗位的颖果, 横切为1 mm薄片, 置于FAA固定液中, 乙醇系列脱水, 石蜡渗透包埋后制作4 μm的石蜡切片, 脱蜡后用0.5%甲苯胺蓝-O(TBO)染色, 用NIKON ECLIPSE CI正置光学显微镜(日本)观察蛋白体形态和分布。

取成熟期饱满籽粒, 烘干后在解剖镜下横切使其截面自然断裂, 切片厚度1~2 mm, 用双面胶带将样品固定在铜台上, 经Cressington 108Auto全自动离子溅射仪镀金后用ISO9001扫描电镜(HORIBA, 英国)观察断面结构并拍照。

用Sai绘画软件对图片进行标记处理, 用Image J分别统计蛋白体和大小淀粉粒在图片中的面积。蛋白体面积比例=视野中蛋白体面积/视野总面积×100%;淀粉粒面积比例=视野中淀粉粒面积/视野总面积×100%。

1.2.5 蛋白质和淀粉含量测定

总蛋白含量依照《谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白质含量计算——凯氏法:GB/T 5511—2008》消煮, 用半微量凯氏定氮法测定其氮含量, 氮含量乘以5.7计算总蛋白含量; 淀粉含量参照《原淀粉、淀粉含量的测定——旋光法:GB/T 20378—2006》进行测定。

1.3 数据处理方法

采用Excel 2007处理试验结果, 数据统计分析用SPSS 20.0软件, 用SigmaPlot 12.5作图。

2 结果与分析 2.1 小麦颖果干、鲜质量动态及施硫对干质量的影响

小麦颖果鲜质量从开花至花后23 d积累较快, 23~28 d增长缓慢, 此后下降。干质量在灌浆中期增加较快, 开花28 d后增加速率变缓。含水率在颖果发育前期较高, 约为80%;随着灌浆的进行, 含水率不断下降直至成熟。在含水率为40%~50%时颖果干质量接近最大值; 当含水率继续下降, 颖果灌浆趋于停止(图 1-A)。5~23 d时, 施硫处理的干质量均低于S0处理, 之后至成熟干质量大于S0处理; 4个施硫处理中, 以孕穗期施硫对前期干质量的降低作用最弱, 对后期干质量的增加最显著, 表明孕穗期施硫增加籽粒灌浆过程中的物质积累(图 1-B)。

2.2 施硫时期对小麦颖果形态的影响

从开花至花后12 d, '扬麦16'颖果横向发育和纵向发育同时进行, 且纵向生长快于横向生长, 12 d时颖果纵向伸长基本停止; 12~23 d颖果主要进行横向生长, 长宽比逐渐下降, 28~36 d果皮中叶绿素逐渐解体, 颖果颜色逐渐变黄, 至36 d降解, 籽粒完全呈黄色, 并脱水皱缩(图 2-A)。花后12 d, 各施硫处理的水平投影面积与S0处理无显著差异, 但12 d后均显著高于S0处理, 颖果发育后期施硫对其投影面积的相对增加量为0.5%~18.7%, 以基施硫肥(BA)增量最大, 其次为孕穗期施硫(BT)处理。颖果周长的变化趋势与水平投影面积基本一致(图 2-B、C)。花后12 d, 各施硫处理的长度和宽度均小于S0处理, 15 d后, 各施硫处理的长度和宽度均大于S0处理, 长宽之比小于S0, 说明施硫可以促进灌浆中期颖果发育, 尤其是促进颖果横向发育, 有利于提升籽粒库容, 促进灌浆物质的积累(图 2-D、E、F)。各施硫处理中, 孕穗期施硫对颖果宽度的增加较为显著。

2.3 施硫时期对小麦胚乳细胞发育的影响

由图 3可知:花后15 d胚乳细胞多为较规则的椭球型, 胚乳可能仍处于细胞态; 28 d时胚乳细胞多为形状不规则的长条型、纺锤型, 此时胚乳细胞已成为充满淀粉和蛋白的死细胞, 细胞内大、小淀粉粒随机混合分布。随颖果的发育, 胚乳细胞数显著增加, 15 d时所有处理中颖果的胚乳细胞数为(5~10)×10⁴, 而28 d时为(10~20)×10⁴。各处理的颖果胚乳细胞数相对增加量为37%~127%。施硫对胚乳细胞形态无显著影响, 但可增加颖果中胚乳细胞数, 与S0相比, 15和28 d施硫处理颖果中胚乳细胞数分别增加92%和97%, 基施硫肥处理次之, 而拔节期和开花期施硫则对胚乳细胞数无显著影响(图 4)。

2.4 施硫时期对灌浆期小麦蛋白体和淀粉体分布的影响

由图 5可知:花后20 d的颖果腹部蛋白体和淀粉体的积累显著多于背部, 施硫可明显增加颖果横截面上蛋白体面积。各处理间以BT(孕穗期施硫处理)对蛋白体面积的增加较为显著, 颖果背部蛋白体面积的增加量约为71%, 腹部约为56%。

以BT处理为例, 分析颖果中蛋白体发育情况。由图 6可知:花后12 d胚乳仍处于细胞化时期, 此时胚乳中已有淀粉体和蛋白体的形成, 淀粉体主要分布在近核与近细胞壁的细胞质中, 蛋白体数较少体积较小。20 d时, 蛋白体数显著多于12 d的, 此时核已变形甚至消失, 胚乳中出现小淀粉粒, 主要沿细胞壁分布, 大、小淀粉粒成片聚集, 蛋白体逐渐聚合并嵌合在淀粉粒缝隙中。此时颖果横切面各个部位的蛋白体面积比例均显著高于12 d的, 靠近皮层和靠近胚乳腔的部位蛋白体数多于中间位置的胚乳细胞; 与背部胚乳相比, 腹部胚乳中的蛋白体数较多。

2.5 施硫时期对成熟期籽粒结构的影响 2.5.1 对成熟籽粒蛋白体和淀粉体分布的影响

施硫可降低小淀粉粒的比例, 增加蛋白质的积累。籽粒横切面中大、小淀粉粒紧密嵌合, 蛋白质呈絮状镶嵌在大、小淀粉粒的缝隙中, 因此大淀粉粒比例的变化趋势与小淀粉粒相反。比较不同处理中籽粒背腹部中间位置胚乳大、小淀粉粒的分布情况, 发现BT(孕穗期施硫)处理小淀粉粒的比例较小, BA(基施硫)处理次之, S0处理中小淀粉粒比例最大(图 7)。BT处理中, 靠近种果皮的胚乳小淀粉粒比例约为5.7%, 显著低于中间部位胚乳的比例; 腹部胚乳小淀粉粒的比例略低于背部胚乳(图 8)。

2.5.2 对成熟籽粒不同部位蛋白质和淀粉含量的影响

成熟籽粒从外层到内层, 总蛋白含量先升高后降低, 以F2层(糊粉层和亚糊粉层)含量最高, 胚乳中的蛋白质含量从外到内逐层递减(图 9-A)。硫肥的施用会增加籽粒所有部位总蛋白的含量, 但不同处理增加的幅度不同:BA、BT、AT处理的增效较为显著, JT处理对蛋白质含量的增效最低(F1层除外), 各处理均在F3、F4层(外、中胚乳)对蛋白质含量的增加最为明显, 其中BT处理增效最为明显(图 9-B)。由外层至胚乳腔籽粒淀粉含量逐层递增, F5(内胚乳)含量最高, F1(果种皮)含量最低(图 9-C)。除BT处理外, 其余处理均增加F1(果种皮)中淀粉的含量, 以BA处理增效最为显著, 约为30%;除F1(果种皮)外, 籽粒F5(内胚乳)的淀粉含量对硫肥无显著响应, F2(糊粉层)和F4(中胚乳)中的淀粉含量轻微下降, F3(外胚乳)中淀粉含量在硫肥的影响下明显降低(图 9-D), 即硫肥主要调控果种皮和外胚乳中淀粉含量的变化。

3 讨论 3.1 施硫时期对小麦颖果和胚乳发育的影响

胚乳发育受环境的影响较大, 孕穗期施氮可提高胚乳细胞数及细胞长度和宽度, 增加细胞壁厚度^[5]。本研究结果表明, 施硫可增大库容, 促进灌浆过程中的物质积累, 进而促进籽粒质量的增加。这可能是因为施硫提高了顶部功能叶的光合速率, 进而有利于千粒质量的增加^[16-17], 这与前人研究结果一致。籽粒干质量和体积与胚乳细胞数呈显著正相关^[18]。本研究中, 施硫对籽粒质量的增加是通过增加胚乳细胞数实现的, 对库容的增加则通过促进颖果横向发育实现; 孕穗期施硫对颖果和胚乳发育的影响最为显著。孕穗期是小麦成穗的重要时期, 此时对营养的需求量较大, 若营养供应不足会出现脱肥现象, 对小穗的发育、小花的形成及后期的灌浆过程不利^[19]。孕穗期追肥可协调产量和品质的关系^[20]。孕穗期施硫处理既能及时补充前期缺少的营养, 又能兼顾后期的生殖生长, 提高后期光合生产量, 保证籽粒灌浆^[21]。

3.2 施硫时期对小麦蛋白体和淀粉体分布的影响

籽粒中蛋白质和淀粉的积累显著受到矿质元素的调控, 孕穗期施氮可促进胚乳细胞中大淀粉体的形成, 增加大淀粉体和蛋白体数, 减少小淀粉体数, 提高淀粉体和蛋白体的充实程度^{[5, 22]}。本研究中, 施硫可显著增加颖果横切面中蛋白体的面积, 减少小淀粉粒的面积, 使成熟籽粒中每层蛋白质含量都有所增加, 但主要调控皮层和外胚乳中淀粉含量。成熟籽粒中蛋白质含量在糊粉层和亚糊粉层含量最高, 随后向内层递减。颖果中靠近皮层和胚乳腔的胚乳中蛋白体的比例显著大于中间部位, 这与灌浆物质的运输途径有关, 经维管束运输的灌浆物质卸载在胚乳腔中, 随后一小部分直接进入胚乳细胞, 大部分通过糊粉层细胞向籽粒背部运输, 同时向内部扩散^{[3, 23]}。我们推测硫肥对籽粒品质的调控是通过促进该运输途径实现的, 主要作用在促进蛋白质和淀粉的合成底物氨基酸、蔗糖的运输, 进而调控不同部位大、小淀粉粒和蛋白体数、比例和积累。孕穗期施硫处理对其调控效果最好, 拔节期施硫处理调控效果最差。成熟籽粒中总淀粉含量受硫肥的影响不显著, 说明总淀粉含量还受到蛋白含量的影响。

综上所述, 施硫增加灌浆中后期颖果长度、宽度、周长、投影面积和干鲜质量, 显著提高胚乳细胞数, 增大库容。硫肥的施用影响成熟籽粒蛋白质和淀粉的积累和分布, 并以孕穗期施硫处理调控效果最好。