球虫病是鸡的重要疾病之一, 对鸡球虫病的防控措施主要从饲养环境管理、疫苗免疫、药物预防或治疗等几个方面来进行。所用药物主要有聚醚类离子载体抗生素、人工合成抗球虫药、中草药等^[1-4]。

氢溴酸常山酮(halofuginone hydrobromide)属于人工合成的一种广谱抗球虫药, 是从植物中纯化出来的喹唑啉酮类生物碱——常山(dichroa fabrifuga)的卤代衍生物。常山酮分为两种, 分别是氢溴酸盐和乳酸盐。氢溴酸常山酮按推荐剂量3 mg·kg^-1添加在饲料中, 用于预防和治疗鸡球虫病, 主要机制是对球虫子孢子、第一代及第二代裂殖体具有明显的抑杀作用, 防止破坏鸡肠上皮细胞, 具有预防球虫病及提高饲料利用率作用。由于氢溴酸常山酮安全范围比较窄, 饲料添加的有效浓度为3 mg·kg^-1, 而高于4.5 mg·kg^-1则抑制生长, 高于6 mg·kg^-1则显著降低饲料转化率, 如果拌料不均匀, 不但疗效不佳, 还导致鸡只出现中毒症状。因此必须加强对饲料中氢溴酸常山酮药物浓度的检测。目前, 国内外报道的氢溴酸常山酮的检测方法有气-液相色谱法^[5]、毛细血管电泳法(CE)^[6]、高效液相色谱法(HPLC)^[7-9]、放射性同位素标记法^[10]和高效液相色谱-质谱联用检测法(HPLC-MS)^[11]。我国尚未报道鸡饲料中氢溴酸常山酮的检测方法, 因此, 有必要建立一种高效、准确、简单的检测方法, 以便监测饲料中药物的浓度。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验药品与试剂

氢溴酸常山酮标准品(质量分数99.28%), 购于南京天海医药科技有限公司; 冰乙酸、乙酸铵、乙酸乙酯等均为分析纯; 乙腈、甲醇为色谱纯。

1.1.2 试验仪器与设备

Ultimate 3000高效液相色谱仪系统(Thermo公司); 3K-15低温高速离心机(美国Sigma公司); FE-20K pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司); DC-12 H型氮吹仪(上海安普科学仪器有限公司); Oasis^® HLB 3CC(60 mg)固相萃取柱(Waters公司)。

1.2 主要溶液的配制 1.2.1 乙酸铵缓冲液的配制

称取19.27 g乙酸铵于1 000 mL容量瓶中, 用冰乙酸溶液调为pH4.3, 并用纯净水定容用作流动相。取0.25 mol·L^-1乙酸铵溶液稀释至0.125 mol·L^-1, 作为萃取液用。

1.2.2 HPLC流动相的配制

分别量取250 mL乙腈、150 mL 0.25 mol·L^-1乙酸铵溶液、600 mL纯净水, 定容至1 000 mL容量瓶中, 经0.22 μm滤膜过滤, 制成V(乙睛):V(0.25 mol·L^-1乙酸铵溶液):V(纯净水)=5:3:12的流动相(用冰乙酸调pH4.3)。

1.2.3 标准储备液(200 μg·mL^-1)的配制

准确称取10.0 mg氢溴酸常山酮标准品置入50 mL棕色容量瓶中, 用0.25 mol·L^-1乙酸铵溶解并定容, 密封, 在4 ℃下避光保存。

1.2.4 标准液的配制

从冰箱中取出标准品储备液置于室温环境中, 用移液管移取所需量, 用流动相分别配制150、100、50、20、10、5和2 μg·mL^-1的氢溴酸常山酮标准液, 密封, 在4 ℃下避光保存。

1.3 试验方法 1.3.1 样品的采集及保存

用抽样锥随机从10袋鸡配合饲料(由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供)的上、下两个部位分别取约2 kg饲料作为原始样品, 然后将原始样品均匀混合, 采用四分法缩减至约1 kg, 作为次级样品。将上述次级样品四分法缩减, 取约200 g粉碎后过1 mm孔筛, 混匀, 装入磨口瓶中备用。

1.3.2 试验色谱检测条件

C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)。流动相:V(乙睛):V(0.25 mol·L^-1乙酸铵溶液):V(纯净水)=5:3:12(pH4.3)^{[8, 12]}。流速1.0 mL·min^-1, 检测波长243 nm, 进样量25 μL, 柱温25 ℃。

1.3.3 药物提取与净化

称取饲料样品1 g于50 mL离心管中, 加入1 mL 100 g·L^-1碳酸钠溶液和乙酸乙酯10 mL, 涡旋3 min, 8 000 r·min^-1离心5 min。取上层液体转移至另一50 mL离心管中, 剩余物再用10 mL乙酸乙酯重提1次, 合并2次提取液, 加入5 mL 0.125 mol·L^-1乙酸铵溶液萃取, 振摇1 min, 8 000 r·min^-1离心5 min。转移下层液体至另一50 mL离心管, 重复提取1次。合并2次的下层溶液, 用40 ℃氮气吹干残余的乙酸乙酯, 作为备用液(含药物)。

HLB柱依次用甲醇、水和0.125 mol·L^-1乙酸铵溶液各3 mL活化。取备用液(含药物)10 mL过柱, 加体积分数为1%甲醇溶液洗涤并抽干, 3 mL甲醇洗脱, 洗脱液在50 ℃下用氮气吹干。残渣物加1 mL流动相复溶, 超声振荡2 min, 涡动2 min。经过0.22 μm滤膜过滤, 取25 μL进行HPLC测定。

1.4 方法学考察 1.4.1 方法的特异性

取6个不同来源的空白鸡配合饲料, 添加100 μL 2 μg·mL^-1氢溴酸常山酮标准液, 制成0.2 μg·g^-1 6个配合饲料样品, 按1.3.3节方法处理后进样分析, 观察常山酮保留时间附近是否有杂峰干扰, 判断检测方法的特异性。

1.4.2 方法灵敏度的测定

添加适量氢溴酸常山酮标准液到1 g空白配合饲料样品中, 按1.3.3节方法处理后检测, 根据所测药物信噪比(S/N)不小于3和10分别为方法检测限(LOD)和定量限(LOQ)的原则, 测得氢溴酸常山酮在鸡配合饲料中的检测限和定量限。

1.4.3 药物浓度标准曲线的绘制

用流动相稀释氢溴酸常山酮标准液分别制成0.2、0.5、1、2、5、10和15 μg·mL^-1系列浓度的工作液直接进样测定, 每个浓度5个重复, 以标准溶液浓度(C)为横坐标, 峰面积(S)为纵坐标, 将峰面积与相应的药物质量浓度做线性回归, 绘制标准曲线求出回归方程和相关系数。

1.4.4 基质加标工作曲线绘制

准确称取空白鸡配合饲料1 g样品若干份, 加入氢溴酸常山酮标准液, 使饲料中的药物水平分别为0.2、0.5、1、2、5、10和15 μg·g^-1, 按1.3.3节方法进行操作, 按照1.3.2节色谱条件进行测定, 记录色谱图, 得峰面积(S), 每个水平5个重复, 以S(峰面积)对C(浓度)回归, 绘制标准曲线并得回归方程。

1.4.5 准确度和精密度的测定

采用标准添加法, 在空白配合饲料中分别添加定量限(0.2 μg·g^-1)和低(1.0 μg·g^-1)、中(5.0 μg·g^-1)、高(15.0 μg·g^-1)4个质量浓度水平的样品, 按照1.3.3节方法处理样品, 按照1.3.2节色谱条件进行测定, 每批次、每个浓度5个重复, 连续测3 d, 每天测1个批次。将氢溴酸常山酮的峰面积代入1.4.4节的线性方程, 求出回收浓度, 然后回收浓度除以理论浓度, 求得氢溴酸常山酮不同质量浓度下的相对回收率, 并分别计算日内和日间精密度。

1.4.6 方法的稳定性测定

分别于0、14 d吸取适量贮存在4 ℃的200 μg·mL^-1储备液, 用流动相稀释到20 μg·mL^-1进样分析, 每次3个重复, 记录峰面积, 考察氢溴酸常山酮在第14天的稳定性。

2 结果与分析 2.1 方法的特异性检测结果

空白鸡饲料中的氢溴酸常山酮在出峰时间为10.6 min附近无干扰, 峰形良好, 偏差小于2.5%(图 1), 说明该方法能去除基质对氢溴酸常山酮的干扰, 能够用于后期的定性和定量测定。

2.2 方法灵敏度的测定结果

本试验采用标准添加法考察方法的灵敏度。以信噪比(S/N)不小于3和不小于10为参考, 确定方法的检测限(LOD), 结合回收率及精密度测定结果, 确定方法定量限(LOQ)。测得氢溴酸常山酮在鸡配合饲料中的LOD为0.05 μg·g^-1, LOQ为0.2 μg·g^-1。

2.3 方法的校准曲线绘制 2.3.1 药物浓度标准曲线

将由1.2.4节标准液稀释的质量浓度为0.2、0.5、1、2、5、10和15 μg·mL^-1的标准工作液, 按其所得峰面积的平均值与对应的标准溶液质量浓度作标准曲线。由图 2可知, 在0.2~15 μg·mL^-1范围内线性回归方程为y=2.591 4x+ 0.097 7。

2.3.2 基质加标曲线

饲料样品按含药物0.2、0.5、1、2、5、10和15 μg·g^-1添加, 由试验结果可知, 在0.2~15 μg·g^-1范围内线性方程为y=1.933 3x+0.021 8。

2.4 方法的准确度和精密度

向空白饲料中添加定量限和低、中、高4个水平点的标准工作液, 结果见表 1。4个添加浓度的平均回收率均大于85%, 日内、日间精密度均小于20%。

2.5 方法的稳定性

将在4 ℃贮存0 d和14 d的200 μg·mL^-1药物储备液分别稀释为20 μg·mL^-1的3个重复的工作液, 进样分析, 经过峰面积值的计算, 得出日间变异系数为0.25%。

3 讨论

根据相关报道^{[8, 12]}, 流动相为乙腈、0.25 mol·L^-1乙酸铵缓冲液、水(体积比5:3:12), 检测波长243 nm, 进样量25 μL。柱温为30 ℃时, 出峰时间较早, 杂峰与目标峰不能分离, 所以本试验将柱温改为25 ℃后分离度良好, 最终符合要求。

分别选取乙腈、甲醇、乙酸乙酯等溶剂对饲料中的药物进行提取并检测, 乙腈和甲醇提取的样品在空白色谱图中有干扰, 回收率低^{[10, 13]}。随后配制甲醇-乙腈溶液(体积比1:1)提取药物, 但并未对样品色谱图和回收率有改善。而用乙酸乙酯提取样品时在空白色谱图上无干扰, 所以首选乙酸乙酯为提取溶剂。

据文献报道^[14], 碳酸钠能促进氢溴酸常山酮由离子状态转变为分子状态, 更容易从有机相进入水相。对提取过程中加入不同量碳酸钠的提取效果进行比较, 发现加入1 mL 100 g·L^-1碳酸钠溶液最合适。

在对净化条件的摸索中, 通过检测过HLB柱前后的备用液(含药物)、淋洗液、洗脱液中氢溴酸常山酮浓度, 发现备用液(含药物)过HLB柱后药物浓度很高。因此, 判断回收率低的原因主要是HLB柱没能有效保留药物。为了排除各种因素对HLB柱的影响, 经过试验的测定比较, 发现备用液中残留的乙酸乙酯是关键因素, 所以在提取含药物备用液时要在50 ℃下用氮气吹干残余的乙酸乙酯。

加入备用液(含药物)后的HLB柱子, 需要淋洗去除杂质, 通过对比甲苯和体积分数分别为0.5%、1%、5%、10%甲醇淋洗液的除杂能力, 发现甲苯无淋洗效果, 且对柱子有损坏作用, 0.5%甲醇除杂能力较弱, 5%和10%甲醇淋洗后回收率较低, 而1%甲醇淋洗液除杂效果好并且回收率能达到要求。

本试验采用高效液相色谱法测定了饲料中氢溴酸常山酮的含量, 相对于文献[7-9]所建立的方法, 本试验建立的方法操作更快速、简便, 这主要得益于对样品处理方法的改进。试验在0.2~15 μg·g^-1范围内, 线性方程相关系数不小于0.999, 回收率大于85%, 日内和日间变异系数小于20%, 达到了相关规定要求, 所以本方法适用于饲料中氢溴酸常山酮的含量检测。