南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (1): 147-153   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201701100
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汪浩, 乔绪稳, 陈瑾, 李图帅, 张元鹏, 侯继波, 郑其升, 孙卫东
WANG Hao, QIAO Xuwen, CHEN Jin, LI Tushuai, ZHANG Yuanpeng, HOU Jibo, ZHENG Qisheng, SUN Weidong
GEM技术浓缩纯化O型口蹄疫病毒灭活抗原方法的建立
Concentration and purification of type O foot and mouth disease virus inactivated antigen with Gram-positive bacterial enhancer matrix
南京农业大学学报, 2018, 41(1): 147-153
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(1): 147-153.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201701100

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收稿日期: 2017-01-30
GEM技术浓缩纯化O型口蹄疫病毒灭活抗原方法的建立
汪浩1,2 , 乔绪稳1,3 , 陈瑾1,3 , 李图帅1,3 , 张元鹏1,3 , 侯继波1,3 , 郑其升1,3 , 孙卫东2     
1. 国家兽用生物制品工程技术研究中心, 江苏 南京 210014;
2. 南京农业大学动物医学院, 江苏 南京 210095;
3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 江苏 扬州 225009
摘要[目的]验证利用革兰氏阳性增强基质颗粒(GEM)浓缩纯化口蹄疫病毒(FMDV)抗原的可行性。[方法]将含有3个自溶素基序的锚钩蛋白基因(PA)与针对O型口蹄疫病毒特异性纳米抗体基因(VHH)串联克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-VPA,将其转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),表达获得融合重组蛋白VPA。先将GEM颗粒与重组蛋白VPA在37℃孵育30 min,离心,取沉淀用适量的FMDV抗原液重悬,再经一步低速离心,获得沉淀即为浓缩纯化的口蹄疫病毒抗原。利用SDS-PAGE、Western-blot、蛋白含量测定及146S测定等方法对浓缩纯化方法的可行性进行鉴定,并通过动物免疫试验初步验证浓缩纯化后抗原的免疫原性。[结果]VPA融合蛋白能够在大肠杆菌中部分可溶性表达。作为接头蛋白,VPA既能与GEM颗粒结合,又能与FMDV抗原结合。SDS-PAGE与Western-blot结果表明:FMDV通过GEM法得到有效纯化;146S测定结果表明FMDV的回收效率达到99%;总蛋白含量测定结果显示口蹄疫抗原杂蛋白去除率达到90%;动物免疫试验结果显示GEM技术纯化后的FMDV具有良好的免疫原性。[结论]利用GEM技术浓缩纯化口蹄疫病毒抗原是可行的。
关键词GEM技术   口蹄疫病毒   抗原纯化   
Concentration and purification of type O foot and mouth disease virus inactivated antigen with Gram-positive bacterial enhancer matrix
WANG Hao1,2, QIAO Xuwen1,3, CHEN Jin1,3, LI Tushuai1,3, ZHANG Yuanpeng1,3, HOU Jibo1,3, ZHENG Qisheng1,3 , SUN Weidong2    
1. National Research Center of Veterinary Biological Engineering and Technology, Nanjing 210014, China;
2. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
Abstract: [Objectives] The purpose of this study is to verify the feasibility of purification of type O foot and mouth disease virus (FMDV) inactivated antigen with Gram-positive bacterial enhancer matrix (GEM) technology. [Methods] A dual functional molecular consisting of anchor protein gene and FMDV specific single domain antibody gene of type O FMDV were expressed in Escherichia coli, and the recombinant protein was named as VPA. The sedimentation named GEM-VPA was obtained with centrifugation following mixing the recombinant protein with GEM particles, and incubated at 37℃ for 30 min; GEM-VPA was mixed with FMDV antigen, and then the sedimentation was collected with low speed centrifugation after incubated at 37℃ for another 1 h, which was the purified antigen named GEM-FMDV. The feasibility for the method was evaluated with SDS-PAGE, Western-blot, protein quantification and 146S detection, and the immunogenicity for purified FMDV antigen was estimated with animal test. [Results] The dual functional protein designed in this study could be partly soluble when expressed in Escherichia coli. Moreever, this recombinant protein could bind with GEM particles and inactivated FMDV antigen at the same time. SDS-PAGE and Western-blot proved that the purified FMDV antigen existed in the sedimentation after centrifugation. Results from 146S determination indicated that the FMDV antigen recovery in this study could be above 99%, and the removal efficiency of the heterologous proteins from FMDV antigen was higher than 90%. More importantly, animals injected with the purified antigen developed more vigorous immune response and lesser side effect. [Conclusions] It is feasible for FMDV antigen concentration and purification with GEM technology.
Key words: GEM technology    foot and mouth disease virus    antigen purification   

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病, 主要感染猪、牛、羊、骆驼等偶蹄类动物。目前已经发现O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1 7个血清型, 各血清型之间没有交叉保护, 这就增加了口蹄疫防控的难度, 一旦爆发就会给养殖业带来严重的经济损失, 被世界动物卫生组织(OIE)列为通报性疫病和A类头号疫病[1-4]。在我国, 主要采用接种灭活疫苗的方式来控制该病。我国口蹄疫疫苗已形成规模化生产, 但大部分疫苗为粗制疫苗, 抗原含量低, 异源蛋白(细胞蛋白、牛血清蛋白、非结构蛋白、内毒素)含量在95%以上, 大面积接种存在较严重的副反应, 口蹄疫防治受到了影响[5-7]。因此, 在口蹄疫疫苗制造技术研究中, 大量研究人员投入到现有疫苗抗原浓缩纯化工艺改进上。

革兰氏阳性增强基质颗粒(Gram-positive bacterial enhancer matrix particles, GEM)表面展示系统(简称GEM技术)是国外近年发展起来的一种表面展示技术。该技术包括GEM颗粒和蛋白锚钩(protein anchor, PA)两个构件。GEM颗粒是乳酸菌经热酸煮沸处理, 去除了全部蛋白和核酸等物质后获得的球形细胞壁肽聚糖骨架[8]。蛋白锚钩是乳酸菌细胞壁上的自溶素, 含有3个自溶素基序(lysine motif, LysM), 每个基序大约由45个氨基酸组成, 彼此由间隔序列分开。蛋白锚钩通过LsyM实现与革兰氏阳性菌的肽聚糖特异性非共价结合, 所以利用蛋白锚钩可将外源蛋白——PA锚定在乳酸乳球菌表面[9-11]

纳米抗体是骆驼体内存在的天然缺失轻链及重链恒定区的抗体(HcAb), 通过克隆其可变区得到仅由1个重链可变区构成的单域抗体。1995年科学家们在一些软骨鱼类体内发现的新抗原受体(IgNAR)也是仅有1个重链构成的抗体后, 纳米抗体因其独特的天然小型化抗体而得到广泛应用。纳米抗体相对于常规抗体更小、更容易表达, 而与抗原的亲和力更强。本试验设计并表达锚钩蛋白与病毒特异性纳米抗体的融合蛋白(VPA), 通过GEM技术纯化口蹄疫病毒抗原。首先通过大肠杆菌表达系统表达出VPA, 再利用GEM、VPA与FMDV间的特异性结合活性, 形成GEM-VPA-FMDV复合物, 实现对复杂的FMDV纯化和浓缩, 并达到良好的免疫保护效果。

1 材料与方法 1.1 试验材料

表达载体pET32a (+)为国家兽用生物制品工程技术研究中心(简称:本中心)保存; 胶回收试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶和PCR试剂、pMD19-T及相关试剂购自于TaKaRa公司; 质粒提取试剂盒为Omega公司产品; E.coli DH5α、BL21 (DE3)感受态细胞购于BioMed公司; 锚钩蛋白与纳米抗体的融合基因为本中心设计(纳米抗体的制备及基因序列另文发表), 由南京金斯瑞生物科技有限公司合成; GEM颗粒由本中心乔绪稳制备; 兔抗锚钩蛋白的阳性血清由本中心乔绪稳制备, 系将锚钩蛋白原核表达、纯化后, 免疫SPF级实验兔所得; HRP标记的羊抗猪酶标抗体及HRP标记的羊抗兔酶标抗体为KPL公司产品; O型口蹄疫抗原由中农威特生物科技有限公司提供; 口蹄疫液相阻断抗体检测及146S定量试剂盒由中国农业科学院兰州兽医研究所提供; BAC蛋白定量试剂盒购自Thermo公司; 40~45日龄健康的试验仔猪(O型口蹄疫液相阻断抗体效价不大于3), 由丹阳云立生态牧业有限公司提供。

1.2 VPA基因的设计

将O型口蹄疫病毒的纳米抗体基因序列与锚钩蛋白基因序列利用linker连接, 按照大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化, 融合基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成, 克隆到pUC-57中, 命名为pUC-VPA

1.3 表达质粒pET-VPA的构建

VPA基因通过NcoⅠ与Hind Ⅲ克隆入原核表达载体pET-32a (+)中。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 涂布含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板, 挑取单个菌落接种LB液体培养菌扩大培养, 碱裂解法提质粒, 利用NcoⅠ与Hind Ⅲ双酶切鉴定, 阳性重组质粒命名为pET-VPA

1.4 重组蛋白表达鉴定

将正确的重组质粒pET-VPA转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞, 挑取阳性菌于5 mL LB培养基中, 37 ℃振荡培养14 h后, 按1:50的比例转接新鲜的5 mL含Amp的LB培养基中, 37 ℃振荡培养1.5~2 h, 测D600为0.5~0.6时, 15 ℃静置30 min后, 按1:1 000比例加入IPTG, 15 ℃振摇培养24 h; 取200 μL培养物12 000 r·min-1离心3 min, 弃上清液, 收集菌体, 用适量PBS重悬, 加50 μL 5×SDS上样缓冲液, 100 ℃金属浴10 min, 用120 g·L-1聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分析。

1.5 重组蛋白的可溶性分析

收获诱导后菌体进行超声波破碎, 对重组菌pET-VPA/BL21诱导前全菌、诱导后全菌、超声波破碎后上清液和破碎后沉淀进行SDS-PAGE鉴定。

1.6 重组蛋白的Western-blot鉴定

取诱导后的对照菌pET-32a (+)/BL21和重组菌pET-VPA/BL21用超声波破碎上清液和沉淀, 经SDS-PAGE电泳后转膜, 以抗锚钩蛋白的多抗抗体为一抗, 进行Western-blot鉴定。

1.7 GEM颗粒与重组蛋白VPA的结合及鉴定

从-80 ℃冰箱中取出1 U GEM颗粒, 用5 mL重组VPA重悬, 37 ℃缓慢振摇孵育30 min, 离心收集上清液与沉淀, 经SDS-PAGE电泳后转膜, 利用针对锚钩蛋白的多抗为一抗, 进行Western-blot鉴定。收集结合后的GEM-VPA沉淀, 9 000 r·min-1离心5 min; 弃上清液后加入含2.5% (体积分数)戊二醛的0.1 mol·L-1 PBS (pH7.2), 4 ℃固定2 h; PBS漂洗3次, 无水乙醇重复脱水2次, 透射电镜观察。

1.8 GEM-VPA与O型FMDV结合及鉴定

向1.7节中离心获得的GEM-VPA中加入灭活的FMDV抗原液, 按照每2.5×108个GEM-VPA颗粒加入1 mL含有10 μg 146S的比例进行。在37 ℃、70 r·min-1条件下摇床振荡孵育1 h后, 室温下6 000 r·min-1离心5 min, 收集上清液与沉淀, 进行Western-blot分析。同时对上清液中146S及总蛋白进行测定, 通过以下公式计算抗原纯化效率及回收效率。抗原纯化效率=纯化后上清液中总蛋白质量/纯化前总蛋白质量×100%;抗原回收效率= (纯化前146S质量-纯化后上清146S质量)/纯化前146S质量×100%。

1.9 GEM纯化口蹄疫抗原免疫原性鉴定

将纯化的口蹄疫抗原恢复到处理前体积, 按1:1的比例与206佐剂混合乳化, 制备疫苗, 免疫40~45日龄的口蹄疫抗体阴性的健康仔猪, 每头肌肉注射2 mL; 同时设立纯化前抗原对照与空白对照。免疫后28 d采血, 分离血清, 检测液相阻断抗体水平, 评价纯化抗原的免疫原性。

2 结果与分析 2.1 重组质粒pET-VPA酶切鉴定结果

构建的重组表达质粒pET-VPANdeⅠ与Hind Ⅲ双酶切, 酶切产物经10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色后在紫外线下可见约600 bp的目的条带, 表明重组表达质粒构建成功(图略)。

2.2 重组融合蛋白VPA表达产物的SDS-PAGE分析

图 1所示, 经SDS-PAGE电泳分析, 与对照菌pET-32a (+)/BL21相比, pET-VPA/BL21在相对分子质量约为27×103处明显多出1条蛋白条带, 与预期结果相符, 说明重组菌pET-VPA/BL21在IPTG诱导下成功获得表达。

图 1 VPA重组蛋白SDS-PAGE结果 Figure 1 SDS-PAGE analysis of the recombinant VPA protein 1.蛋白分子量标准Protein molecular marker; 2~5.IPTG诱导的重组菌pET-VPA/BL21 pET-VPA/BL21 induced with IPTG; 6.pET-VPA/BL21未诱导对照pET-VPA/BL21 uninduced.
2.3 VPA蛋白的可溶性分析

收获诱导后菌体进行超声波破碎, 对诱导后重组菌pET-VPA/BL21的全菌、超声波破碎后上清液和破碎后沉淀进行SDS-PAGE鉴定。结果如图 2所示, 诱导表达后重组菌pET-VPA/BL21的重组蛋白约有50%存在于上清液中。

图 2 重组蛋白的可溶性分析 Figure 2 Soluble analysis for the recombinant protein 1.蛋白分子量标准Protein molecular marker; 2.重组菌pET-VPA/BL21超声波破碎后沉淀pET-VPA/BL21 lysate precipitation after supersonic schizolysis; 3.重组菌pET-VPA/BL21超声波破碎后上清液pET-VPA/BL21 lysate supernatant after supersonic schizolysis; 4.经IPTG诱导的重组菌pET-VPA/BL21全菌pET-VPA/BL21 whole bacteria after IPTG induction; 5.BL21空白对照Blank BL21 control.
2.4 GEM颗粒与重组VPA蛋白的结合及鉴定

将可溶性重组VPA与GEM颗粒结合, 离心收集结合后的沉淀和结合后的上清液进行SDS-PAGE和Western blot分析, 结果(图 3)表明大部分VPA蛋白都与GEM结合存在于沉淀中。

图 3 GEM与VPA结合后SDS-PAGE电泳图(A)与Western-blot (B)鉴定结果 Figure 3 SDS-PAGE electrophoretic map and Western-blot identification of combinationbetween GEM particles and VPA protein A1、B3:GEM结合重组蛋白VPA后的离心上清液Supernatant of GEM particles combined with VPA protein; A2、B2:GEM结合重组蛋白VPA后的离心沉淀Precipitation of GEM particles combined with VPA protein; A3、B4:重组菌pET-VPA/BL21超声波破碎后的上清液pET-VPA/BL21 lysate supernatant after supersonic schizolysis; A4、B1:蛋白分子量标准Protein molecular marker.
2.5 GEM颗粒与VPA蛋白结合的电镜观察

取VPA蛋白与GEM颗粒结合后的离心沉淀, 经体积分数为2%的戊二醛固定后制备样品, 利用透射电镜观察。结果如图 4所示:与GEM颗粒比较, 结合VPA蛋白后GEM-VPA表面显得粗糙, 有明显大量细小絮状物固定于其表面。

图 4 GEM颗粒与VPA蛋白结合后电镜观察 Figure 4 Transmission electron microscopic images for the combination between GEM and VPA protein A.空白GEM颗粒Blank GEM particles; B.GEM颗粒结合VPA蛋白GEM particles combined with the VPA protein.
2.6 GEM-VPA与O型FMDV结合的鉴定结果 2.6.1 Western-blotting分析

图 5所示:GEM-VPA结合O型FMDV病毒后离心沉淀与猪抗O型FMDV多抗反应为阳性, 且无非特异性条带; 而结合后离心上清液不能与猪抗O型FMDV阳性血清反应, 说明GEM-VPA能与O型FMDV特异性结合, 通过两步离心后存在于沉淀中。

图 5 GEM-VPA与O型FMDV结合的Western-blot分析 Figure 5 Western-blot analysis of the combination between GEM-VPA complex and FMDV antigen 1.蛋白分子量标准Protein molecular marker; 2.GEM结合重组蛋白VPA后离心沉淀Precipitation of GEM particles combined with VPA protein; 3.O型FMDV纯化前Type O FMDV antigen before purification; 4.GEM-VPA与O型FMDV结合后的离心上清液Supermatant of GEM-VPA complex combined with type O FMDV antigen; 5.GEM-VPA与O型FMDV结合后的离心沉淀Precipitation of GEM-VPA complex combined with type O FMDV antigen.
2.6.2 FMDV 146S的测定结果

利用双抗体夹心ELISA试剂盒测定纯化前、后离心上清液中FMDV 146S的含量来评价上清液中残留FMDV数量。由图 6可见:纯化后离心上清液中的FMDV 146S含量接近0, 根据公式计算得出抗原液中FMDV回收率为99%。

图 6 纯化前、后离心上清液中FMDV 146S的检测结果 Figure 6 Results of 146S detection for FMDV antigenbefore and post purification 1.纯化前口蹄疫病毒FMDV before purification; 2.纯化后口蹄疫病毒上清液Supernatant of FMDV post purification; 3.纯化后口蹄疫病毒沉淀Precipitation of FMDV post purification.
2.6.3 纯化后上清液中总蛋白含量

利用BCA法测定抗原纯化后离心上清液中总蛋白含量, 来评价纯化抗原的纯度。由图 7可见:纯化后离心上清液中总蛋白含量与未纯化抗原基本一致。由此可知来源于FMDV培养过程中的杂蛋白并没有随FMDV与GEM-VPA被离心到沉淀中, 而是存在于纯化后的离心上清液中, 通过公式计算得出抗原纯化效率达到90%。

图 7 纯化前、后上清液总蛋白含量检测结果 Figure 7 Results of total protein detection for FMDVantigen before and post purification 1.纯化前口蹄疫病毒FMDV before purification; 2.纯化后口蹄疫病毒上清液Supernatant of FMDV post purification.
2.7 GEM-VPA-FMDV免疫抗体检测结果

图 8可见:试验猪免疫后28 d, 2个免疫组的抗体水平明显升高, 表明抗原的浓缩纯化过程并没有对抗原的免疫原性产生不良影响, 并且由于GEM颗粒本身具有免疫增强作用, 所以纯化抗原免疫组抗体水平及抗体合格率均明显高于未处理抗原免疫组。

图 8 疫苗免疫后液相阻断抗体检测结果 Figure 8 Result of liquid phase blocking ELISAantibody detection post vaccination
3 讨论

FMDV本身抗原性较差, 病毒灭活后对其抗原性影响较大, 在生产FMDV灭活疫苗, 尤其是多价疫苗时, 如何保证单位剂量内抗原含量是关键问题。为保证疫苗的免疫效力, 通常采用浓缩抗原的办法, 但浓缩的同时, 往往将非目的蛋白也浓缩了, 导致不良反应增加。尤其是在多价联苗中, 每种抗原都需要进行浓缩, 细胞杂蛋白的含量较之单苗更高, 疫苗免疫副反应更强。同样, 为降低不良反应而对疫苗进行纯化时, 常规方法的缺点是有效抗原在纯化过程中损失太大, 不良反应降低但疫苗免疫效果也降低了, 所以, 抗原处理工艺的选择特别重要, 146S是FMDV灭活疫苗免疫原性起决定性作用的抗原, 比较脆弱, 容易因破碎或裂解, 而导致免疫原性丧失或下降[12]

适于大规模浓缩纯化疫苗(抗原)的传统工艺有:氯仿处理去除细胞碎片和变性蛋白; 氢氧化铝吸附抗原形成复合物进而沉淀达到纯化目的; 应用中空纤维系统和盒式系统进行超滤浓缩抗原; 聚乙二醇(PEG)和聚乙烯氧化物(PEO)沉淀方法去除杂蛋白达到浓缩抗原目的。阿根廷等南美许多国家, 口蹄疫疫苗主要通过膜过滤澄清和中空纤维浓缩达到纯化的目的。这些工艺能够很好地浓缩抗原, 去除大部分杂蛋白, 制备疫苗的纯度和性状能符合规程要求, 但存在成本较高、抗原回收率低、操作繁琐且周期长、技术设备要求高的缺点[13-17]

本试验建立了GEM技术纯化FMDV病毒方法, 相比于其他纯化FMDV抗原的方法如超滤离心纯化法具有以下优点:特异性强, 因为含有特异性的FMDV纳米抗体, GEM-VPA可与FMDV病毒特异性地结合; 操作过程简单、快速, 仅通过短时间的低速离心即可除去细胞和培养的杂蛋白(如BSA)、核酸、脂类、多糖等异源物质, 得到的沉淀是纯化后的FMDV病毒, 实现一步纯化; 可控性强, 在GEM颗粒载量允许的情况下, 根据加入FMDV与重悬沉淀GEM-FMDV所用PBS的体积比, 对纯化后的FMDV病毒按随意比例进行浓缩, 完全满足制备疫苗对病毒含量的要求; 成本低, GEM颗粒制备简单, VPA融合蛋白利用的是大肠杆菌表达系统, 表达量高。但是, 还有很多方面需要深入研究, 如对GEM颗粒与VPA的结合比例以及GEM-VPA与FMDV结合达到饱和比例的摸索, 以推测GEM颗粒上最大FMDV病毒负载量, 这关系着后续能否将此纯化方法应用于大规模生产。除此之外, VPA蛋白的活性也影响着该纯化方法的效率, 因此, 对VPA融合蛋白基因进行优化, 以实现融合蛋白的高产、可溶性表达, 也是后续研究的重要方向。

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