南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (1): 132-139   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201612007
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文章信息

韩乐, 张国敏, 杨花, 庞静, 万永杰, 姚晓磊, 王锋, 张艳丽
HAN Le, ZHANG Guomin, YANG Hua, PANG Jing, WAN Yongjie, YAO Xiaolei, WANG Feng, ZHANG Yanli
山羊睾丸支持细胞的培养与双荧光自噬报告载体的建立
Goat testis sertoli cell culture and autophagy dual-fluorescence reporter system construction
南京农业大学学报, 2018, 41(1): 132-139
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(1): 132-139.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201612007

文章历史

收稿日期: 2016-12-05
山羊睾丸支持细胞的培养与双荧光自噬报告载体的建立
韩乐1 , 张国敏2 , 杨花1 , 庞静1 , 万永杰1 , 姚晓磊1 , 王锋1 , 张艳丽1     
1. 南京农业大学动物科技学院/江苏省家畜胚胎工程实验室, 江苏 南京 210095;
2. 南京农业大学动物医学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本试验旨在建立一个实时追踪山羊细胞自噬发生状况的工具,以探讨细胞自噬对睾丸支持细胞(SC)和生殖细胞的影响。[方法]通过PCR法扩增mCherry-EGFP-LC3基因序列1 884 bp,将其导入真核表达载体pEX-3中,得到重组质粒pmCherry-EGFP-LC3;将pmCherry-EGFP-LC3及对照质粒pEX-3分别转染体外分离培养的山羊SC,饥饿处理12 h后用荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达,用RT-qPCR和Western blot检测细胞中自噬相关基因和蛋白表达变化,用透射电镜观察细胞自噬体的形成。[结果]成功构建了双荧光自噬报告载体,该载体能在山羊SC中表达,荧光显微镜下可见绿色荧光和红色荧光表达;饥饿处理后,该载体可以指示细胞中自噬泡的形成过程,且细胞自噬相关标记Beclin1 mRNA以及LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA比值和蛋白水平均显著上调,并能观察到初始自噬体的形成。[结论]获得的山羊SC可以作为后续试验的细胞模型;构建的双荧光pmCherry-EGFP-LC3自噬报告载体可为进一步研究山羊SC的自噬发生提供有效的工具。
关键词自噬   睾丸支持细胞   微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3)   山羊   
Goat testis sertoli cell culture and autophagy dual-fluorescence reporter system construction
HAN Le1, ZHANG Guomin2, YANG Hua1, PANG Jing1, WAN Yongjie1, YAO Xiaolei1, WANG Feng1, ZHANG Yanli1    
1. College of Animal Science and Technology/Jiangsu Livestock Embryo Engineering Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] This study aims to establish a real-time tool to investigate the goat cell autophagy, and to further explore the cell autophagy effect on testis sertoli cells (SC) and germ cells. [Methods] mCherry-EGFP-LC3 gene sequence were amplified by PCR, which was 1 884 bp and inserted into pEX-3 eukaryotic expression vector, then a recombinant plasmid pmCherry-EGFP-LC3 was constructed.The pmCherry-EGFP-LC3 and control plasmid pEX-3 were transfected into in vitro isolated goat testis sertoli cells, respectively, and the cells were then starved for 12 h, fluorescent microscope was used to observe fusion protein expression in cells, RT-qPCR and Western blot were used to detect cell autophagy related gene and protein expression changes, and the formation of cell autophagy body was further detected by TEM. [Results] The double fluorescent autophagy report plasmid were successfully constructed, which can be expressed in goat testis sertoli cells, green and red fluorescence can be detected under fluorescence microscopy, after starvation, the construct could indicate the formation process of autophagy bubbles in the cell, and autophagy related markers Beclin1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio of mRNA and protein levels were all significantly higher than those of the non-starved group, and the initial formation of autophagy body was also observed. [Conclusions] In total, the double fluorescent autophagy reporter vector constructed in this study can provide an effective tool for the further study of autophagy of goat SC.
Key words: autophagy    testis sertoli cell    microtuble-associated protein Ⅰ light chain 3(LC3)    goat   

睾丸支持细胞(sertoli cell, SC)是雄性动物睾丸曲细精管内唯一的体细胞, 可以维持和调节正常的生精过程[1]。自噬是一种广泛存在于真核细胞中的生命现象, 是细胞对持续性内外刺激的非损伤性应答反应, 以此来维持细胞结构、代谢和功能的平衡。维持内环境的稳态, 且在营养物质缺乏的情况下重新动员营养物质, 是细胞保持稳定状态的管家机制[2-4]。研究表明, 睾丸支持细胞中自噬发生程度非常高, 其通过降解异常的大分子蛋白以及受损或老化的细胞器, 为细胞提供营养物质及能量, 促进细胞自我更新。因此自噬对维持睾丸支持细胞自我增殖及对维持精子的持续发生具有重要意义[5-6]

自噬主要通过一组高度保守的自噬相关蛋白(ATG蛋白)来调控, 如微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3), 其作为自噬溶酶体上的标志蛋白, 可以用来检测自噬的发生[7]。细胞内存在2种形式的LC3蛋白:LC3Ⅰ和LC3Ⅱ, LC3Ⅰ在胞浆内弥散分布, LC3Ⅱ聚集于自噬体膜上。Kabeya等[8]发现, LC3Ⅱ在自噬体和自噬前体的内外膜特异表达, 且LC3Ⅰ的表达与自噬结构的形成成正比, 因此常用GFP-LC3作为自噬体的标志物, 观察活细胞的自噬活动。通过免疫荧光方法检测自噬诱导后的细胞时, 发现内源性LC3或转染GFP-LC3融合蛋白表达点状聚集增多[7-8]。理论上, 观察到点状聚集的数目即为自噬体的数量, 根据点状聚集的密集程度可以判断细胞自噬的情况[9]。但是GFP在酸性条件下会发生荧光淬灭, 不利于观察自噬溶酶体, 而红色荧光蛋白(red fluorescent protein, RFP)对pH值变化不敏感, pH值为4.5~12时仍保持稳定, 可弥补GFP的不足, 因此, RFP-GFP-LC3融合蛋白优于GFP-LC3融合蛋白[10]

本试验旨在构建山羊自噬相关基因LC3的真核表达载体pmCherry-EGFP-LC3, 用荧光显微镜观察双荧光pmCherry-EGFP-LC3融合蛋白的变化, 动态监测支持细胞的自噬过程, 为进一步研究自噬在山羊睾丸支持细胞中的作用及发生机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

山羊睾丸组织采自江苏金盛山羊繁育技术发展有限公司的1月龄海门山羊。大肠杆菌DH5α为南京农业大学动物胚胎工程技术中心保存。反转录试剂、LA Taq酶、T4 DNA连接酶、DNA标准品和各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司。DNA凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自Axygen公司。无内毒素质粒提取试剂盒购自Omega公司。细胞RNA提取试剂盒购自天根公司。细胞基本培养基(DMEM/F12)、胎牛血清、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素、链霉素均购自Gibco公司。Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司。引物合成和基因测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 方法 1.2.1 山羊SC的分离培养

取睾丸组织, 用眼科剪依次剥除被膜、白膜, 完全暴露曲精细小管。在实体显微镜下将盘曲的曲精细小管剥开并使之呈絮状, 用DPBS清洗曲精细小管3次。用含有1 mg·mL-1胶原酶Ⅳ和250 μg·mL-1 DNase Ⅰ的DMEM/F12 (D/F12)在37 ℃下作用30 min, 2.5 g·L-1胰酶消化曲精细小管20 min, 加入细胞培养液终止消化, 70 μm滤网过滤消化后的细胞, 然后加入含10% (体积分数)胎牛血清的D/F12培养液, 按照5×105 mL-1接种到25 cm2培养瓶, 37 ℃、5% CO2、100%湿度条件下培养4 h, 弃去未贴壁细胞。如果细胞内杂细胞较多, 则在细胞长满后进行细胞传代培养。采用接种4 h后更换培养液的方法对细胞进行纯化。取培养的第2代山羊SC, 经2.5 g·L-1胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化制成细胞悬液, 计数后以每孔1.0×104 mL-1的量接种于24孔培养板培养。每处理3个重复孔, 连续计数7 d, 绘制生长曲线。

1.2.2 山羊SC的鉴定

提取细胞总RNA, 逆转录合成cDNA, 根据NCBI中的Primer Blast软件设计山羊Fas配体(Fas ligand, FASL)、抑制素(inhibin)、雄激素结合蛋白(androgen-binding protein, ABP)基因的引物序列(表 1), PCR鉴定山羊SC特异基因的表达情况。

表 1 本试验所用PCR引物序列 Table 1 Primer sequence of PCR in this study
基因
Gene
GenBank登录号
Accession number
引物对序列(5′→3′)
Primer pairs sequences
产物大小/bp
Product size
退火温度/℃
Annealing temperature
FASLKJ136647.1AGCGGCTCATTTAACAGGCA/CCATGTCCTGGGGGTACCTA23360
ABPXM_013970555.1TGGCCTGCCCTATGTTTAGTG/TGTCATCAAATCCCGCCTCAT15660
TransferrinXM_005675058TGCCAGTCCGCTGTTGTATT/CAGCTGAGGAACTTGTCCGT25960
InhibinXM_005676598TTTTGTTGGCGAGTTGCTGG/TTCATTTCTGCCCTCCGTCC31660
LC3XM_013968932.1TGTCAACATGAGCGAGTTGGT/GCTCGTAGATGTCCGCGATG13160
GAPDHXM_005680968.1AACGTGTCCGTTGTGGATCT/GAGTGTCGCTGTTGAAGTCG15760
1.2.3 重组质粒pmCherry-EGFP-LC3的构建

用引物对5′-CCGAATTCATGCCCTCAGACCGGCCTTTCA-3′/5′-GTCTGAGGGCATGAATTCGGTACCGGATCTGAGTC-3′扩增mCherry-EGFP-LC3序列片段, 再利用引物对5′-CTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATG-3′/5′-GCCGATACCGGTGATGGATCCTCAGAAGCCGAAGG-TTTCCTG-3′克隆pEX-3载体上EcoRⅠ和BamHⅠ两侧同源序列。利用ClonExpress® Entry One Step Cloning Kit将扩增回收好的片段重组克隆到线性化pEX-3载体中。

将重组连接产物转化感受态细胞, 取200 μL培育后的细胞均匀涂布于含50 μg·mL-1 Kanamycin的LB平板上, 倒置于37 ℃培养箱中, 培养16 h。从平板上挑取克隆菌落, 提取质粒并鉴定后挑出阳性克隆。将抽提好的质粒进行37 ℃ 1 h双酶切鉴定, 酶切产物经电泳得到的目的条带即为阳性克隆。取200 μL阳性克隆对应的菌液送交测序, 并将剩余的菌液用甘油保存。将测序结果与目的基因序列进行比对。将获得正确连接的质粒命名为pmCherry-EGFP-LC3

1.2.4 pmCherry-EGFP-LC3导入山羊SC后的饥饿诱导

当细胞汇合80%~90%时, 按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书的方法将空质粒pEX和重组质粒pmCherry-EGFP-LC3分别转染SC。转染6 h后, 将培养液换为含10%胎牛血清和青霉素、链霉素各100 U·mL-1的D/F12, 继续培养24 h后, 对pmCherry-EGFP-LC3质粒转染组一部分细胞进行饥饿诱导12 h (记为LC3-S组), 另一部分正常培养(记为LC3组), 对照组为其对应空载体转染正常培养组(pEX组)。荧光显微镜观察各组pmCherry-EGFP-LC3聚集成点状特征的自噬小体。

1.2.5 饥饿诱导后SC的生物学特性和自噬基因表达水平的检测

按照Trizol说明书提取收集SC的总RNA, 然后进行反转录(RT)。各目的基因见表 1。实时荧光定量PCR(qPCR)反应体系(20 μL):ddH2O 7.8 μL, 上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.6 μL, 模板1 μL, SYBR Green Master Mix 10 μL, 混匀离心后在荧光定量PCR仪(Stepone plus, ABI公司)上反应检测。反应程序如下:95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40个循环; 72 ℃10 min。反应结束后绘制熔解曲线, 利用2-ΔΔCT法对mRNA表达进行相对定量。以GAPDH基因作为内参基因。

1.2.6 自噬体的透射电镜检测

细胞处理后, 用DPBS清洗3次, 800 g离心10 min, 弃上清液后缓缓加入1 mL 2.5% (体积分数)戊二醛进行前固定, 加锇酸后固定, 包埋, 修块后进行超薄切片, 在透射电镜下观察细胞的超微结构[11]

1.2.7 Western blot法分析蛋白的表达

使用RIPA蛋白裂解液提取SC总蛋白。将抗LC3蛋白体抗1:500稀释, 抗Beclin1蛋白抗体1:500稀释, 以β-actin作为内参蛋白(1:1 000稀释), 按照Western blot的试验步骤检测蛋白的表达情况[12]

1.3 数据的统计与分析

每个试验至少重复3次, 所有试验数据使用平均值±标准误(x±SE)表示。利用SPSS 18.0统计软件中的单因素方差分析对试验结果进行方差分析和差异显著性检验。

2 结果与分析 2.1 山羊SC的分离培养与鉴定

采用联合酶消化法得到山羊SC原代细胞, 差异贴壁纯培养(图 1-A)48 h后消化传代, 可见形态不规则、胞体较大、两侧有2个或多个突起、折光性较强的睾丸支持细胞(图 1-B)。RT-qPCR结果显示FASLInhibinABP基因在山羊睾丸和山羊SC中均有表达, 而在山羊肌肉中均不表达(图 1-C)。第二代SC生长状态良好, 生长曲线显示群体倍增从第3天开始, 5 d达到增殖高峰, 整体呈现“潜伏期—对数生长期—平台期”生长趋势(图 1-D)。

图 1 山羊睾丸支持细胞的培养与鉴定 Figure 1 Culture and identification of goat testis sertoli cell (SC) A.酶消化法原代培养山羊睾丸SC; B.纯化后的SC; C. RT-qPCR结果:泳道1至3分别为SC、睾丸组织、肌肉组织; D. SC生长曲线。 A. Primary culture of goat testis SC; B. Purified SC; C. RT-qPCR results of Inhibin, FASL, ABP, and GAPDH expression in SC, testis and muscle tissue, respectively; D. The growth curve of SC.
2.2 双荧光自噬报告载体pmCherry-EGFP-LC3的构建及鉴定

用qPCR方法得到mCherry-EGFP-LC3目的片段大小为1 884 bp (图 2-A), 切胶回收连接到载体pEX-3中, 成功连接的载体经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切, 可得到4 012 bp和1 884 bp片段(图 2-B), 条带大小与理论值一致。进一步测序显示mCherry-EGFP-LC3序列与已知序列相同(图 2-C)。说明pEX-3-mCherry-EGFP-LC3重组质粒构建成功(图 2-D), 命名为pmCherry-EGFP-LC3

图 2 双荧光自噬报告载体pmCherry-EGFP-LC3的构建及鉴定 Figure 2 Construction and identification of pmCherry-EGFP-LC3 A. mCherry-EGFP-LC3全长基因扩增:1. mCherry-EGFP-LC3基因, M. DL10 000 DNA marker; B.重组质粒的EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定:1. pmCherry-EGFP-LC3, M. DL10 000 DNA marker; C. mCherry基因与pEX-3载体3′连接处的测序; D. pmCherry-EGFP-LC3载体示意图。 A. mCherry-EGFP-LC3 full length gene amplification, Lane1 is mCherry-EGFP-LC3 full length gene, M is DL10 000 DNA marker; B. Restriction enzymatic digestion of pmCherry-EGFP-LC3, Lane1 is pmCherry-EGFP-LC3 digested by EcoRⅠand BamHⅠ, M is DL10 000 DNA marker; C. DNA chromatogram of the sequence at the linking position between 3′goat β-casein gene promoter and the mCherry gene coding sequence; D. DNA construction for pmCherry-EGFP-LC3.
2.3 饥饿诱导后山羊睾丸支持细胞自噬泡的形成

将pmCherry-EGFP-LC3质粒和空载体pEX转染山羊SC 24 h后, 在倒置荧光显微镜下观察细胞的转染情况(图 3-A)。结果显示:pEX组有明显的绿色荧光, LC3转染组有微弱的绿色和红色荧光。饥饿诱导处理12 h后, 可观察到SC表达绿色和红色荧光(图 3-C), 这进一步验证了所构建报告载体的正确性; 饥饿处理LC3-S组在红、绿合成图像中黄色亮点(自噬体)和红色亮点(自噬溶酶体)均明显多于LC3组(图 3-B), 从LC3-S组红色框内放大后的成像(图 3-C)中明显看到荧光呈点簇状分布。结果表明饥饿诱导了细胞自噬的发生, 且pmCherry-EGFP-LC3载体红、绿荧光的强弱可用于监测细胞的自噬水平。

图 3 山羊睾丸支持细胞中pmCherry-EGFP-LC3的表达 Figure 3 The expression of pmCherry-EGFP-LC3 in SC A.转染后诱导培养24 h细胞中pmCherry-EGFP-LC3的表达; B.继续正常培养12 h; C.转染后, 饥饿诱导培养12 h细胞中pmCherry-EGFP-LC3的表达。 A.pmCherry-EGFP-LC3 fluorescence was detected at 24 h post transfection; B. Continue to normal culture for 12 h; C. Transgenic SC, starved 12 h pmCherry-EGFP-LC3 fluorescence was detected.
2.4 饥饿诱导后山羊SC标记基因和自噬相关基因的表达

本试验进一步从mRNA、蛋白水平以及自噬体的形成等方面检测了饥饿诱导后山羊SC标记基因和自噬相关基因的表达情况。如图 4-A所示:SC的标记基因FASLTransferrin在LC3-S组中的表达量显著低于其在LC3组和pEX组中的表达量(P < 0.05), 而在pEX和LC3两组间差异不显著; 细胞自噬基因LC3在LC3-S组中表达最高, 在pEX组中表达最低, 且均较LC3组差异显著(P < 0.05)。蛋白表达水平检测结果显示:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值从小到大依次为pEX组、LC3组、LC3-S组, 且差异均显著(P < 0.05);Beclin1表达结果也进一步显示, LC3-S组的表达水平显著高于pEX组和LC3组(P < 0.05) (图 4-B4-C)。透射电镜结果显示:LC3-S组含有较多的初始自噬体(图 4-D)。上述结果表明, 本试验所构建的双荧光pmCherry-EGFP-LC3载体可以监测细胞自噬的发生。

图 4 饥饿诱导后山羊睾丸支持细胞自噬相关基因及蛋白的表达和自噬体的形成 Figure 4 The expression level of autophagy related genes and proteins, and formation of autophagosomesin goat testis SC after starvation induction 1) A. FASLTransferrinLC3 mRNA相对表达量; B. LC3、Beclin1蛋白的表达; C. LC3、Beclin1蛋白的峰值分析; D.饥饿诱导后山羊睾丸支持细胞自噬体(箭头示)的形成。2) A和C图中不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 1) A. Relative expression of gene on mRNA level; B. Western blot of LC3, Beclin1;C. Histograms show the protein expression levels of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, Beclin1;D. Representative TEM depicting ultrastructure of autophagy in goat SC. 2) The different small letters mean significant difference at 0.05 level.
3 讨论

睾丸支持细胞作为生精细胞的“保姆细胞”, 为精子提供营养支持、骨架支撑及免疫屏障, 支持细胞的数目及其结构和功能决定着动物个体的繁殖能力和生精效率[13]。目前已明确:自噬的主要功能之一是在细胞受到应激性刺激等死亡威胁时保持细胞的存活, 这是真核细胞维持稳态、实现更新的一种重要进化保守机制。SC能够分泌FASL[13]、Inhibin[14]和ABP[15], 它们在雄性生殖中起着至关重要的作用, ABP和Inhibin等已经被广泛用作衡量SC功能的标志。本试验采用复合酶消化法分离得到山羊睾丸SC原代细胞, 并能检测到FASLInhibinABP的表达, 这与前人研究结果一致[16], 符合支持细胞的特征。

目前, 可以诱导自噬发生的因素很多, 其中环境因素引发自噬主要是细胞受到饥饿和低氧刺激。饥饿是诱导自噬的经典方法。由于胞内营养成分不足, 细胞就会将相对于维持细胞生存冗余的蛋白质等大分子物质通过自噬途径进行降解, 并重新利用这些小分子合成维持生命所必需的新物质[17]。本试验结果表明, 自噬也存在于SC中, SC经饥饿诱导后产生自噬体。细胞自噬发生后, 会产生大量包裹衰老受损细胞器的自噬泡。LC3Ⅱ定位于前自噬泡和自噬泡膜表面, 是自噬泡膜的特异性标志物。利用GFP与LC3形成融合蛋白特异性定位自噬泡, 从而实时监测细胞自噬的进程这已成为研究细胞自噬的重要方法[6-8]。相比目前常用的单荧光GFP-LC3, 双荧光mRFP-EGFP-LC3体系是更可靠的自噬定量分析方法, 该体系最大的优点是RFP红色荧光不易在溶酶体酸性环境下降解, 可以直接地观察自噬性囊泡的自噬体和自噬溶酶体阶段。

本试验将构建的pmCherry-EGFP-LC3自噬报告载体转染正常和经饥饿诱导处理的山羊睾丸SC后, 可以观察到荧光的表达, 绿色和红色荧光的表达说明报告载体的正确性[10, 18]。经饥饿处理的山羊睾丸SC绿色斑点和红色斑点均明显多于对照组, 说明自噬小体形成增多; 红色斑点多于绿色斑点, 是由于自噬体与溶酶体融合绿色荧光淬灭所致, 表明自噬体与溶酶体融合路径通畅, 这与饥饿可诱导自噬的结果相符[19-21]。本试验中, 分别拍摄红色激发光和绿色激发光下的自噬性斑点, 用图片软件合并后, 显示黄色的自噬性斑点代表自噬体, 显示红色的斑点则代表自噬溶酶体, 更为直观地显示山羊睾丸SC自噬通路不同阶段的特征性自噬囊泡, 这说明本试验所构建的山羊双荧光pmCherry-EGFP-LC3载体可以用于动态监测细胞自噬的发生。

Beclin1是细胞自噬的重要正调节因子, 主要通过与Class Ⅲ PI3K形成复合物促进自噬发生, 其表达水平与细胞自噬密切相关[4, 22]。LC3是自噬过程中关键的调控蛋白, 对于自噬泡的形成起着关键作用[23]。LC3Ⅱ与LC3Ⅰ蛋白的比值常作为检测细胞自噬是否启动的重要指标[6-7, 24]。细胞发生自噬时, 细胞质中产生呈非球形、扁平状和不断扩张的碗状双层膜结构, 此种在扫描电镜下可观察到的双层膜结构被作为指示自噬发生的金标准[7]。本研究免疫印迹结果显示:经过饥饿处理后的山羊睾丸SC中Beclin1蛋白表达水平比正常培养时明显提高, LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化也明显增加。利用饥饿处理细胞可诱导自噬产生, 进而观察自噬细胞中自噬泡的形成[25], 同Karim等[24]的研究结果一致。

综上所述, 本试验首次成功构建了带mCherryGFP标签的山羊LC3重组质粒, 将其转染至体外分离培养的山羊睾丸SC中, 表达mCherry-GFP与LC3的融合蛋白。正常情况下, 可见到胞质中均匀分布的绿色荧光蛋白, 而在自噬发生后, 可以观测到呈点簇状分布的自噬小体的形成。这为进一步研究自噬在雄性支持细胞中的发生以及机制奠定了基础。

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