南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (1): 57-63   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201705001
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石利朝, 曾爱松, 李家仪, 王金香, 宋立晓, 严继勇
SHI Lichao, ZENG Aisong, LI Jiayi, WANG Jinxiang, SONG Lixiao, YAN Jiyong
牛心甘蓝蜡粉缺失突变体410M特征的研究
Studies on characteristics of a heart-shaped glossy cabbage mutants 410M
南京农业大学学报, 2018, 41(1): 57-63
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(1): 57-63.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201705001

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收稿日期: 2017-05-02
牛心甘蓝蜡粉缺失突变体410M特征的研究
石利朝1,2 , 曾爱松2 , 李家仪3 , 王金香1,2 , 宋立晓2 , 严继勇2     
1. 南京农业大学园艺学院, 江苏 南京 210095;
2. 江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室, 江苏 南京 210014;
3. 中国农业大学生物学院, 北京 100083
摘要[目的]本文旨在探索牛心甘蓝蜡粉缺失突变体410M的特征和实际应用价值,以丰富甘蓝种质资源,加速新品种创制和改良。[方法]调查牛心甘蓝野生型材料410W和蜡粉缺失突变体410M的农艺性状,测定其营养品质;扫描电镜观察其叶表超微结构;以蜡粉缺失突变体材料410M(P1)与其野生型410W(P2)为亲本分别配制6世代群体,分析410M蜡粉缺失性状的遗传规律;筛选出14个在拟南芥中参与蜡粉合成、转运的基因,并利用实时荧光定量PCR对其在410W和410M中的表达模式进行分析。[结果]蜡粉缺失甘蓝叶色亮绿,突变体410M球叶和外叶的维生素C含量显著高于野生型;其他表型及主要营养成分与野生型无明显差异。叶表超微结构观察显示,突变体叶表面光滑,蜡粉严重缺失;野生型叶表蜡粉分布致密,晶体结构主要为片状和线状。对6世代群体分离比例进行χ2检测,结果表明410M蜡粉缺失性状为隐性单基因遗传。在参与拟南芥蜡粉生物合成、转运的14个基因中,共有7个基因在野生型中的表达显著高于突变体。[结论]蜡粉缺失突变体410M遗传稳定,商品性好,为育种和蜡粉分子基础研究的优良材料。
关键词甘蓝   蜡粉缺失突变体   农艺性状   超微结构   遗传规律   蜡粉基因   
Studies on characteristics of a heart-shaped glossy cabbage mutants 410M
SHI Lichao1,2, ZENG Aisong2, LI Jiayi3, WANG Jinxiang1,2, SONG Lixiao2, YAN Jiyong2    
1. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014, China;
3. College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100083, China
Abstract: [Objectives] To enrich the germplasm resources and promote the improvement of new varieties with desirable traits of cabbage, a heart-shaped glossy mutant 410M of cabbage was studied. [Methods] The major nutritional components and phenotypic characterization of 410M plants were analyzed, and the wax amount and crystal structure were observed by scanning electron micrographs(SEM). Then, to study the inheritance of glossy wax-less characteristic, F1, F2, BC1P1 and BC1P2 populations were obtained through crossing, selfing and back-crossing by 410M(mutant) and 410W(wild) plants. Lastly, the transcriptional profiles of 14 genes that were related to wax biosynthesis and transport in Arabidopsis were analyzed by real-time quantitative RT-PCR. [Results] 410M plants had a remarkable glossy surface phenotypic trait throughout their growth and development, and other phenotypes were indistinguishable from those of 410W. There were no significant differences in content of the major nutritional components including protein, crude fiber, total sugar and dry matter between 410M and 410W except vitamin C content. The SEM analysis revealed a significant difference in the total wax amount between 410M and 410W plants, and the surface of mature leaves of 410W was covered by dense linear or columnar wax crystals on both the ventral and abaxial of the leaf blade. Conversely, the mature leave surface of 410M was almost devoid of wax crystals, with only a small portion of granule-like wax crystals present on the smooth wax film. Then, the F1s indicated that non-glossy leaves were dominant over glossy leaves. The genetic ratio of 3 non-glossy to 1 glossy was obtained in F2 generations, and the back-cross generation involving a glossy parent as the recurrent parent showed a ratio of 1 non-glossy to 1 glossy. So, the results ofχ2 test on the separated proportion proved that the trait of glossy wax-less was controlled by one pair of recessive gene. Lastly, our work also showed that some genes that were involved in wax biosynthesis, and export pathways were down-regulated in 410M, which could cause the glossy phenotype of mutant plants. [Conclusions] 410M exhibited excellent comprehensive properties with remarkable and stable glossy phenotype, and belongs to a core heart-shaped parent for future cabbage breeding programs and molecular studies.
Key words: cabbage    glossy mutant    agronomic trait    ultrastructure    inheritance    wax genes   

结球甘蓝(Brassica oleraca L. var. capitata)简称甘蓝, 是十字花科芸薹属甘蓝种中的一个变种。其叶色绿至深绿, 外叶及外层球叶表面均有一层蜡粉覆盖。蜡粉的主要作用是减少非气孔的水分散失, 降低水分消耗[1], 保护植物抵御过量紫外线辐射、低温冻伤等逆境[2-3], 还可有效抵御细菌和真菌病原体的入侵, 防止食草昆虫的侵害等[4-5]。同时, 甘蓝植株表面的蜡粉多少还是决定商品品质的一个重要指标。蜡粉少的甘蓝叶色亮绿, 感官好, 品质优良, 受到消费者欢迎。亮叶甘蓝由普通甘蓝突变而来, 体表无或有少量蜡粉覆盖, 叶色亮绿, 品质优良, 对于丰富甘蓝种质资源、培育优质甘蓝新品种具有重要的意义[6]。关于无蜡粉缺失突变体甘蓝的相关研究, 在国内、外仅有少量报道[6-8], 而且发现的均是圆球和扁球型突变体。

在我国长江流域及以南地区, 牛心(尖球)类型甘蓝一直是大家喜欢种植和消费的品种类型。牛心甘蓝普遍存在蜡粉较多、球色不够绿的问题。为了提高特色新品种的竞争优势, 牛心甘蓝叶色的改良成为育种工作者的一个重要课题。2013年, 在优良牛心型纯合材料410W的群体中, 发现了其蜡粉缺失突变体410M。前人的研究结果表明, 芸薹属植物突变体缺失蜡粉性状遗传规律较为复杂, 不同突变体之间差异较大, 且由不同的基因控制。因此, 本文对首次发现的牛心类型甘蓝突变体410M的特征、主要营养物质含量、蜡粉结构、遗传规律进行研究, 并且对拟南芥中参与蜡粉合成、转运的基因在410M和410W中进行了表达水平分析, 以期明确该甘蓝蜡粉缺失突变体的特征特性及其在育种中的实际应用价值, 为丰富甘蓝种质资源、新品种创制和改良提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

供试甘蓝野生型材料410W及其蜡粉缺失突变体410M由江苏省农业科学院蔬菜研究所叶菜类蔬菜研究室提供。供试材料分别于2015年7月和2016年7月中旬播种, 8月中旬定植于江苏省农业科学院六合实验基地, 8至12月进行田间取样和田间性状调查; 12月上旬每份材料各选取4株移栽于大棚, 翌年3至5月进行授粉留种。

1.2 农艺性状观察

于叶球成熟期对熟性、叶色、株高、开展度、外叶数、球形、单球质量、球径、中心柱等农艺性状按常规方法进行调查。

1.3 营养品质测定

于叶球成熟期, 分别选取大小相近、成熟度一致、无病害、无创伤的球叶和外叶, 对其主要营养成分维生素C、粗纤维、总糖、干物质含量按常规方法进行测定。每重复取3株叶球及相应外叶, 3次重复。

1.4 蜡粉的扫描电镜观察

于叶球成熟期, 取各材料的外叶, 避开叶脉用直径10 mm打孔器进行取样, 然后将样品置于50 ℃烘箱中干燥12 h。烘干后, 用银胶固定在样品台上, 喷金, 置于扫描电子显微镜下观察。

1.5 RNA的提取及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定

于叶球成熟期, 取各材料的外叶, 采用Trizol试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)分别提取野生型和突变体材料总RNA, 提取方法参照试剂盒说明书。按照RT-qPCR要求将RNA反转录成cDNA, 根据中国农业科学院网站(http://ocri-enomics.org/bolbase/components.htm)公布的甘蓝基因序列, 利用拟南芥各个基因序列进行比对, 选择同源性较高的保守序列, 使用Primer Premier 5.0软件设计RT-qPCR引物(表 1), 以甘蓝的actin基因作为内参基因。所用染料为SYBR(TaKaRa), 配制20 μL的体系:SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μL、正向引物(10 μmol·L-1)0.8 μL、反向引物(10 μmol·L-1)0.8 μL、模板(cDNA)1 μL, 加ddH2O至20 μL。采用两步法荧光定量PCR进行扩增。扩增程序:95 ℃ 30 s, 循环1次; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 20 s, 循环40次, 72 ℃单点检测信号。熔解程序:95 ℃ 0 s, 65 ℃ 15 s, 95 ℃ 0 s, 连续检测信号。每个样品重复3次。采用2-ΔΔCT法对数据进行相对定量分析。

表 1 用于实时荧光定量PCR的引物 Table 1 Primers of cabbage genes for RT-qPCR analysis
基因
Gene
甘蓝基因组序列编号
Cabbage genome accession No.
拟南芥中蛋白家族名称
Protein family name in Arabidopsis
引物对序列(5′→3′)
Primer pairs sequence
BolECR10 Bol044348 反式烯脂酰-CoA还原酶
trans-2, 3-enoyl-coenzyme A reductase
AGTGGCTCTGGAGGGTATCA/
GCGATGTTGAACCCTAGCCA
BolFATB Bol021081 酰基ACP硫酯酶
Fatty acyl-ACP thioesterase B
ACTGGAGAAATTTTAACAAGAGCA/
CTCGGCAAGGATAGGGTCAG
BolKCR1 Bol010474 β-酮酰-CoA还原酶
β-ketoacyl-coenzyme A reductase
AACAACGCTGGGGTTTCGTA/
CCAACACAGCCTGAGTAACCT
BolCER2 Bol037661 BAHD酰基转移酶
BAHD acyltransferase
AAGTCGAAGGGTTCACGGTC/
GGCCCAACTTAGCCCTACTG
BolLCAS1 Bol002590 长链酰基-CoA合成酶
Long chain acyl-CoA synthetase
AAGGGCTTCTTGAGCCAGAC/
TAGGCGGGGTAGTCTCTTCC
BolKCS1 Bol018447 β-酮酰-CoA合成酶
β-ketoacyl-coenzyme A synthase
CCGTTATACGAATCCGGCGA/
GGAGAAGGTCTCGAACGTCA
BolACBP1 Bol017188 酰基-CoA结合蛋白
Acyl-CoA binding protein
TGGTATCACCTCGCTCAGTCT/
TGCGGTGGTAGTCGTTCTCC
BolGNL1 Bol012162 囊泡转运
Vesicle trafficking
TGGAGGAGACGAAGCCATTAT/
TTGCAGAGACTCAGCTTGGA
BolCER5 Bol031593 ABC转运器
ABC transporter
ATGGAGTTGGACAGTGCGAG/
AGTCCATCGAGCAACCTTCG
BolLTPG1 Bol002099 GPI锚定脂质转移蛋白
GPI-anchored lipid transfer protein
CAACTTCCAACGGCTTGTCAG/
CCGGTGTTATTGTTGTGGCA
BolMYB30 Bol032289 R2R3类MYB转录因子
R2R3-type MYB
GGAAGATGGAGCACTGTTGC/
CCGGGATCTTTTGTTACCCCA
BolDEWAX Bol007787 AP2-ERF类基因
AP2-ERF-type gene
TGCAAGCCAAGATCACCACC/
AGAGACCGGAACGGATAGGT
BolDCL4 Bol035827 TCGGCATTCAGTTCTGGAGT/
CGCCAACTTTAGTGGCAACC
BolHUB1 Bol030141 TGGTTCTAGCAGTGGGTCTG/
CGAGCAGATACTGGATGAGGA
1.6 数据处理

所得数据采用SAS 8.1软件进行差异显著性分析, 在0.05水平上进行邓肯氏多重比较。

2 结果与分析 2.1 突变体410M与野生型410W的特征特性

图 1可见:突变体410M与野生型410W表型相比, 除了蜡粉缺失性状外, 其他表型均无明显差异。对2个材料整个生育期的特征特性进行观察发现, 从苗期、营养生长结球期至生殖生长期, 其蜡粉缺失性状均保持稳定; 而且, 突变体410M连续自交2代后, 未出现蜡粉性状分离现象, 说明其蜡粉缺失性状为纯合性状。对2个材料营养生长结球成熟期的农艺性状调查结果显示, 突变体410M与野生型410W成熟期(定植到叶球成熟的时间)均为65 d左右, 株高、开展度、外叶数、球形、单球质量、球径、中心柱长等农艺性状指标均无显著差异(表 2)。410W球叶和外叶的维生素C含量分别为0.48和0.68 mg·g-1, 而410M球叶和外叶的维生素C含量分别为0.54和0.78 mg·g-1, 410M维生素C含量较410W有显著提高。而在粗蛋白、粗纤维、总糖、干物质成分含量方面, 二者无明显差异(表 3)。

图 1 野生型410W和突变体410M表型 Figure 1 Phenotypic characterization of wild type 410W and mutant 410M A.幼苗期; B.结球期; C.生殖生长期花序。 A.Seedling stage; B.Heading stage; C.Inflorescences at reproductive growth stage.
表 2 410W和410M农艺性状调查 Table 2 Survey of agronomic characteristics of 410W and 410M
材料
Material
株高/cm
Plant height
开展度/cm
Plant breadth
外叶数
Outer leaf No.
球形
Head shape
叶色
Leaf color
单球质量/kg
Head weight
叶球纵径/cm
Head length
叶球横径/cm
Head width
中心柱长/cm
Core length
中心柱长/球高
Core length/ head height
410W 28.83±1.24a 44.87±1.20a 9±0.50a
Heart-shaped
绿
Green
0.52±0.02a 20.11±1.43a 12.68±1.24a 9.03±0.46a 0.45±0.01a
410M 28.12±1.45a 43.50±0.48a 9±0.50a
Heart-shaped
亮绿
Glossy-green
0.53±0.02a 20.06±0.46a 12.56±0.30a 9.02±0.38a 0.45±0.02a
  注:同列数据后不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下同。
  Note:The data within a column followed by different small letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as follows.
表 3 410W和410M主要营养成分含量 Table 3 The major nutritional components of 410W and 410M
mg·g-1
叶片
Leaf
材料
Material
维生素C
Vitamin C
粗蛋白
Crude protein
粗纤维
Crude fiber
总糖
Total sugar
干物质
Dry matter
球叶Head leaf 410W 0.48±0.03d 14.7±0.12b 5.9±0.07b 39.5±0.18a 81.2±0.24b
410M 0.54±0.02c 14.6±0.07b 5.4±0.08b 40.2±0.11a 80.1±0.36b
外叶Outer leaf 410W 0.68±0.01b 17.6±0.10a 8.7±0.05a 28.6±0.08b 105.6±0.92a
410M 0.75±0.05a 18.8±0.08a 8.4±0.04a 29.4±0.24b 99.2±0.38a
2.2 蜡粉性状扫描电镜观察

扫描电镜观察(图 2)表明, 野生型和突变体蜡粉覆盖度差异显著, 与牟香丽等[7]、唐俊等[8]的研究结果一致。在500倍视野下, 野生型甘蓝叶片背面、腹面均覆盖有较多的蜡粉, 且分布致密; 在5 000倍视野下, 可观察到其蜡粉结构为片状和线状。而突变体叶面光滑, 叶背面和腹面均几乎无蜡粉覆盖, 只有零星颗粒状结构。

图 2 野生型和突变体叶片腹面和背面微观结构观察 Figure 2 Microstrure observation of leaf blade ventral and leaf blade abaxial of wild-type and mutant A.突变体叶片腹面(×500);B.野生型叶片腹面(×500);C.野生型叶片腹面(×5 000);D.突变体叶片背面(×500);E.野生型叶片背面(×500);F.野生型叶片背面(×5 000)。 A. Leaf ventral surface of mutant(×500);B. Leaf ventral surface of wild type(×500);C. Leaf ventral surface of wild type(×5 000);D. Leaf abxial surface of mutant(×500);E. Leaf abxial surface of wild type(×500);F. Leaf abxial surface of wild type(×5 000).
2.3 蜡粉缺失性状遗传规律分析

以410M和410W为亲本构建6世代群体, 正交与反交F1群体192株单株全部表现为叶面有蜡粉; F2群体有蜡粉的植株532株, 蜡粉缺失的植株155株, 分离比例为3.43 : 1, 经χ2测验符合3 : 1(χ2=1.957 < χ0.052=3.841)的分离比例; 以有蜡粉的410W为回交亲本获得的回交群体中, 208株单株全部表现为叶面有蜡粉; 而与蜡粉缺失亲本410M回交获得的回交群体中, 有蜡粉的植株158株, 蜡粉缺失的植株136株, 分离比例为1.16 : 1, 经χ2测验符合1 : 1(χ2=1.500 < χ0.052=3.841)的分离比例(表 4)。表明410M的蜡粉缺失性状由隐性单基因控制。

表 4 6世代材料性状田间调查及χ2测验 Table 4 Exploration of genetic inheritance of glossy wax-less characteristics and χ2 test
世代
Generations
总株数
No. of plants
有蜡粉单株数
No. of wax plants
无蜡粉亮绿单株数
No. of glossy plants
有蜡粉:无蜡粉亮绿
Wax plants:glossy plants
χ2 χ0.052
P1(410W) 100 100 0
P2(410M) 94 0 94
F1(410W×410M) 100 100 0
F1(410M×410W) 92 92 0
F2 687 532 155 3.43:1 1.957 3.841
BC1P1 208 208 0
BC1P2 294 158 136 1.16:1 1.500 3.841
2.4 蜡粉合成、转运基因的RT-qPCR分析

筛选出14个在拟南芥中参与蜡粉合成、转运的基因, 对其在野生型和突变体中的表达进行实时荧光定量分析。其中ECR10FATBKCR1CER2LCAS1KCS1为参与表皮蜡质生物合成的基因, ACBP1GNL1CER5LTPG1为参与蜡质传输的基因, MYB30DEWAXDCL4HUB1为参与蜡质合成和传输的调控基因。在这14个基因中, 410M中CER2LCAS1ACBP1CER5HUB1的表达高于其野生型, KCR1LTPG1在2个材料中表达差异不显著, 其余7个基因均为410W高于410M, 而且均差异显著。

图 3 410W和410M相关蜡质合成、转运基因的表达模式分析 Figure 3 Expression pattern comparison of genes involved in wax formation and transport of 410W and 410M
3 讨论

扁球类型和圆球类型的蜡粉缺失突变体均有报道[6-8], 牛心类型的蜡粉缺失突变体为首次报道。前人研究表明, 蜡粉缺失突变体营养生长期生长滞后, 生长势小于野生型; 而且, 蜡粉缺失材料结种能力减弱, 不易结籽。但本研究中的牛心突变体410M, 在营养生长期与生殖生长期, 除了蜡粉缺失性状外, 在生长势和结种能力方面与野生型均无明显差异, 表明蜡粉缺失对植株生长发育方面产生的影响大小与不同突变体材料有关。在品质测定中, 突变体410M球叶和外叶的维生素C含量高于野生型。研究表明大部分植物中的AsA(维生素C)含量与抗逆性呈正相关, 可通过提高AsA含量或促进氧化态的AsA还原来提高植物的抗逆性[9]。植物表面覆盖的蜡粉可抵御外界逆境、病虫害等伤害, 而蜡粉的缺失使得植物对外部各种逆境承受力减弱, 猜测植物会应激性调动自身的防御系统, 比如提高AsA含量来增强对逆境的抵御。至于蜡粉缺失是否与甘蓝AsA含量的变化之间存在某种相关性, 还需进一步深入研究。

国内外关于芸薹属蜡粉缺失性状的研究多有报道。芸薹属作物的蜡粉缺失性状遗传规律较为复杂, 不同突变体之间存在多样性, 且由不同的基因控制, 其中大多数突变体蜡粉缺失性状受单个基因控制, 其中以单基因隐性遗传最为常见[10-11], 显性遗传和不完全显性遗传较少[12-13]; 少数突变体受双基因控制[14]。在甘蓝蜡粉缺失突变体中, 初莲香等[6]在甘蓝品种‘迎春’中发现了一株蜡粉缺失突变体, 对其遗传效应分析表明, 这一蜡粉缺失性状是由一对隐性纯合基因控制[15]。李景涛[16]对2份圆球蜡粉缺失突变体10Q-961和LD10的遗传规律进行分析, 结果表明这2份突变体蜡粉缺失性状均为隐性单基因遗传, 但其无蜡粉亮绿基因位于不同的遗传位点。其后该研究团队又报道了受单基因显性控制的无蜡粉材料10Q-974的发现[8]。本试验中, 突变体410M配制的6世代群体的分离比例符合单基因隐性遗传的分离比例。

植物外表皮蜡粉成分主要为特长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物, 包括烷烃、初级醇、次级醇、醛、酮和烷基脂等[17-18]。近年来, 参与植物蜡粉生物合成的许多基因已经被鉴定, 其中模式作物拟南芥的蜡粉合成途径已初步被阐明:质体从头合成延伸形成C16/C18脂肪酸, 作为蜡质形成的前体延伸为特长链脂肪酸, 然后VLCFAs通过醇合成途径和烷烃合成途径合成外表皮蜡粉[19]。本研究选取了参与拟南芥蜡粉生物合成、传输和调控并在甘蓝基因组数据库中表达的14个基因, 对其在野生型和突变体中的表达进行了比较分析。在14个甘蓝基因中, 共有7个基因在野生型中的表达显著高于突变体。其中ECR10FATBKCS1为参与表皮蜡质生物合成的基因[20-22], GNL为参与蜡质传输基因[23], MYB30DEWAXDCL4为参与蜡质合成和传输的调控基因。在突变体中, CER2LCAS1ACBP1CER5HUB1的表达高于其野生型。其中CER2LCAS1为参与表皮蜡质生物合成途径的基因, ACBP1CER5为参与蜡质传输基因, HUB1为参与蜡质合成和传输的调控基因。以上基因在蜡粉代谢的过程中均扮演着重要的角色[24-26], 也正是因它们的存在和差异表达, 导致了不同突变体之间基因控制的多样性, 使得蜡粉合成和转运的过程变得格外复杂。在芸薹属作物上与蜡粉相关的分子研究方面的报道较少, 希望本研究能起到抛砖引玉的作用, 为今后的甘蓝蜡粉研究提供一些分子理论基础。

在甘蓝育种研究中, 蜡粉缺失性状可作为一代杂种利用的标记性状。而且, 蜡粉缺失性状还可转育到所有的甘蓝材料中, 扩大甘蓝类作物的类型和品种, 加速优质新品种的创制。

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