南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (1): 49-56   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201704035
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董慧杰, 侯喜林, 韩克, 张志硕, 胡春梅
DONG Huijie, HOU Xilin, HAN Ke, ZHANG Zhishuo, HU Chunmei
不结球白菜花青苷合成负调控基因BrcLBD39的克隆和表达分析及其对外源6-BA的响应
Cloning and expression analysis of anthocyanins negative regulatory factor BrcLBD39 and its response to exogenous 6-BA in non-heading Chinese cabbage
南京农业大学学报, 2018, 41(1): 49-56
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(1): 49-56.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201704035

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收稿日期: 2017-04-24
不结球白菜花青苷合成负调控基因BrcLBD39的克隆和表达分析及其对外源6-BA的响应
董慧杰 , 侯喜林 , 韩克 , 张志硕 , 胡春梅     
南京农业大学园艺学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在探究LBD39基因在不结球白菜紫色和绿色材料中的特性及其对外源6-BA的响应,为花青苷调控机制奠定理论基础。[方法]以不结球白菜紫色自交系NJZX1-3及其绿色突变体NJZX1-0为材料,同源克隆LBD39基因的全长,应用生物信息学方法分析其核酸和蛋白序列及其进化关系,并在线预测蛋白质二级和三级结构。采用外源6-BA处理后测定叶片中花青苷含量,并通过实时荧光定量PCR技术测定了LBD39基因在外源6-BA处理后的表达水平。[结果]在2个不同材料中克隆获得的LBD39基因完全相同,序列长为876 bp,包含编码区(长为699 bp)及非编码区(长为177 bp)。其编码区序列含有1个长为696 bp的开放阅读框(ORF),编码232个氨基酸,将该基因命名为BrcLBD39。亚细胞定位预测该蛋白分布在细胞核中,蛋白相对分子质量为25.30×103,等电点为8.85。进化树分析表明,BrcLBD39蛋白序列与大白菜BraLBD39相似性为100%,其次与油菜和甘蓝关系最近,相似性分别为99%和93%。外源6-BA处理24 h以后紫色材料NJZX1-3叶片中花青苷含量均高于对照,而绿色突变体叶片基本不含花青苷;BrcLBD39基因在2个材料中具有相似的表达模式,即先下降后上升而后又下降,其中在处理后48 h时BrcLBD39基因表达量急剧增加,在紫色和绿色材料中增量分别为74.84%和49.87%。此外,BrcLBD39表达量在绿色材料中明显高于紫色材料。[结论]不结球白菜中花青苷负调控基因BrcLBD39既响应外源6-BA,又与叶片中花青苷的积累密切相关,在花青苷的生物合成过程中起着重要的调控作用。
关键词不结球白菜   LBD39   同源克隆   序列分析   基因表达   
Cloning and expression analysis of anthocyanins negative regulatory factor BrcLBD39 and its response to exogenous 6-BA in non-heading Chinese cabbage
DONG Huijie, HOU Xilin, HAN Ke, ZHANG Zhishuo, HU Chunmei    
College of Horticulture/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The aim of the study is to investigate the characteristic of LBD39 gene responsive to 6-BA in non-heading Chinese cabbage, providing the theoretical basis of the regulation of anthocyanins. [Methods] In this experiment, the full length of LBD39 gene was cloned from two materials of non-heading Chinese cabbage, that was the purple self-line NJZX1-3 and its green mutant line NJZX1-0. The gene sequences and protein sequences were analyzed by bioinformatics, and the econdary structure and tertiary structure of BrcLBD39 protein were predicted online. The materials were treated by 6-BA, and the expression level of LBD39 was determined by quantitative real-time PCR and the total anthocyanins content was also measured. [Results] The study indicated that the sequences of the two cDNA clones were coincident completely, with a full-length of 876 bp, including the code area(699 bp) and the noncode area(177 bp). The open reading frame(ORF) of the code area of LBD39 was 696 bp in length and encoded 232 predicted amino acids, designated as BrcLBD39. Subcellular localization predicted that the protein was distributed in cell nucleus. The molecular weight of BrcLBD 39 was 25.30×103 and pI value was 8.85. The BrcLBD39 protein had 100% identities to BraLBD39, and shared the most close relationship with Brassica rapa, then Brassica napus and Brassica oleracea, with the identities of 99% and 93%, respectively. With the treatment of 6-BA, total anthocyanins content in the purple self-line NJZX1-3 increased and were higher than that of control after 24 h, however, anthocyanins were absent in the green mutant line NJZX1-0. At the same time, BrcLBD39 expressed in the two different self-lines with similar expression patterns, which declined first and then rose significantly and then fell again. The expression of BrcLBD39 increased to the maximum at 48 h, with the increment of 74.84% and 49.87% in the purple and green materials, respectively. Furthermore, the expression level of BrcLBD39 in NJZX1-0 was higher than that in NJZX1-3. [Results] The negative regulatory gene BrcLBD39 was responsive to exogenous 6-BA and had close relation with the accumulation of anthocyanins in non-heading Chinese cabbage, it suggests that the gene might play a key regulatory role in anthocyanins biosynthesis.
Key words: non-heading Chinese cabbage    LBD39    homology-based cloning    sequence analysis    gene expression   

不结球白菜(Brassica rapa ssp. chinensis)是一类十字花科蔬菜, 其营养丰富, 深受人们喜爱。紫色不结球白菜是近年来培育的新品种, 叶片呈紫色, 富含花青苷。花青苷是一种水溶性色素, 广泛存在于植物液泡中, 使植物呈现出不同的色彩, 且具有协助植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫的作用[1]。花青苷不仅对植物本身有重要的作用, 对人类健康也有非常重要的医疗保健功能, 具有抗氧化和抗癌作用[2-3]

花青苷生物合成的调控主要是通过转录因子对结构基因转录水平的调节来完成的。其中正调控基因主要包括R2R3-MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homology)、bHLH(basic helix-loop-helix)和WD40类转录因子, 以三元转录调控复合体(BMW)激活结构基因来促进花青苷的生物合成[4]。负调节基因主要有两类:一类是转录因子R3-MYB[5], 另一类是受氮或硝酸盐诱导的LBD(lateral organ boundary domain)转录因子家族, 包括LBD37LBD38LBD39基因[6-7]。目前, 对花青苷合成调控因子的研究大多集中在正调控因子R2R3-MYB、bHLH和WD40类转录因子上, 对负调控基因特别是LBD39基因的研究较少。

本试验以紫色叶自交系NJZX1-3及其绿色突变株系NJZX1-0为材料, 利用同源克隆的方法分离得到BrcLBD39基因的cDNA。运用生物信息学分析基因序列, 比较BrcLBD39在2种不同材料中的相对表达量以及外源6-BA对不结球白菜花青苷合成的影响, 为进一步研究BrcLBD39基因的功能、调控机制及紫色不结球白菜中花青苷合成的分子调控机制奠定生物学基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试材料不结球白菜来源于南京农业大学白菜系统生物学实验室。其中紫色叶自交系NJZX1-3经秋水仙素诱导后筛选出可稳定遗传的绿色突变系NJZX1-0。将NJZX1-3与绿色突变系NJZX1-0杂交后得到的F1代全为紫色, F1自交后得到的F2后代植株中紫色叶与绿色叶的比例约为3 : 1。取紫色叶和绿色突变植株自交系植株作为试验材料(图 1)。将种子用蒸馏水冲洗干净, 室温催芽3 d左右, 播种至穴盘并移至温室。

图 1 不结球白菜紫色自交系NJZX1-3和绿色突变系NJZX1-0表型 Figure 1 The phenotypes of purple self-line NJZX1-3 and green mutant line NJZX1-0 of non-heading Chinese cabbage
1.2 cDNA的合成

用RNA提取试剂盒(TaKaRa)分别提取NJZX1-3和NJZX1-0 7叶期叶片的总RNA。使用Prime Script RT Reagent Kit反转录试剂盒(TaKaRa)合成第一链cDNA用于LBD39基因克隆。用RNA提取试剂盒分别提取经6-BA溶液处理后的不结球白菜NJZX1-3和NJZX1-0总RNA, 使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒(TaKaRa)合成单链cDNA。

1.3 不结球白菜LBD39基因克隆

利用大白菜数据库(BRAD, http://brassicadb.org/brad/)中LBD39同源基因BraLBD39(Bra017831)设计引物(表 1), 以反转录得到的第一链cDNA为模板。PCR总体系20 μL:模板1 μL, 正、反引物各1 μL, 2×HiQPCR MIX 10 μL, ddH2O 7 μL。扩增条件为:95 ℃ 4 min; 95 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃ 10 min。扩增产物经15 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳分离, 回收目的片段, 经DH5α转化, 挑选阳性克隆菌液测序。

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences
引物对名称Primer pairs name 引物对序列(5′→3′)Primer pairs sequence 用途Usage
LBD39-F/R ATGAGTTGCAATGGATGTAGAGTTCT/TTAAACAAAAAGGTTTAACAACTTTCTCT 扩增保守片段
For the conserved fragment
LBD39-S/A CTGTTCTTCGTGGTGGTA/GTAGAGTCATTGGAGGAGAT 检测LBD39的表达
For the expression of LBD39
actin-A/S GTTGCTATCCAGGCTGTTCT/AGCGTGAGGAAGAGCATAAC 检测内参基因的表达
For the internal control
1.4 LBD39基因序列及其蛋白的生物信息学分析

用Bioxm 2.6软件查找LBD39基因的开放阅读框(ORF)并推导其氨基酸序列; 利用在线软件ProtParam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分析基因LBD39编码蛋白质的氨基酸组成, 推测其相对分子质量和等电点; 利用ProtScale(http://web.Expasy.org/protscale/)预测所编码蛋白质的信号肽; 用TMHMM 2.0(http://www.Cbs.Dtu.dk/services/TMHMM/)和PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)分别对其跨膜结构域和亚细胞定位进行预测分析; 用NCBI中在线工具Specialized BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析其编码蛋白的结构域; 采用ClustalX 2和GeneDoc软件进行蛋白质多序列比对, 用MEGA 5.2软件构建系统进化树; 通过在线软件Predictprotein(https://www.predictprotein.org/visual_results?req_id=540263)和Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)分析其蛋白质序列的二级结构并进行三级结构建模预测。

1.5 外源6-BA处理不结球白菜

待不结球白菜植株长到7叶期时, 叶面喷施质量浓度为30 mg·L-1的6-BA溶液, 并于喷前及喷后6、12、24、36、48、72和84 h剪取叶片0.1 g, 置-80 ℃保存备用。每个处理3个重复。为了增强6-BA的吸收效果, 喷施液中加入0.4 g·L-1的吐温80, 以喷施等量清水加0.4 g·L-1吐温80作为对照。喷施时间为17:00—18:00。

1.6 不结球白菜总花青苷含量的测定

总花青苷的提取参照王小青等[8]的方法并略有改动。取冷冻干燥叶片0.1 g, 用液氮研磨后, 加入1.5 mL酸化甲醇(其中含体积分数为3%的HCl), 在适当摇晃的条件下室温浸提10 h。因提取液中花青苷见光易分解, 试验过程中应注意避光[9]。花青苷含量=(A530-0.25A657)/M, 其中:A530A657表示花青苷提取液分别在530和657 nm下的吸光值; M表示叶片鲜质量(g)。每个反应设3次重复。

1.7 实时荧光定量PCR表达分析

根据克隆所得LBD39基因的cDNA全长序列, 采用Beacon Designer 7软件设计正、反引物(表 1), actin基因[10]作为内参。试验参照SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa)试剂盒的说明书, 采用标准的两步法程序, 在7500实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems)上完成定量分析。反应体系20 μL:模板(稀释10倍)2 μL, 正、反引物各0.4 μL, SYBR Premix Ex Taq 10 μL, ddH2O 7.2 μL。相对定量使用参照基因的ΔCT[11], 表达差异等于2-ΔΔCT, ΔCT=CT目标基因-CTactin。每个反应设3次生物学重复。

2 结果与分析 2.1 不结球白菜BrcLBD39基因的克隆及序列分析

分别以紫色叶自交系NJZX1-3及其绿色突变系NJZX1-0叶片cDNA为模板, 用特异性引物对LBD39-F/R扩增出长约900 bp的扩增产物。通过基因克隆分别获得NJZX1-3和NJZX1-0中LBD39基因序列。测序结果(图 2)表明, 克隆所得LBD39基因片段在2个自交系中大小一致, 长度均为876 bp, 其中包括编码区(CDS)699 bp, 非编码区177 bp(184~361), 其编码区序列含有696 bp的开放阅读框(ORF), 编码232个氨基酸, 将克隆片段命名为BrcLBD39。核苷酸序列比对发现BrcLBD39编码区序列与大白菜BraLBD39的完全一致(图 3)。

图 2 不结球白菜中BrcLBD39基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 Figure 2 Nucleotide acid and deduced amino acid sequences of BrcLBD39 from non-heading Chinese cabbage *表示终止密码子。 *represents the stop codon.
图 3 不结球白菜BrcLBD39和大白菜中BraLBD39基因的核苷酸序列比对 Figure 3 Nucleotide sequences alignment of BrcLBD39 gene in non-heading Chinese cabbage and BraLBD39 gene in Chinese cabbage
2.2 不结球白菜BrcLBD39蛋白的特征分析

BrcLBD39蛋白等电点为8.85, 蛋白相对分子质量为25.30×103, 氨基酸组成中丝氨酸(Ser)所占比例最大。BrcLBD39蛋白中含有酸性氨基酸37个, 碱性氨基酸30个。生物信息学分析表明BrcLBD39蛋白位于细胞核中, 为亲水性蛋白, 无跨膜区。保守域分析结果表明, BrcLBD39蛋白属于DUF260超家族。运用Predictprotein软件预测BrcLBD39蛋白的二级结构结果(图 4)显示:该蛋白含有5个DNA结合位点, 40个蛋白质结合位点, 其二级结构由25.25%的α-螺旋、6.89%的延伸链以及72.86%的随机卷曲组成。此外, 蛋白结构中暴露在外的氨基酸占68.53%, 隐藏在内的氨基酸占23.71%, 其余7.76%的氨基酸居中。其无序蛋白含量占68.10%, 表明该蛋白结构灵活性较强。预测的BrcLBD39蛋白的三级结构(图 5)与其二级结构预测结果基本相符。

图 4 不结球白菜BrcLBD39基因编码蛋白的二级结构 Figure 4 The predicted secondary structure of BrcLBD39 protein in non-heading Chinese cabbage A:DNA结合区域; B:蛋白结合区域; C:α-螺旋; D:延伸链; E:外露的蛋白质; F:隐藏的蛋白质。 A:DNA-binding region; B:The protein binding region; C:α-helix; D:Extended strand; E:The exposed proteins; F:The buried proteins.
图 5 不结球白菜BrcLBD39蛋白三级结构的预测 Figure 5 The predicted tertiary structure of BrcLBD39 protein in non-heading Chinese cabbage a:α-螺旋α-helix; b:延伸链Extended strand; c:随机卷曲Random coils.
2.3 BrcLBD39蛋白的同源性比较及进化树分析

利用BLASTp对BrcLBD39编码的蛋白序列进行同源检索, 结果(图 6)表明, BrcLBD39蛋白与大白菜(XP_009138496.1)中的LBD39同源性高达100%, 其次与油菜(CDY29564.1)、甘蓝(XP_013595574.1)的同源性较高, 分别为99%和93%。利用ClustalX及GeneDoc软件对包括BrcLBD39蛋白在内的7个物种的LBD39蛋白序列进行多重比对分析, 结果(图 6)显示, DUF260超家族所在的区域(第3~102个氨基酸序列)在比对的植物蛋白序列中高度保守, 表明BrcLBD39编码的蛋白可能与其他物种的LBD39蛋白具有相同的功能。此外, 由4个保守的半胱氨酸残基组成的C-x(2)-C-x(6)-C-x(3)-C基序也存在于LBD39蛋白的高保守区域中。

图 6 BrcLBD39蛋白和其他植物已知LBD39蛋白同源性比较 Figure 6 Homologous alignment of amino acid sequences of BrcLBD39 and LBD39 in other plants 黑框(第3~102个氨基酸序列)表示DUF260超家族所在的高保守区域, 黑框(第3~17个氨基酸序列)表示C-x(2)-C-x(6)-C-x(3)-C基序, Δ表示半胱氨酸。Ⅰ:不结球白菜; Ⅱ:大白菜(XP_009138496.1);Ⅲ:油菜(CDY29564.1);Ⅳ:甘蓝(XP_013595574.1);Ⅴ:拟南芥(NP_195470.1);Ⅵ:亚麻芥(XP_010437217.1);Ⅶ:琴叶拟南芥(XP_002866941.1)。 Black box(3-102 amino acid sequence)indicated the highly conserved area of the DUF260 superfamily, black box(3-17 amino acid sequence)indicated C-x(2)-C-x(6)-C-x(3)-C motif, Δ represents cysteine.Ⅰ:Brassica rapa ssp. chinensis; Ⅱ:Brassica rapa ssp. pekinensis(XP_009138496.1);Ⅲ:Brassica napus(CDY29564.1);Ⅳ:Brassica oleracea(XP_013595574.1);Ⅴ:Arabidopsis thaliana(NP_195470.1);Ⅵ:Camelina sativa(XP_010437217.1);Ⅶ:Arabidopsis lyrata(XP_002866941.1).

为进一步分析BrcLBD39蛋白与其他植物LBD39蛋白之间的进化关系, 在多重比对的基础上, 利用软件MEGA 5.2对上述植物与荠菜(XP_006282697.1)、天蓝遏蓝菜(JAU10849.1)、山葵(XP_006411876.1)和萝卜(XP_018458854.1)中的LBD39蛋白进行系统进化分析。

图 7可见:LBD39的进化基本符合植物分类学地位, 且具有明显的种属特性, 同一科植物不同属之间的分类明显, 同属植物在进化树上处于同一分支。其中, 拟南芥属的拟南芥和琴叶拟南芥聚为一组; 同为芸薹属的大白菜、油菜和甘蓝聚为一组; 而不结球白菜BrcLBD39与同属的大白菜BraLBD39关系最近, 聚为一组, 其次与油菜和甘蓝关系较近。

图 7 BrcLBD39蛋白与其他植物中LBD39蛋白的系统进化分析 Figure 7 Phylogenetic analysis of BrcLBD39 protein and LBD39 proteins in other species
2.4 外源6-BA处理后不结球白菜花青苷含量的变化

图 8可见:在紫色材料NJZX1-3中检测到大量花青苷, 外源6-BA在一定程度上可以促进紫色不结球白菜中花青苷的积累, 且在处理24 h以后花青苷含量均高于对照(P < 0.01)。而绿色材料NJZX1-0中则基本不含花青苷。

图 8 外源6-BA处理下不结球白菜中花青苷含量 Figure 8 The anthocyanins content in non-heading Chinese cabbage with the treatment of exogenous 6-BA 不同大写字母表示在0.01水平上差异极显著。下同。 The different capital letters are significantly different at 0.01 level. The same as follows.
2.5 外源6-BA处理后不结球白菜BrcLBD39基因的表达分析

图 9可见:BrcLBD39基因在NJZX1-3和NJZX1-0中的表达水平不同但具有相似的表达模式, 即先降低后急剧升高, 48 h时表达量达到最高而后又急剧下降。在NJZX1-3中, 6-BA处理后, 12 h时BrcLBD39基因表达量降低了51.72%, 而48 h时基因表达量比对照增加了74.84%, 在72 h时表达量又急剧下降。在NJZX1-0中, 6-BA处理后, 12 h时基因表达量降低了74.95%, 48 h时基因表达量与对照相比增加了49.87%。此外, BrcLBD39基因在紫色叶材料NJZX1-3中的表达量明显低于绿色突变体材料NJZX1-0。

图 9 外源6-BA处理下不结球白菜中BrcLBD39基因相对表达量 Figure 9 The expression level of BrcLBD39 gene in non-heading Chinese cabbage with the treatment of exogenous 6-BA
3 讨论

LBD家族的基因所编码的蛋白在其N末端含有约100个氨基酸的高保守区域, 其中保守基序C-x(2)-C-x(6)-C-x(3)-C存在于所有的LBD蛋白中[12]。有研究表明, LBD家族的基因可编码锌指转录因子, 其中LBD家族Ⅰ类的某些基因经亚细胞定位后存在于细胞核中[13-14]。拟南芥LBD家族Ⅱ类基因(包括LBD37LBD38LBD39)中的LBD37也位于细胞核中[6]。本研究预测不结球白菜BrcLBD39基因位于细胞核中, 这与上述研究中对LBD家族其他基因的定位结果一致。蛋白序列比对结果发现, 包括BrcLBD39在内的LBD39蛋白的高保守区域中含有由4个保守的半胱氨酸残基组成的C-x(2)-C-x(6)-C-x(3)-C基序。

为了确定控制花青苷合成的关键基因, Chiu等[15]利用花椰菜紫色突变体克隆purple(Pr)基因并进行功能验证, 发现Pr基因对花青苷合成后期结构基因的转录激活发挥着重要的作用。Hayashi等[16]用一个紫芜菁和大白菜构建群体定位了一个控制白菜中花青苷积累的新位点Anp。刘瑾等[17]利用紫色小白菜和大白菜构建的群体将控制叶片紫色的基因pur定位在A03染色体的末端。本研究中, 利用紫色不结球白菜及其绿色突变体对位于A03染色体上的BrcLBD39基因进行同源克隆和生物信息学分析, 发现BrcLBD39基因在紫色野生型和绿色突变体2个材料中完全一致, 初步认定BrcLBD39基因不是影响花青苷是否合成的关键基因。

花青苷的生物合成易受各种激素的影响, 如脱落酸、细胞分裂素、赤霉素和乙烯等[18], 而6-BA作为一种细胞分裂素类物质, 既可以在自然条件下促进萝卜、油菜等植物中花青苷的积累[19-20], 还可在光照条件下促进MS培养基上拟南芥幼苗花青苷的合成[21]。此外, 细胞分裂素还可与蔗糖互作诱导花青苷积累, 通过光电子信号传递途径转录激活花青苷合成相关正调控因子PAP1、GL3和TT8, 抑制负调控因子MYBL2的转录水平[22-23]。在模式植物拟南芥中, LBD39基因的表达易受N/NO3-的影响, 当N/NO3-充足时LBD39基因过表达从而抑制花青苷的合成, 而LBD39突变体则在N/NO3-充足时促进花青苷积累[6, 24]。而双子叶植物中花青苷的生物合成还受转录因子的调控作用[25]。本研究中, 在外源6-BA处理24 h以后叶片中花青苷含量均显著高于对照, 而BrcLBD39基因表达量在处理后6 h开始下降, 除了在48 h时表达量高于对照外其他时间点基本都低于对照。由此推断, 6-BA在一定程度上抑制调控基因BrcLBD39的表达从而促进花青苷的合成。此外, BrcLBD39表达水平受外源6-BA处理时间的影响, 说明BrcLBD39基因在调节不结球白菜叶片花青苷合成过程中不仅受外源6-BA的影响, 还受到其他调控机制的影响。另外, BrcLBD39基因在NJZX1-3中的表达量明显低于绿色突变体NJZX1-0, 这与郭宁[26]的试验结果一致, 表明负调节基因LBD39在绿色材料中的表达量高于紫色材料, 也说明BrcLBD39作为花青苷合成关键负调节因子抑制不结球白菜中花青苷的合成。

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