文章信息
- 张美祥
- ZHANG Meixiang
- 卵菌胞内效应子研究进展
- Recent research progress on oomycete cytoplasmic effectors
- 南京农业大学学报, 2018, 41(1): 18-25
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(1): 18-25.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201706100
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文章历史
- 收稿日期: 2017-06-07
病原菌与植物互作过程中, 除了要突破植物表面的物理屏障(细胞壁、蜡质层等), 还必须要突破植物的两层主动防卫机制, 才能够成功地实现侵染。在侵染过程中, 病原菌的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)首先会被寄主植物细胞膜表面的模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)识别, 激发植物病原相关分子模式激发的免疫反应(PAMP-triggered immunity, PTI)[1]。如果病原菌不能采取有效的措施抑制植物的PTI, 其进一步的侵染和扩展将会被限制。成功入侵/定殖的病原菌会分泌效应子(effector)进入植物细胞, 干扰植物的PTI, 以促进其侵染[1]。但同时植物针对病原菌效应子会进化出相应的胞内抗病受体蛋白(nucleotide-binding leucine-rich repeat, NLR), 触发效应子激发的免疫反应(effector-triggered immunity, ETI)。病原菌则通过突变其相应的效应子或进化出新的效应子进一步逃逸或抑制寄主植物ETI[2]。在进化的过程中, 病原菌与寄主植物均在这种无休止的斗争中不断进化, 故用zigzag模型(zigzag model)描述这种植物与病原菌之间的共进化关系[2]。
卵菌包括许多重要的植物病原菌, 例如疫霉(Phytophthora)、霜霉(downy mildew)和腐霉(Pythium)等。卵菌在形态学上与真菌类似, 但在细胞壁组成、生化代谢、繁殖方式等方面与真菌存在较大差异, 系统分类学上二者隶属于不同的生物界[3]。鉴于二者之间的巨大差异, 卵菌往往利用不同于真菌的遗传变异和分子机制侵染植物。目前鉴定的100多个疫霉种均是重要的植物病原菌, 能侵染几乎所有的双子叶植物, 造成作物疫病, 因此, 疫霉属的疫霉被称为植物杀手(phyto, plant; phthora, killer)。其中最著名的是由致病疫霉(P. infestans)引起的马铃薯晚疫病, 造成了19世纪“爱尔兰大饥荒”, 导致当时爱尔兰人口锐减了近1/4。大豆疫霉(P. sojae)可以引起大豆疫霉根腐病, 是大豆生产上的一种毁灭性病害[4]。橡树疫霉(P. ramrum)和樟疫霉(P. cinnamomi)可以在数百种林木上引起毁灭性的病害, 造成森林衰退[5-6]。
卵菌同其他类型病原菌类似, 在与寄主互作的过程中分泌效应子干扰植物的免疫反应, 促进其侵染。卵菌效应子按照其在植物中的亚细胞定位可以分为两类:胞外效应子(apoplastic effectors)和胞内效应子(cytoplasmic effectors)[7]。胞外效应子包括酶抑制子(enzyme inhibitors)、小半胱氨酸富集蛋白(small cysteine-rich proteins)、坏死和乙烯诱导蛋白1(necrosis and ethylene-inducing peptide 1, NEP1)-like家族和细胞壁降解酶(cell wall-degrading enzymes, CWDE)等。胞内效应子主要包括RXLR(R:精氨酸; X:任意氨基酸; L:亮氨酸)和CRN(crinkling and necrosis protein)两大类[7]。鉴于效应子在病原菌与寄主植物互作中的重要作用, 卵菌效应子生物学(effector biology)的研究将是认识卵菌致病机制的关键。近年来卵菌效应子研究进展迅速, 尤其RXLR和CRN两类胞内效应子取得了重要进展, 提升了人们对卵菌致病机制的认识。本文将从卵菌胞内效应子的序列特征、进化、表达特征及调控、分泌、转运、亚细胞定位、功能和作用机制等方面重点对这两类效应子的研究进展进行全面的梳理和讨论。
1 卵菌胞内效应子的序列特征卵菌胞内效应子主要包括RXLR和CRN两大类。两类效应子蛋白的N端均具有将蛋白质分泌到病原菌细胞外的信号肽(signal peptide)序列。对于RXLR类效应子, 紧接着信号肽N端的是保守的RXLR基序, 负责将效应子转运进入植物细胞[8]; 后面是C端效应子功能域, 通常还有WY结构域, 与效应子的生物学功能有关[9]。目前在卵菌中鉴定到的无毒蛋白几乎全部为RXLR类效应子[9], 这进一步表明了RXLR效应子在植物与卵菌互作中的重要性。CRN效应子有2个相邻且高度保守的FLAK(F:苯丙氨酸; L:亮氨酸; A:丙氨酸; K:赖氨酸)与HVLVVVP(H:组氨酸; V:缬氨酸; L:亮氨酸; P:脯氨酸)元件, 其蛋白C端为多变区域[10-11], 因此其N端的序列模式(signal peptide-FLAK-HVLVVVP)成为CRN效应因子的分类特征, 利用该特征发现CRN效应因子在腐霉、霜霉、白锈等卵菌中广为存在[9]。研究发现卵菌中也存在其他类型的胞内效应子, 例如白锈菌中鉴定到蛋白N端含有保守的CHXC(C:半胱氨酸; H:组氨酸; X:任意氨基酸)基序的效应子家族[12]。终极腐霉(Pythium ultimum)中含有YxSL[RK]保守基序的效应子家族[13]。此外, 在疫霉菌中也鉴定到除了RXLR和CRN之外的其他胞内效应子, 如致病疫霉菌中鉴定到的SNE1(suppressor of necrosis 1)[14]和大豆疫霉菌中鉴定到的非典型分泌的Isc1(isochorismatase 1)效应子等[15]。由于目前这类效应子的报道仅属个例, 因此尚未能鉴定这些卵菌胞内效应子序列上的共有模式。今后通过实验生物学方法收集侵染过程中卵菌病原菌的胞外分泌蛋白, 进而通过质谱的方法鉴定这些蛋白, 为鉴定新型卵菌效应子提供了可能。尤其针对非典型分泌效应子的鉴定, 由于其没有典型的信号肽序列, 单纯基于生物信息学预测方法鉴定这类效应子将十分困难。近年快速发展的高灵敏蛋白质谱技术为鉴别这类效应子提供了可能。当获得足够多的胞内效应子候选后, 结合生物信息学分析, 探讨这些效应子是否存在一些共有的模式, 将为后续全面鉴定卵菌胞内效应子和认识卵菌致病机制提供新的线索。
2 卵菌胞内效应子的进化目前已经有数个卵菌全基因组测序完成。基于卵菌胞内效应子的序列特征, 对其RXLR和CRN效应子进行全基因组预测, 结果表明卵菌可以编码数目庞大的胞内效应子[10-11]。以大豆疫霉菌为例, 其分别编码400多个RXLR效应子和200多个CRN效应子[10]。比较基因组学的分析结果显示, RXLR效应子主要分布在霜霉目, 尤其是疫霉属和霜霉属。在测序的终极腐霉和霜霉目以外的其他卵菌物种中均没有发现RXLR类效应子[12-13, 16]。来自不同物种的RXLR效应子序列分歧较大, 例如在近缘的大豆疫霉菌和橡树疫霉菌中, RXLR基因家族也很少有重叠, 说明该家族是物种特异性进化和扩张的[17]。CRN类效应子在已经测序的卵菌中广泛存在, 是一类古老的保守卵菌效应子家族。有趣的是在真菌蛙壶菌(Batrachochytrium dendrobatidis)和另一种共生真菌根内球囊霉(Rhizophagus irregularis)中也鉴定到CRN-like蛋白[18-19]。这些结果表明:CRN效应子是通过物种间水平转移(horizontal transfer)而来; 或者CRN蛋白在早期真核生物的祖先中就已经存在了。全基因组序列分析发现RXLR和CRN效应子主要分布在基因稀疏区(gene-sparse regions)且重复序列富集的基因组区域[11-20]。进化分析表明RXLR和CRN效应子经历了快速的生灭进化(birth and death evolution)[21]。基因复制(gene duplication)和片段重组(fragment recombination)是这两类卵菌胞内效应子基因扩张和功能分化的主要动力[21-22]。探究这些卵菌胞内效应子是如何扩张和进化的对认识卵菌病害的致病和变异机制具有重要意义。
3 卵菌胞内效应子的表达特征及调控大规模转录组分析表明大豆疫霉菌RXLR效应子根据表达模式主要可分为2类:极早期表达效应子(immediate-early effectors, IE)和早期表达效应子(early effectors, E)[23]。极早期表达效应子在大豆疫霉菌侵染之前就强烈诱导表达, 在侵染阶段中度诱导(2~10倍); 而早期表达效应子在病原菌侵染植物前只有轻度诱导表达, 但在侵染阶段(12 h)强烈诱导(10~120倍)表达[23]。功能分析结果显示:那些能够抑制植物ETI的主要是极早期表达效应子, 而抑制PTI的主要是早期表达效应子[23]。这些研究结果表明:疫霉菌效应子的表达受到精细调控, 可以协同调控植物的免疫反应, 促进病原菌的侵染。基因芯片和数字表达谱的结果表明, CRN效应子的表达丰度总体上明显高于RXLR效应子[24]。并且发现虽然有些CRN效应子的表达模式也表现出侵染阶段诱导表达, 但大部分CRN都是组成型表达。这两类胞内效应子表现出如此不同的表达模式的原因尚不明确。一个可能的解释是RXLR效应子很容易被寄主植物识别, 触发植物的防卫反应, 因此其表达量受到严格的调控。与该假设相一致的是, 目前在卵菌中鉴定的无毒蛋白几乎全部是RXLR效应子[9], 表明病原菌RXLR效应子的表达确实受到严格调控, 以免触发植物的免疫反应。然而这些效应子的表达是如何被调控的尚不明确。
已有研究表明非编码小RNA(noncoding small RNA)可能参与RXLR和CRN效应子的表达调控[25], 然而目前尚未明确这些小RNA调控卵菌效应子表达的作用方式和机制。目前已有数个高质量的卵菌基因组序列公布, 并且积累了大量的转录组分析数据[10-11, 26-27]。今后对表达模式相同的RXLR效应子启动子区进行生物信息学分析, 寻找这些效应子的启动子区中是否存在共有的表达调控元件, 进而鉴定调控这些保守元件的转录因子, 有望为认识效应子的转录调控机制提供线索。RXLR效应子在离体培养的菌丝中几乎不表达, 而只有在侵染阶段特异表达[24], 表明卵菌可以感知来自寄主植物的信号。卵菌是如何感知寄主的信号, 这些信号又是如何一步步传递到病原菌的细胞核, 最终调控效应子的表达尚不明确。今后构建卵菌感知寄主植物信号, 启动效应子表达的调控网络将会是认识卵菌致病机制的热点和关键问题。
4 卵菌胞内效应子的分泌和转运病原菌胞内效应子在合成后, 需要分泌到病原菌细胞外, 进而转运进入植物细胞发挥作用。绝大多数已知的卵菌胞内效应子, 如RXLR和CRN效应子, 均具有信号肽序列。信号肽序列负责将这些效应子在合成后经由内质网、高尔基体分泌到病原菌细胞外。我们课题组在大豆疫霉菌中鉴定到了一个具有异分支酸水解酶活性的胞内效应子Isc1, 它不具有典型的信号肽序列, 可能为一类非典型分泌(unconventional secretion)的胞内效应子[15]。我们目前还不清楚这类效应子是经由什么途径分泌到病原菌细胞外的。功能分析结果表明这类非典型分泌效应子在疫霉菌的致病中发挥重要作用。该类效应子的鉴定为今后鉴定卵菌新型效应子提供了参考和借鉴。
这些胞内效应子在分泌到病原菌细胞外后, 如何进入寄主植物细胞是近年卵菌效应子研究的热点问题之一。病原细菌主要利用Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system, T3SS)、Ⅳ型分泌系统(T4SS)和Ⅴ型分泌系统(T5SS)将效应子转运到寄主植物细胞[1]。真菌病原菌稻瘟菌可以通过活体营养表面复合体(biotrophic interfacial complex, BIC)将效应子转运入寄主细胞[28]。目前倾向于认为卵菌效应子的转运主要依赖其N端RXLR保守基序。其中研究最多的是RXLR效应子的N端保守RXLR基序。该基序与疟原虫效应子的蛋白输出元件(plasmodium export element, PEXEL)类似, 并且二者在功能上可以互换, 均能够介导效应子转运进入寄主细胞[29-30]。在一些真菌效应子中也鉴定到RXLR类似基序, 并发现这些基序也可以介导效应子转运进入寄主细胞[31]。此外, 还发现卵菌RXLR效应子及真菌中含有RXLR类似保守基序的效应子通过与寄主植物胞外膜上的三磷酸肌醇(PI3P)结合, 进一步经由寄主植物受体介导的内吞作用, 转运进入寄主细胞。我们实验室的研究结果表明, 疫霉菌自身合成的PI3P对病原菌的致病性也十分重要[32]。然而, 目前关于PI3P在RXLR效应子转运中的作用尚存在争议, PI3P结合是介导RXLR效应子转运还是稳定效应子蛋白仍需澄清[33-35]。寄生水霉(Saprolegnia parasitica)的RXLR-like效应子SpHtp1不是通过结合磷脂(phospholipid), 而是通过结合寄主细胞表面的酪氨酸-O-硫酸盐(tyrosine-O-sulphate)介导转运[36]。这些研究结果表明卵菌可能利用不止一种机制将效应子转运到寄主细胞, 卵菌可能已进化出多种机制来实现效应子的跨膜转运。卵菌RXLR效应子的晶体结构研究和三维结构预测分析表明, RXLR效应子的N端RXLR区域可能呈固有无序化(intrinsic disorder)的构象[35]。这种固有无序化构象导致对效应子蛋白进行结构分析时这部分很难被结晶出来。病原细菌效应子蛋白也存在大量的固有无序化构象, 这种构象可能与效应子的转运相关[37]。其他类型卵菌胞内效应子的转运研究仅限于利用疫霉菌遗传转化试验, 将效应子的N端与致病疫霉菌无毒蛋白Avr3a的C端融合后发现能介导后者的转运[12, 38]。这些效应子转运的分子机制尚不明确。
5 卵菌胞内效应子在寄主植物中的亚细胞定位效应子转运进入寄主植物细胞后, 定位在寄主的亚细胞场所将决定其发挥功能的方式。由于在卵菌里表达效应子和荧光蛋白的融合蛋白尚不能实现直接观察融合蛋白在寄主植物里的荧光信号, 目前关于卵菌效应子在植物中的定位信息都来自于在植物中异源表达带荧光蛋白标签的卵菌效应子融合蛋白。Caillaud等[39]观察寄生霜霉(Hyaloperonospora arabidopsidis)49个RXLR效应子的定位, 发现其中约1/3定位在细胞核, 1/3同时定位在细胞质和细胞核, 3个定位在细胞质, 1个定位在植物液泡, 其余的主要定位在包括内质网在内的不同膜结构上。这些结果表明, 卵菌RXLR效应子定位在寄主细胞的不同亚细胞场所。大豆疫霉菌Avh241定位在细胞质膜上, 并且其细胞膜定位是其发挥功能所必需的[40]。致病疫霉RXLR效应子Avrblb2也靶向植物的质膜上, 该定位也是其发挥毒性功能所必需的[41]。RXLR效应子的多样化亚细胞定位提示该类效应子可以通过靶向寄主植物的多种细胞学过程来影响寄主的免疫反应。有趣的是目前发现几乎所有卵菌CRN效应子都定位在植物的细胞核[38, 42], 并且发现这些效应子的细胞核定位依赖于寄主植物的核转运蛋白importin-α。致病疫霉菌CRN8定位在植物细胞核, 诱导植物细胞死亡。将CRN8融合1个核输出信号(nuclear exclusion signal, NES)后导出细胞核将不再引起细胞死亡, 表明细胞核定位对其诱导细胞死亡是必需的[38]。大豆疫霉PsCRN63和辣椒疫霉PcCRN4也是在植物细胞核中诱导植物细胞死亡[43-44]。这些研究结果表明细胞核定位可能是CRN效应子诱导植物细胞死亡活性所必需的。将辣椒疫霉PcCRN4融合1个核输出信号后在本氏烟中瞬时表达并接种辣椒疫霉, 将不再促进辣椒疫霉菌侵染, 表明细胞核定位也是其抑制植物免疫所必需的[44]。
6 卵菌胞内效应子的功能和作用机制卵菌与寄主植物的互作符合基因对基因假说(gene-for-gene theory)。在寄主胞内存在相应的抗病蛋白时, 效应子将激发寄主的ETI, 此时效应子被称为无毒蛋白(avirulence proteins), 目前鉴定到的卵菌无毒基因几乎全部为RXLR效应子[9]。这些RXLR效应子如何被其相应的抗病蛋白识别并激活下游抗病途径的研究近年来取得了一些进展, 但依然有很多未知。寄生霜霉(H. arabidopsidis)无毒蛋白ATR1与相应抗病蛋白RPP1直接互作, 激活RPP1介导的ETI, 并且表现出高度的等位基因特异性[45-46]。致病疫霉Avr2与寄主的磷酸酶BSL2(BSU-LIKE PROTEIN1)互作, 抗病蛋白R2识别Avr2与BSL2形成的复合体, 激发抗病反应[47]。有趣的是, 毒性菌株中的Avr2依然可以与BSL2互作, 却不能与R2形成复合体, 从而逃逸R2抗病蛋白的识别[47]。抗病蛋白与卵菌无毒蛋白识别的亚细胞场所不尽相同。单独表达致病疫霉无毒蛋白Avr1和马铃薯抗病蛋白R1时, 二者在植物细胞质和细胞核均有定位, 但二者识别激发的免疫反应仅发生在植物细胞核[48]。抗病NLR蛋白R3a在无毒蛋白Avr3a不存在的情况下定位于植物的细胞质和细胞核, 而当无毒蛋白存在时则重定位(relocalization)到内体小泡(endosomal vesicle), 而且重定位对激发抗病反应是必需的[49]。毒性菌株中的Avr3a等位基因编码产物则不能够引发R3a进行重定位, 因而不能够被抗病蛋白R3a识别[49]。目前对卵菌无毒蛋白如何激活抗病蛋白, 以及抗病信号是如何传递到下游的分子机制依然未知。在进化过程中, 病原菌可以通过删除基因组中相应的无毒基因, 以逃避寄主抗病基因的识别; 也可以通过进化出另一个效应子蛋白抑制无毒基因诱导的ETI; 也可以通过点突变改变其编码无毒蛋白的序列, 逃逸抗病蛋白识别; 也可以通过降低无毒基因的转录水平, 从而躲避寄主抗病蛋白的识别[50]。
当没有相应的抗病蛋白存在时, 效应子抑制寄主的免疫反应, 诱导植物的感病性(effector-triggered susceptibility, ETS)[2]。卵菌在成功入侵寄主植物过程中, 除了要分泌细胞壁降解酶等突破植物组织表面物理屏障, 还要突破或逃逸植物的主动免疫反应。致病疫霉菌Avr3a可以抑制由激发子INF1诱导的PTI[51]。在大豆疫霉菌中有研究表明CRN效应子也可以抑制INF1诱导的植物细胞死亡[21]。致病疫霉RXLR效应子可以抑制细菌病原相关分子模式flg22介导的抗病性[52]。寄生霜霉也可以利用RXLR效应子抑制植物的PTI[53]。以上这些研究结果表明卵菌可以分泌效应子, 有效抑制寄主植物的PTI。卵菌也可以利用RXLR效应子抑制植物的第二层主动免疫机制ETI。Wang等[23]报道大豆疫霉中有RXLR效应子可以抑制无毒蛋白激发的免疫反应。有趣的是, 致病疫霉菌RXLR效应子IPI-O毒性等位基因编码蛋白产物可以通过与无毒IPI-O蛋白竞争性结合NLR抗病蛋白的结合位点, 从而抑制IPI-O激发的ETI[54]。
卵菌胞内效应子, 如RXLR和CRN效应子, 缺少保守的生化结构域, 这为深入揭示这些效应子的生化作用机制带来了困难。一个明显的例外是大豆疫霉RXLR效应子PsAVR3b, 该效应子含有1个Nudix结构域, 并具有ADP核糖/NADH焦磷酸化酶的生化活性, 可能通过影响植物的活性氧(reactive oxygen species, ROS)来抑制植物的免疫反应[55-56]。另一个例外来自致病疫霉CRN效应子CRN8。CRN8蛋白C端含有1个RD(精氨酸、天冬氨酸)蛋白激酶结构域, 具有蛋白激酶活性, 能够自我磷酸化, 并通过形成二聚体的形式发挥毒性功能[57]。鉴于这些卵菌胞内效应子缺乏保守生化结构域的特点, 研究者试图通过功能筛选, 以及鉴定这些效应子在植物中的互作靶标来认识它们的毒性功能和作用机制, 近年来应用该策略已取得一些重要研究进展。已报道的卵菌胞内效应子主要靶向以下抗病相关途径：第一, 26S蛋白酶体降解途径[58-59]。例如致病疫霉PiAVR3a可以通过与泛素介导蛋白降解途径的E3连接酶CMPG1互作, 调控植物的细胞死亡和免疫反应[59]。第二, MAPK抗病信号途径。例如致病疫霉效应子PexRD2可以直接与植物MAPKKK互作, 抑制植物的防卫反应[60]。另一个可能的机制是PexRD2进入到植物细胞, 与MAPKKK互作后被其磷酸化, 从而激活其毒性功能。第三, 细胞自噬途径。例如致病疫霉还可以攻击植物的自噬途径来干扰植物的免疫[61]。第四, 基因沉默途径。例如大豆疫霉RXLR效应子PSR1和PSR2可以抑制植物的基因沉默途径, 干扰植物的防卫反应[62-63]。PSR1的互作蛋白PINP1编码1个含有RNA helicase结构域的蛋白, 可能是小RNA途径中Dicer蛋白复合体的组分之一[64]。第五, 激素抗病信号途径[15, 65]。例如大豆疫霉菌非典型分泌效应子Isc1通过降解植物水杨酸合成的前体物质异分支酸干扰水杨酸的合成, 从而干扰水杨酸抗病信号途径[15]。第六, 蛋白质分泌途径。例如致病疫霉Avr1与植物Sec5互作, 通过抑制蛋白质分泌抑制植物的免疫反应[48]。第七, 内质网胁迫途径(endoplasmic reticulum stress)。例如大豆疫霉菌PsAvh262能通过结合并稳定寄主内质网中的重要分子伴侣蛋白BiP, 从而抑制病原菌侵染对寄主细胞产生的内质网压力信号, 进而阻断一系列植物免疫反应[66]。第八, 蛋白质靶向(protein targeting)[67-68]。例如致病疫霉效应子Pi03192靶向植物2个NAC转录因子, 通过影响它们从内质网到细胞核的重定位干扰其发挥功能[68]。第九, 活性氧代谢。例如大豆疫霉菌PsCRN63和PsCRN115与寄主植物的过氧化氢酶(catalase)互作, 通过干扰其亚细胞定位和蛋白质稳定性影响植物过氧化氢代谢[69]。第十, 基因转录。例如大豆疫霉菌PsCRN108可以直接结合寄主植物的DNA, 通过与转录因子竞争性结合DNA调控热激蛋白的转录[70]。以上这些研究结果表明, 卵菌可以靶向植物的多种防卫相关途径促进其侵染。
随着越来越多卵菌基因组测序的完成, 我们对卵菌胞内效应子的进化将会有更深入的认识。在这些基因组资源基础上, 进一步通过比较基因组学分析使得鉴定卵菌核心效应子(core effectors)的工作成为可能。分析这些核心效应子的毒性作用机制, 将为进一步认识卵菌的致病机制提供新的见解。利用这些核心效应子筛选新的抗病基因将为抗病育种工作提供新的思路。CRN效应子几乎全部定位在植物细胞核的特点, 表明该类效应子可能集中调控寄主植物的细胞核事件。鉴定CRN效应子调控寄主植物DNA的序列模式, 以及揭示CRN效应子对寄主植物表观遗传调控作用, 将为认识CRN效应子的作用机制带来新的线索。利用蛋白质芯片技术, 大规模构建效应子与寄主植物蛋白互作网络将为全面认识卵菌的致病机制带来契机。
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