南京农业大学学报  2017, Vol. 40 Issue (6): 1100-1104   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201609035
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李乙江, 杨晶晶, 牛自兵, 创向辉, 杨倩
LI Yijiang, YANG Jingjing, NIU Zibing, CHUANG Xianghui, YANG Qian
黄牛呼吸道IgA分泌细胞和淋巴组织分布的研究
Distribution of IgA secreting cells and lymphoid tissues in cattle respiratory tract
南京农业大学学报, 2017, 40(6): 1100-1104
Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(6): 1100-1104.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201609035

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收稿日期: 2016-09-26
黄牛呼吸道IgA分泌细胞和淋巴组织分布的研究
李乙江1,2, 杨晶晶1, 牛自兵3, 创向辉2, 杨倩1    
1. 南京农业大学动物医学院, 江苏 南京 210095;
2. 德宏州动物疫病预防控制中心, 云南 德宏 678400;
3. 德宏州芒市畜牧站, 云南 德宏 678400
摘要[目的]IgA在呼吸道抵抗外来病原微生物的黏膜免疫中发挥着至关重要的作用,了解黄牛呼吸道IgA分泌细胞和淋巴组织的分布尤为重要。[方法]本试验运用免疫组织化学技术和组织学技术对5头7岁健康婆罗门黄牛的鼻黏膜、气管、肺内支气管、肺组织的IgA分泌细胞和淋巴组织的分布进行了详细研究。[结果]黄牛的鼻黏膜、气管、肺内支气管、肺中均分布有IgA分泌细胞,且主要分布于黏膜上皮下以及腺体周围。其数量在鼻黏膜中最多,气管次之,肺内支气管和肺组织中IgA分泌细胞较少。此外,从鼻黏膜到肺内支气管黏膜下均分布有较多的淋巴组织。[结论]黄牛鼻腔黏膜是较好的黏膜免疫诱导位点。该结果为牛呼吸道黏膜免疫及呼吸道疾病防治提供了理论依据。
关键词黄牛   IgA分泌细胞   淋巴组织   呼吸道   
Distribution of IgA secreting cells and lymphoid tissues in cattle respiratory tract
LI Yijiang1,2, YANG Jingjing1, NIU Zibing3, CHUANG Xianghui2, YANG Qian1    
1. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Dehong Animal Disease Control Center, Dehong 678400, China;
3. Mangshi Pasturage Station of Dehong City, Dehong 678400, China
Abstract: [Objectives] IgA is crucial for the mucosal immune system in respiratory tract. It is important to understand the distribution of IgA secreting cells and lymphoid tissue in the respiratory tract of cattle. [Methods] Nasal mucosa, trachea, pulmonary bronchial and lung from five health cattles were collected and the distribution of IgA secreting cells and lymphoid tissues was tested by immunohistochemistry and histological methods. [Results] The results showed that the IgA secreting cells were distributed mainly underneath the mucosal epithelium and around the glands in nasal mucosa and trachea of cattle. The number of the IgA secreting cells in the respiratory tract was counted by image system. The number of the IgA secreting cells reduced from nasal mucosa to lung. Also a lot of lymphoid tissue existed underneath epithelium of the nasal mucosa and the pulmonary bronchial of lung. [Conclusions] Our results indicated the nasal mucosa could be used as an effective induction site in cattle. The study also provided a foundation and knowledge to respiratory mucosa immunity of cattle.
Key words: cattle    IgA secreting cells    lymphoid tissues    respiratory tract   

呼吸道黏膜下淋巴组织在抵抗病原微生物入侵中起着重要的作用, 因此呼吸道黏膜免疫的研究也越来越受重视。黏膜下淋巴组织中的IgA是黏膜免疫的主要效应因子[1]。IgA由IgA分泌细胞分泌到黏膜表面形成一层保护层, 可防止病原微生物入侵。因此研究呼吸道中IgA分泌细胞在预防呼吸道传播疾病中具有重要意义。

有关呼吸道IgA分泌细胞在猪、山羊中已有报道[2-3]。猪和山羊呼吸道IgA分泌细胞主要分布在呼吸道腺体周围、黏膜上皮间及其下方、肺泡隔和各级支气管的黏膜上皮下[2-3]。黏膜免疫后IgA分泌细胞数量显著增加[4]。然而有关黄牛呼吸道中IgA分泌细胞分布却未见报道。因此, 本试验对黄牛呼吸道黏膜中IgA分泌细胞和淋巴组织的分布进行详细研究, 为牛黏膜免疫的深入研究提供了基础数据。

1 材料与方法 1.1 试验动物及样品采集

7岁健康婆罗门黄牛5头(由云南德宏州盈瑞畜牧养殖有限公司提供), 颈部放血处死后, 取呼吸道组织样品:鼻黏膜、气管(距离会厌部10 cm)、肺支内气管(左尖后段支气管处2 cm部位)、肺(含有细支气管)。所有组织样品在4%(体积分数)多聚甲醛液中固定48 h后, 常规脱水、透明、浸蜡, 石蜡包埋, 组织切片(6 μm厚)。

1.2 HE染色显示淋巴组织

将组织切片进行常规HE染色, 树胶封片, 用Olympus BH-2显微镜观察并拍照。

1.3 免疫组织化学方法显示IgA分泌细胞

石蜡切片(6 μm)经二甲苯脱蜡, 梯度乙醇脱二甲苯下行至水, PBS(pH7.6)洗涤10 min; 0.8%(体积分数)H2O2处理30 min, 0.4% Triton-PBS(pH7.4)洗涤3次; 10%山羊血清封闭20 min, 弃山羊血清后直接加入1:100的兔抗牛IgA(Abcam公司), 4 ℃过夜; 洗涤后加入稀释100倍的SABC(南京生兴生物技术有限公司)37 ℃孵育60 min; 弃SPA-HRP(辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌蛋白A)后放入PBS(pH7.4)中洗涤1次, Tris-HCl缓冲液(0.05 mol·mL-1, pH7.6)洗涤3次; 适量DAB-H2O2显色, 晾干, 透明, 封固。用PBS代替兔抗牛IgA作为阴性对照组。

1.4 组织学观察与数据处理

用Olympus BH-2显微镜观察组织切片并拍照。每个组织样品随机取至少5张切片, 每张切片随机选10个视野, 利用图像分析系统测量单位视野内IgA分泌细胞的数量。

1.5 统计分析

数据均表示为x±SD形式。采用IBM SPSS Statistics 20.0和GraphPad Prism 5软件进行统计, 差异显著性检验采用独立样本t检验。不同部位的IgA分泌细胞分布用单因素方差分析。

2 结果与分析 2.1 黄牛呼吸道中IgA分泌细胞和淋巴细胞的分布 2.1.1 鼻腔

图 1-A可见:黄牛鼻黏膜上皮中含有上皮内淋巴细胞, 在其下方基底膜附近也含少量淋巴细胞。鼻黏膜中IgA分泌细胞主要分布在固有层和黏液腺体周围, IgA分泌细胞呈棕色圆形, 核为阴性反应。在黏膜上皮中也有少量分布。鼻黏膜表面也呈阳性反应, 提示IgA由IgA分泌细胞分泌后经黏膜上皮分泌到黏膜表层(图 1-B)。

图 1 IgA分泌细胞(A)和淋巴细胞(B)在黄牛鼻黏膜中的分布(×400) Figure 1 The distribution of lymphocytes(A)and IgA secreting cells(B)in the nasal mucosa of cattle ★黏膜上皮Mucosal epithelium; ☆固有层Lamina propria; 淋巴细胞Lymphocytes; 上皮内淋巴细胞Intraepithelial lymphocytes; IgA分泌细胞IgA secreting cells; △黏液腺体Glands。下同。The same as follows.
2.1.2 气管

在黄牛气管IgA免疫组化染色中, IgA分泌细胞主要分布在假复层纤毛柱状上皮中, 在固有层中紧贴黏膜上皮下也有分布, 气管黏膜表面也呈强阳性反应(图 2-A)。由黄牛气管的HE染色可见, 其黏膜表面覆以假复层纤毛柱状上皮, 其中分布有一定数量的上皮内淋巴细胞; 固有层含有大量胶原纤维和弹性纤维, 其中也分布少量淋巴细胞(图 2-B)。

图 2 IgA分泌细胞和淋巴细胞在黄牛气管(A、B)和肺内支气管(C、D)中的分布(×400) Figure 2 The distribution of lymphocytes and IgA secreting cells in the trachea(A, B)and in the pulmonary bronchial(C, D) of cattle
2.1.3 肺内支气管

黄牛肺内支气管中IgA分泌细胞多分布于假复层纤毛柱状上皮下基底膜, 假复层纤毛柱状上皮中和固有层也有分布(图 2-C)。黄牛肺内支气管黏膜表面覆以假复层纤毛柱状上皮, 其中分布有一定数量的上皮内淋巴细胞; 固有层的结缔组织中分布有较多淋巴细胞(图 2-D)。

2.1.4 肺

黄牛肺组织经过HE染色可见, 在肺细支气管中的假复层纤毛柱状上皮中分布有一定数量的淋巴细胞, 且在细支气管附近淋巴细胞呈弥散性分布(图 3-A); 在肺泡隔中也有少量淋巴细胞(图 3-B)。肺中IgA分泌细胞主要集中在肺泡隔和肺细支气管黏膜下的结缔组织中; 肺泡隔结缔组织也有较浅色的阳性反应(图 3-C, D)。

图 3 淋巴细胞和IgA分泌细胞在黄牛肺中的分布(×400) Figure 3 The distribution of IgA secreting cells and lymphocytes in the lung of cattle A.淋巴细胞在肺内细支气管中的分布The distribution of lymphoid cells in the pulmonary bronchioles; B.淋巴细胞在肺组织中的分布The distribution of lymphoid cells in the lung; C.IgA分泌细胞在肺内细支气管中的分布The distribution of IgA secreting cells in the pulmonary bronchioles; D.IgA分泌细胞在肺组织中的分布The distribution of IgA secreting cells in the pulmonary bronchioles.
2.2 IgA分泌细胞在黄牛呼吸道中的分布统计

经统计学分析, 单位视野内黄牛鼻黏膜和气管较支气管和肺中IgA分泌细胞分布多, 其数量极显著高于支气管和肺(P < 0.01);鼻黏膜与气管、支气管与肺之间无明显差异(P>0.05)(表 1)。

表 1 黄牛呼吸道中IgA分泌细胞统计 Table 1 The distribution of IgA secreting cells in cattle respiratory tract
呼吸道组织Respiratory tract tissuesIgA分泌细胞数量No.of IgA secreting cells
鼻黏膜Nasal mucosa10.066±1.553A
气管黏膜Trachea mucosa8.966±1.097A
肺内支气管黏膜Pulmonary bronchioles mucosa5.000±0.872B
肺Lung4.300±1.273B
    注:同列数据肩标没有相同字母的表示为差异极显著(P<0. 01)。
    Note:Column data without the same superscripts indicate extremely significant difference(P < 0.01).
3 讨论

有很多病原微生物通过呼吸道进入体内引起黄牛感染和发病, 如口蹄疫病毒[5]、牛传染性鼻气管炎[6]、牛巴氏杆菌病[7]、牛支原体肺炎[8]等。有些病原微生物还可引起局部呼吸道黏膜的病变, 导致呼吸困难等症状。通过黏膜免疫可直接切断病原微生物的入侵, 有效预防呼吸道传染病。黏膜免疫的基础就是黏膜下的淋巴组织, 因此, 研究黏膜下的淋巴组织显得尤为重要。

IgA分泌细胞数量在一定程度上可反映局部黏膜IgA抗体水平。sIgA量多且稳定, 其合成速率约是IgG的2倍, 在黏膜表面的半衰期为IgG的3陪, 在机体外分泌道中的保护作用可持续4个月以上[9]。sIgA能结合并中和病毒等病原微生物, 从而防止呼吸道病原微生物的入侵[10]。有关牛IgA的研究已开始受到关注[11-12]。应用牛结核分枝杆菌免疫后IgA的产生量远远超过IgG的量, 表明IgA在抗传染中的重要性[11]。本试验显示黄牛鼻黏膜下分布有较多的IgA分泌细胞和上皮内淋巴细胞, 后者是机体最先接触病原微生物的免疫活性细胞, 可产生IL-2、IL-4、IFN-γ等细胞因子而发挥免疫作用[13],表明通过鼻腔免疫可以更好地诱导免疫反应。与其他动物的相关报道一致[2-3, 14], 牛鼻腔可作为理想的黏膜免疫位点。

与其他动物相似, 黄牛气管黏膜下分布有大量的胶原纤维和弹性纤维, 尽管分布有少量的IgA分泌细胞和上皮内淋巴细胞, 但由于气管位于下呼吸道, 通过鼻腔免疫接触抗原的机会较少, 所以气管黏膜并不是呼吸道主要的免疫诱导位点。

猪、山羊呼吸道最下方的肺通常淋巴组织分布较少(几乎不接触外界的抗原)[2-3]。但本试验结果表明黄牛肺内细支气管黏膜下却分布有较多的淋巴组织和少量上皮内淋巴细胞以及部分IgA分泌细胞, 以及少量的上皮内淋巴细胞。肺内分布有较多的淋巴组织和IgA分泌细胞, 其对病原微生物入侵肺组织具有免疫保护作用。

综上所述, 黄牛呼吸道中IgA分泌细胞的数量从上呼吸道到下呼吸道呈递减分布, 提示鼻腔黏膜是较好的黏膜免疫诱导位点。并且, 从鼻黏膜到肺内支气管黏膜下均分布有较多的淋巴组织, 均可发挥局部黏膜免疫反应作用。可见, 本试验为牛呼吸道黏膜免疫及呼吸道疾病防治奠定了理论基础。

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