文章信息
- 郑双凤, 谭武贵, 丰来, 罗志威, 徐滔明, 张冬雪, 谭石勇
- ZHENG Shuangfeng, TAN Wugui, FENG Lai, LUO Zhiwei, XU Taoming, ZHANG Dongxue, TAN Shiyong
- 枯草芽孢杆菌NTGB-178高产芽孢发酵工艺优化
- Optimization of sporulation fermentation process of Bacillus subtilis NTGB-178
- 南京农业大学学报, 2017, 40(6): 1031-1040
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(6): 1031-1040.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201702023
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文章历史
- 收稿日期: 2017-02-20
由植物病原真菌引起的植物病害, 位居植物3类病害(真菌病害、细菌病害、病毒病害)之首[1], 目前以化学防治为主, 但化学防治不仅成本高且易造成环境与食品污染, 因此绿色、无污染的生物防治成为近年来研究的热点[2]。在生防细菌中研究最多的是芽孢杆菌, 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是其中的一种。研究表明, 枯草芽孢杆菌能够分泌抗菌蛋白、抗生素、酶或多肽等活性物质[3-5], 具有促进植物生长[6]、防治植物病害[7-8], 且同时具有安全、无毒, 繁殖快, 抗逆性强[9], 易定殖于植物根部等优势, 因此研究与开发该生防菌剂具有广泛的应用前景。芽孢含量是衡量生防芽孢杆菌菌剂品质的关键指标, 因此提高发酵液中的芽孢产量是研究的首要任务。
枯草芽孢杆菌NTGB-178是本实验室筛选、保藏的一株对烟草黑胫病、油菜菌核病、辣椒疫霉病、黄瓜枯萎病等土传病害均具有很好防效的生防菌。国内外对生防芽孢杆菌发酵中的抗菌物质研究应用较多, 但对发酵液中活菌与芽孢产量的研究较少。本文通过单因素试验与响应面法相结合的方法, 研究不同培养基成分与不同培养条件对NTGB-178液体发酵生物量与产孢的影响, 开发利用低成本的发酵培养基, 确定最适的培养条件, 从而提高发酵液中的生物量以及芽孢含量, 降低该菌制剂生产成本, 为芽孢杆菌NTGB-178工业化扩大生产奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株枯草芽孢杆菌NTGB-178由本实验室从健康菜园土中分离筛选并保藏。
1.1.2 供试培养基NA培养基:蛋白胨10 g·L-1、牛肉膏5 g·L-1、NaCl 5 g·L-1、琼脂20 g·L-1、蒸馏水1 000 mL, pH(7.3±0.1)。
种子培养基:酵母膏10 g·L-1、蛋白胨20 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、蒸馏水1 000 mL, pH(7.0±0.1)。
基础发酵培养基:蔗糖30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、NaCl 5 g·L-1、蒸馏水1 000 mL, pH(7.0±0.1)。
1.2 菌种活化将NA斜面保藏的NTGB-178菌株, 用接种环挑取少量菌苔, 在NA平板上划线分离, 并置于30 ℃恒温培养箱中培养24 h。
1.3 种子液制备配制种子培养基, 分装于250 mL锥形瓶中, 每瓶装液量30 mL。用接种环挑取一环活化后的菌苔, 接种于种子培养基中, 30 ℃、160 r·min-1摇床培养12 h后备用。
1.4 发酵培养配制基础发酵培养基, 分装于250 mL锥形瓶中, 每瓶装液量50 mL。将种子液按2%(体积比)的接种量接入基础发酵培养基中, 30 ℃、160 r·min-1摇床培养36 h。
1.5 生物量与芽孢产量的检测生物量检测:采用稀释涂布平板计数法。将发酵液用无菌蒸馏水稀释至10-5、10-6、10-7、10-8 4个稀释梯度, 然后分别取100 μL稀释液均匀涂布到NA平板上, 并将其置于30 ℃恒温培养箱中培养, 24 h后计算菌落数。
芽孢产量检测:先将发酵液经80 ℃水浴处理15 min使活菌体失活, 其余步骤同生物量检测所采用的方法。
1.6 单因素试验 1.6.1 最适培养成分单因素试验选择6种碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、麸皮), 7种氮源(蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、豆粕、(NH4)2SO4、尿素), 7种无机盐(NaCl、MgSO4·7H2O、MnSO4、CaCl2、CaCO3、K2HPO4、KH2PO4), 在基础培养基基础上单因素改变碳源、氮源和无机盐的种类, 配制不同发酵培养基。根据发酵液中生物量与芽孢产量, 筛选出最适碳源、氮源和无机盐。
在上述试验基础上, 考察不同质量浓度碳源(麸皮与玉米粉按质量比为1:1混合)(15、20、25、30、35和40 g·L-1)、氮源(豆粕)(10、15、20、25、30、35和40 g·L-1)、无机盐(CaCO3、NaCl、MgSO4·7H2O)(0、1、2、3、4、5和6 g·L-1)对发酵液中的活菌素与芽孢产量的影响, 得出各组分最适浓度。
1.6.2 最适培养条件单因素试验按照优化后的培养基配方, 考察不同初始pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、不同接种量(1%、2%、3%、4%、5%和6%)、不同装液量(35、50、65、80、100和120 mL)、不同摇床转速(120、140、160、180、200和220 r·min-1)、不同培养温度(24、30、36、42、48和50 ℃)对发酵液中的生物量与芽孢产量的影响, 确定各影响因素的最佳范围。
1.7 发酵响应面优化试验 1.7.1 Plackett-Burman试验根据单因素试验结果, 以芽孢产量为响应值, 利用Plackett-Burman试验从8个因素(麸皮、玉米粉、豆粕、CaCO3、MgSO4·7H2O、NaCl、初始pH、培养时间)中筛选出对芽孢产量影响显著的因素。试验利用Design-Expert 8.0软件, 选用8因素2水平, 试验次数n=12的Plackett-Burman设计, 试验另设3个虚拟因子, 试验设计方案见表 1。
| 代号 Code |
因素 Factors |
水平Level | |
| -1 | +1 | ||
| A | 麸皮/(g·L-1)Bran | 12.5 | 20.0 |
| B | 玉米粉/(g·L-1)Corn flour | 12.5 | 15.0 |
| C | 虚拟变量1 Dummy 1 | ||
| D | 豆粕/(g·L-1)Bean pulp | 25 | 30 |
| E | CaCO3/(g·L-1) | 1 | 2 |
| F | 虚拟变量2 Dummy 2 | ||
| G | MgSO4·7H2O/(g·L-1) | 2 | 4 |
| H | NaCl/(g·L-1) | 2 | 4 |
| J | 虚拟变量3 Dummy 3 | ||
| K | 初始pH Initial pH | 6.5 | 7.5 |
| L | 培养时间/h Fermentation time | 36 | 40 |
响应面方程实际能考察的范围较窄, 拟合的响应面回归方程只在紧邻考察区域才能比较真实地预测实际情况[10]。因此, 为了建立有效的响应面回归方程, 首先需要逼近最大响应面区域, 确定Box-Behnken的中心点。根据Plackett-Burman试验结果筛选出显著因子, 并根据各因子效应值大小来确定爬坡步长, 以效应值的正、负来确定爬坡方向, 使其快速逼近主效应因子的最适水平, 其余因素均固定在低水平。
1.7.3 Box-Behnken试验运用Box-Behnken试验设计原理, 以芽孢产量为响应值, 结合最陡爬坡试验得到的中心点, 进行响应面分析。试验利用Design-Expert 8.0软件设计3因素3水平, 共17组试验, 试验因素及水平设计见表 2。
| 代号 Code |
因素 Factors |
水平Level | ||
| -1 | 0 | +1 | ||
| A | 麸皮/(g·L-1)Bran | 7.0 | 9.0 | 11.0 |
| B | NaCl/(g·L-1) | 4.0 | 4.5 | 5.0 |
| C | 初始pH Initial pH | 5.5 | 6.0 | 6.5 |
在摇瓶优化基础上, 进行100 L发酵罐的扩大培养。发酵条件为摇瓶优化最优培养条件, 每隔3 h取样检测其生物量与芽孢产量, 绘制其生长曲线, 对比摇瓶优化结果, 验证优化工艺的稳定性。
2 结果与分析 2.1 培养基单因素优化试验由图 1可知:分别利用蔗糖、葡萄糖、麸皮与玉米粉为碳源时, NTGB-178发酵液的生物量较高, 但以迟效碳源麸皮或玉米粉为培养基碳源时, 芽孢产量较高; 当碳源(麸皮与玉米粉按质量比为1:1混合)浓度为25 g·L-1时, 生物量与芽孢产量均较高。
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图 1 不同种类碳源(A)及最适碳源浓度(B)对NTGB-178生物量与芽孢产量的影响 Figure 1 Effects of different type and concentration of carbon source on NTGB-178 biomass and spore yield 图B中最适碳源为麸皮和玉米粉的混合物(质量比为1:1)。Bran and corn flour in Figure B are the optimal carbon, and the mass ratio is 1:1. |
由图 2可知:以酵母膏、牛肉膏、豆粕为氮源时, NTGB-178发酵液的生物量较高, 其中以豆粕为氮源时, 发酵产芽孢最多, 且豆粕为加工厂下脚料, 价格较便宜, 有利于工厂化生产, 因此选择豆粕为培养基的最适氮源。当豆粕浓度为25 g·L-1时, 生物量与芽孢产量均较高。
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图 2 不同种类氮源(A)及最适氮源浓度(B)对NTGB-178生物量与芽孢产量的影响 Figure 2 Effects of different type and concentration of nitrogen on NTGB-178 biomass and spore yield 图B中最适氮源为豆粕。Bean pulp is the optimal nitrogen source in Figure B. |
由图 3可知:培养基中无机盐对NTGB-178发酵有较大影响, 培养基中添加CaCO3、MgSO4·7H2O、NaCl, 可显著提高NTGB-178生物量与芽孢产量。CaCO3、MgSO4·7H2O、NaCl的最适添加浓度分别为1、2和2 g·L-1。
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图 3 不同种类无机盐及其浓度对NTGB-178生物量与芽孢产量的影响 Figure 3 Effects of different type and concentration of inorganic salt on NTGB-178 biomass and spore yield |
由图 4可知:NTGB-178在初始pH值为5.5~8.0范围内均能生长, 在初始pH值为6.5时发酵液中生物量与芽孢产量最高。接种量为4%时, 生物量与芽孢产量最高。摇床转速为220 r·min-1时, 生物量和芽孢产量均最高。培养温度对生物量与芽孢产量影响较大, 最适培养温度为36 ℃。
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图 4 不同培养条件对NTGB-178生物量与芽孢产量的影响 Figure 4 Effects of different culture condition on NTGB-178 biomass and spore yield |
Plackett-Burman试验设计和结果分析见表 3和表 4, 对表 3所得数据进行回归分析, 得到模拟方程:Y=36.76-3.96A+0.58B+0.97D+0.63E+1.83G+4.28H-4.09K+1.93L。式中:Y为芽孢产量, 方程的决定系数R2=0.984 3, 表示该方程回归性较好, 并达到显著水平(P=0.012 6)(表 4)。试验中具有显著影响的因素有A、G、H、K、L, 其中对NTGB-178发酵产芽孢影响从大到小的因素分别为:H(NaCl)、K(初始pH)、A(麸皮)、L(培养时间)、G(MgSO4·7H2O), 且CaCO3、MgSO4·7H2O、NaCl、培养时间为正效应, 麸皮、初始pH为负效应。选择影响最显著的3个因子, 进行下一步响应面优化。
| 试验序号 Number |
A | B | D | E | G | H | K | L | 芽孢产量/(108 CFU·mL-1) Spore yield |
| 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | 34.00 |
| 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 22.55 |
| 3 | 1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 36.95 |
| 4 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | 34.30 |
| 5 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 35.10 |
| 6 | -1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 | 51.00 |
| 7 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | 35.70 |
| 8 | -1 | 1 | 1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 1 | 43.50 |
| 9 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 38.70 |
| 10 | 1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | -1 | 41.00 |
| 11 | 1 | 1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 | -1 | 23.60 |
| 12 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | -1 | 1 | 44.70 |
| 注:A~L同表 1。Note:A-L are the same in Table 1. | |||||||||
| 方差来源 Source |
平方和 Sum of squares |
自由度 DF |
均方差 Mean squares |
估计系数 Coefficient estimate |
F值 F-value |
P值 P-value |
显著性 Significance |
| 模型Model | 714.26 | 8 | 89.28 | 36.76 | 23.44 | 0.012 6 | * |
| 麸皮Bran | 188.02 | 1 | 188.02 | -3.96 | 49.36 | 0.005 9 | ** |
| 玉米粉Corn flour | 4.08 | 1 | 4.08 | +0.58 | 1.07 | 0.376 7 | |
| 豆粕Bean pulp | 11.21 | 1 | 11.21 | +0.97 | 2.94 | 0.184 7 | |
| CaCO3 | 4.69 | 1 | 4.69 | +0.63 | 1.23 | 0.348 2 | |
| MgSO4·7H2O | 40.33 | 1 | 40.33 | +1.83 | 10.59 | 0.047 4 | * |
| NaCl | 220.16 | 1 | 220.16 | +4.28 | 57.79 | 0.004 7 | ** |
| 初始pH Initial pH | 200.90 | 1 | 200.90 | -4.09 | 52.74 | 0.005 4 | ** |
| 培养时间Fermentation time | 44.85 | 1 | 44.85 | +1.93 | 11.77 | 0.041 5 | * |
| Note:*P＜0.05, **P＜0.01. The same as follows. | |||||||
由表 5可知:NTGB-178芽孢产量最高的发酵条件介于试验组3与试验组5之间, 故以试验组4设为Box-Behnken试验的中心点, 即麸皮9 g·L-1、NaCl 4.5 g·L-1、初始pH6.0。
| 试验组序号 No.of treatment |
麸皮/(g·L-1) Bran |
NaCl/(g·L-1) | 初始pH Initial pH |
芽孢产量/(108 CFU·mL-1) Spore yield |
| 1 | 15 | 3.0 | 7.5 | 25.32 |
| 2 | 13 | 3.5 | 7.0 | 37.76 |
| 3 | 11 | 4.0 | 6.5 | 46.70 |
| 4 | 9 | 4.5 | 6.0 | 57.40 |
| 5 | 7 | 5.0 | 5.5 | 37.10 |
| 6 | 5 | 5.5 | 5.0 | 33.47 |
Box-Behnken试验结果如表 6所示, 对Box-Behnken试验结果二次多元回归拟合, 得到如下回归方程:
| 试验序号 Experiment No. |
A:麸皮/(g·L-1) Bran |
B:NaCl/(g·L-1) | C:初始pH Initial pH | 芽孢产量/(108 CFU·mL-1) Spore yield |
| 1 | 0 | -1 | 1 | 45.00 |
| 2 | 0 | 1 | 1 | 35.70 |
| 3 | -1 | 1 | 0 | 37.50 |
| 4 | 0 | -1 | -1 | 36.58 |
| 5 | 1 | 0 | -1 | 51.00 |
| 6 | 1 | 0 | 1 | 55.00 |
| 7 | -1 | 0 | 1 | 47.54 |
| 8 | 0 | 0 | 0 | 61.04 |
| 9 | -1 | 0 | -1 | 40.27 |
| 10 | 0 | 1 | -1 | 36.30 |
| 11 | 0 | 0 | 0 | 57.84 |
| 12 | 0 | 0 | 0 | 61.24 |
| 13 | 1 | -1 | 0 | 54.00 |
| 14 | 0 | 0 | 0 | 62.52 |
| 15 | -1 | -1 | 0 | 38.40 |
| 16 | 1 | 1 | 0 | 42.00 |
| 17 | 0 | 0 | 0 | 60.74 |
Y=60.68+4.79A-2.81B+2.39C-2.78AB-0.82AC-2.25BC-3.82A2-13.88B2-8.40C2。
式中:Y表示芽孢产量。
由Box-Behnken试验方差分析结果(表 7)可知:模型P＜0.000 1, 说明模型极显著, 试验方法真实可靠。A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2的P值均小于0.05, 说明这些因素对模型影响显著。失拟项P=0.778 5＞0.05, 表明失拟项不显著, 由此说明模型拟合度较好, 试验误差小, 且回归方程的决定系数(R2)为0.990 7, 修正决定系数(Adjusted R2)为0.978 7, 因此可用该方程进行结果预测。
| 方差来源 Source |
平方和 Sum of squares |
自由度 DF |
均方差 Mean squares |
估计系数 Coefficient estimate |
F值 F-value |
P值 P-value |
显著性 Significance |
| 模型Model | 1 617.44 | 9 | 179.72 | 60.68 | 82.66 | ＜0.000 1 | ** |
| A | 183.27 | 1 | 183.27 | 4.79 | 84.29 | ＜0.000 1 | ** |
| B | 63.17 | 1 | 63.17 | -2.81 | 29.05 | 0.001 0 | ** |
| C | 45.55 | 1 | 45.55 | 2.39 | 20.95 | 0.002 6 | ** |
| AB | 30.80 | 1 | 30.80 | -2.78 | 14.17 | 0.007 0 | ** |
| AC | 2.67 | 1 | 2.67 | -0.82 | 1.23 | 0.304 1 | |
| BC | 20.34 | 1 | 20.34 | -2.25 | 9.36 | 0.018 4 | * |
| A2 | 61.50 | 1 | 61.50 | -3.82 | 28.29 | 0.001 1 | ** |
| B2 | 811.09 | 1 | 811.09 | -13.88 | 373.05 | ＜0.000 1 | ** |
| C2 | 297.22 | 1 | 297.22 | -8.40 | 136.70 | ＜0.000 1 | ** |
| 残差Residual | 15.22 | 7 | 2.17 | ||||
| 失拟项Lack of fit | 3.32 | 3 | 1.11 | 0.37 | 0.778 5 | ||
| 纯误差Pure error | 11.90 | 4 | 2.97 | ||||
| 总差Cor total | 1 617.44 | 16 | 179.72 |
根据上述回归方程及回归模型方程分析表绘出响应面曲面图和相应等高线图(图 5~7), 从响应曲面图可以看出, 每个曲面都存在最高点, 通过回归方程对各个因素求一阶偏导, 得到Y极大值的条件为:A=10.35、B=4.41、C=6.07, 即麸皮10.35 g·L-1、NaCl 4.41 g·L-1、初始pH6.07, 此条件下芽孢理论产量为6.27×109CFU·mL-1。
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图 5 麸皮与NaCl浓度对NTGB-178芽孢产量的交互效应 Figure 5 Interaction effect between bran and NaCl |
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图 6 麸皮浓度与初始pH对NTGB-178芽孢产量的交互效应 Figure 6 Interaction effect between bran and initial pH |
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图 7 NaCl浓度与初始pH对NTGB-178芽孢产量的交互效应 Figure 7 Interaction effect between NaCl and initial pH |
为了进一步验证模型的预测值, 根据预测最优条件, 进行3次重复验证试验, 最后得出平均芽孢产量为6.16×109 CFU·mL-1, 实际值与预测值拟合度达98.19%, 说明拟合方程能够准确预测真实情况。优化后生物量为6.55×109 CFU·mL-1, 芽孢产量为6.16×109 CFU·mL-1, 芽孢产量较初始值(6.5×108 CFU·mL-1)提高了8.48倍。
2.6 100 L发酵罐验证试验在摇瓶优化基础上(即发酵培养基组成:麸皮10.35 g·L-1、玉米粉12.5 g·L-1、豆粕25 g·L-1、CaCO3 1.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 2.0 g·L-1、NaCl 4.41 g·L-1; 培养条件:接种量4%、初始pH6.0、装液量60 L/100 L、通气量3 m3·h-1、转速220 r·min-1、温度36 ℃、罐压0.06 MPa)进行发酵培养, 每隔3 h取样检测, 绘制其生长曲线(图 8)。由图 8可以看出:在培养36 h时, 发酵液中芽孢产量最高, 达7.33×109 CFU·mL-1, 略高于摇瓶发酵结果, 由此可知摇瓶优化工艺较稳定, 可用于NTGB-178扩大化生长。
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图 8 中试发酵生产曲线 Figure 8 The production curve of pilot fermentation |
本试验确定了枯草芽孢杆菌NTGB-178的最佳产孢条件, 其中最适培养基组成为:麸皮10.35 g·L-1, 玉米粉12.5 g·L-1, 豆粕25 g·L-1, CaCO3 1.0 g·L-1, MgSO4·7H2O 2.0 g·L-1, NaCl 4.41 g·L-1; 最适培养条件为:初始pH6.07, 接种量4%, 装液量65 mL/250 mL, 培养温度36 ℃, 摇床转速220 r·min-1, 培养时间36 h。优化后发酵液中生物量为6.55×109 CFU·mL-1, 芽孢产量为6.16×109 CFU·mL-1, 较优化前提高了8.48倍。在100 L发酵罐放大培养条件下, 芽孢产量最高为7.33×109 CFU·mL-1。
传统的发酵优化一般采用单因素与正交试验结合的方法[11-12], 该法一般步骤繁琐, 工作量大。响应面法是一种解决多变量问题的高效统计法[13], 通过设计合理的有限次数试验, 更加快速、直观、准确地确定多因素系统的最优条件, 缩短试验周期, 近几年来在生物学领域应用广泛[14-17]。
本试验结果表明, 麸皮、玉米粉、豆粕完全可以代替蔗糖与蛋白胨进行芽孢杆菌发酵。其中, 以麸皮10.35 g·L-1、玉米粉12.5 g·L-1、豆粕25 g·L-1组配的培养基效果最优, 其中麸皮与豆粕为农产品加工过程中的下脚料, 玉米粉由玉米直接粉碎而来。相比于传统微生物发酵常用的葡萄糖、蔗糖、蛋白胨等培养基组分, 这些组分来源广、廉价易得, 有利于降低菌剂生产成本。研究表明, 传统培养基培养芽孢杆菌, 其中蔗糖和蛋白胨每升0.2元, 而用该配方培养芽孢杆菌, 其中麸皮、玉米粉、豆粕每升0.01元, 总体上比传统配方每升降低了0.19元成本。利用该培养基生产NTGB-178不但降低了成本且芽孢产量高, 其发酵液中的芽孢含量高达6.55×109 CFU·mL-1。近年来, 将麸皮、糖蜜、玉米粉、黄豆粉、豆粕等廉价碳、氮源用于发酵生产的研究越来越多, 如Chen等[18]利用玉米粉、豆粉以及酵母粉作为枯草芽孢杆菌WHK-Z12的碳、氮源。Yánez等[19]利用大豆粉与糖蜜发酵枯草芽孢杆菌CPA-8, 最大生物量达3×109 CFU·mL-1。Rao等[20]利用乳糖、木薯淀粉、(NH4)2SO4、蛋白胨作为培养基碳、氮源, 发酵后芽孢产量达5.93×109 CFU·mL-1。Zhang等[21]以玉米粉和黄豆粉作为生防芽孢杆菌Z-14的碳、氮源, 芽孢产量达1.85×109 CFU·mL-1。在优化无机盐单因素试验中, 发现添加NaCl、MgSO4·7H2O、CaCO3可显著提高发酵液中的活菌数与芽孢产量, 这与Posada-Uribe等[22]与王金玲等[23]研究芽孢杆菌发酵时得出的结论相似。
发酵条件优化时, 发现NTGB-178最适pH值为6.5±0.1, 说明该菌在偏酸性环境生长较好, 温度在42~50 ℃时其生物量与芽孢产量明显下降, 说明该菌不耐高温, 且温度对芽孢产量影响显著。Díaz-García等[24]也报道, 温度是影响芽孢产量的主要影响因子之一。
本研究通过优化发酵培养基组分与发酵条件, 显著提高了NTGB-178发酵液的生物量与芽孢产量, 且优化后获得的培养基成分简单且价廉易得, 这为NTGB-178菌剂工业化扩大生产奠定了基础。
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