文章信息
- 吴丹, 宋爱萍, 史亚东, 陈发棣, 房伟民, 陈素梅, 管志勇
- WU Dan, SONG Aiping, SHI Yadong, CHEN Fadi, FANG Weimin, CHEN Sumei, GUAN Zhiyong
- ‘滁菊’病毒脱除及脱毒苗品质分析
- Virus elimination and quality evaluation of virus-free seedlings in Chrysanthemum morifolium 'Chuju'
- 南京农业大学学报, 2017, 40(6): 983-992
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(6): 983-992.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201702024
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文章历史
- 收稿日期: 2017-02-21
2. 安徽菊泰滁菊草本科技有限公司, 安徽 滁州 239000
2. Anhui Jutai Herbal Tea Technology Company, Chuzhou 239000, China
‘滁菊’(Chrysanthemum morifolium‘Chuju’)为菊科菊属多年生草本植物, 是菊花的一个栽培品种, 俗称甘菊、白菊, 素有“金心玉瓣, 翠蒂天香”之美誉。因栽培历史悠久, 品质优良, 被列为四大药菊之首, 具有较高的茶用及药用价值[1]。2002年, ‘滁菊’成为中华人民共和国原产地域产品; 2005年被正式确认为国家地理标志产品; 2009年, ‘滁菊’被纳入国家地理标志产品目录[2]。近年来, ‘滁菊’的栽培面积逐步扩大, 但由于菊花生产周期中易感蚜虫, 病毒感染较普遍, 且栽培过程中农户自留种苗、种源质量无法保证, 长期营养繁殖带来‘滁菊’病毒的传播和积累, 导致‘滁菊’种质退化, 花色劣变, 花朵品质差等现象愈加严重, 严重阻碍和制约了‘滁菊’产业化的发展[3]。据报道, 目前侵染菊花的病毒或者类病毒大约有20余种, 主要有菊花B病毒(CVB)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、番茄不孕病毒(TAV)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、菊花矮化类病毒(CSVd)、菊花褪绿斑驳病毒(CChmvd)8种[4]。
分子生物学技术的迅猛发展为病毒检测提供了一种新的途径, 其灵敏度高、特异性强、检测速度快、操作简便, 在田间早期的病毒病防控和生产实践中意义重大。目前病毒检测主要采用多聚酶链式反应技术, 包括巢式RT-PCR[5]、多重RT-PCR[6]、荧光定量PCR[7]以及环介导等温扩增技术[8]等。
病毒脱除是指种苗经过一系列物理、化学、生物或其他生物技术措施脱除体内的病毒后, 获得不含病毒或极少带毒的植株的过程。目前已建立多种脱除病毒的方法, 从利用喷洒农药杀死传播媒介昆虫, 到通过转基因技术诱导植株产生抗性等, 但应用最广泛的是通过植物组织培养技术对植物进行脱毒[9]。植物组培脱毒包括茎尖分生组织培养脱毒[10], 热处理结合茎尖分生组织脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织脱毒、化学试剂结合茎尖分生组织培养脱毒[11], 珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒[12]等。
为明确传统生产区中‘滁菊’感染的主要(类)病毒种类以及有效脱除‘滁菊’感染的(类)病毒, 本研究比较了3种方法对‘滁菊’病毒的脱除效果, 并对脱毒植株的遗传稳定性和茶用品质进行了评价, 建立了‘滁菊’脱毒技术体系, 为‘滁菊’脱毒苗的生产和推广提供了科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料供试材料为安徽菊泰滁菊草本科技有限公司提供的非脱毒和疑似感染病毒的‘滁菊’, 分别采用混合随机取样的方法, 取样地点均为滁州市南谯区大柳镇。疑似感染病毒的‘滁菊’取自农户传统生产田, 种苗为农户常年自留、自繁苗。田间表现为:植株茎干细弱, 冠丛矮小, 花径变小, 花瓣明显减少, 单花质量减轻, 减产明显, 与同一区块的采用同样栽培措施的脱毒苗生产田相比, 产量仅为其80%左右, 并且花朵外观品质显著下降。
1.2 ‘滁菊’病毒电镜检测和巢式PCR检测参照王洪星[13]建立的方法进行病毒提纯, 提纯病毒采用20 g·L-1磷钨酸(PTA)进行常规负染色法染色[14]。将提纯病毒稀释20倍, 取1滴滴在铜网上, 2 min后用滤纸吸干, 再滴1滴2%磷钨酸水溶液, 1 min后用滤纸吸干, 自然干燥后, 在透射电子显微镜(日本HITACHI, 日立H-7650)下观察病毒粒体形状。
根据GenBank登录的侵染菊花的8种(类)病毒, 即菊花B病毒(CVB)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、番茄不孕病毒(TAV)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、菊花矮化类病毒(CSVd)、菊花褪绿斑驳病毒(CChmvd)的基因序列, 利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计。针对上述8种基因序列, 分别设计巢式RT-PCR引物各2对。参照Coy等[15]建立的方法进行巢式RT-PCR病毒检测。目的条带测序送南京思普金基因科技公司完成。
1.3 ‘滁菊’再生体系建立及茎尖培养适宜培养基筛选将经检测感染病毒的‘滁菊’植株茎段进行外植体表面灭菌, 参考尤燕平等[16]建立的外植体表面灭菌方法, 其中HgCl2处理时间增至8 min。
以MS为基本培养基, 添加不同质量浓度的6-BA(0、1.0、2.0 mg·L-1)和NAA(0、0.1、0.5 mg·L-1)以期找到最适茎尖生长的条件。每个质量浓度接种10个茎尖, 3次重复。
1.4 不同方法脱毒处理 1.4.1 茎尖分生组织培养法将生长良好的无菌苗在体视显微镜下用解剖针剥取带有1~3个叶原基、长度为0.3~0.7 mm[17]的茎尖分生组织, 接种在含有6-BA/NAA最适浓度的MS培养基上培养, 每次接种30个茎尖, 重复3次。
1.4.2 热处理结合茎尖分生组织培养法采用邓衍明等[18]的方法并稍改动。将生根阶段的健壮无菌苗放在光照培养箱中培养, 光照度1 500~2 000 lx, 采用变温升温的处理方式, 即白天温度从26 ℃开始, 每2 d升温2 ℃, 最后升至38 ℃; 夜间采取同样的方式从起始温度20 ℃开始, 每2 d升温2 ℃, 升至30 ℃为止。完成升温处理后继续保持温度昼/夜为38 ℃/30 ℃40 d, 每次接种30个茎尖, 3次重复。光照时间为白天16 h, 将热处理的幼苗进行茎尖分生组织培养。
1.4.3 病毒唑结合茎尖分生组织培养法采用赵霜等[17]的方法, 设置3组不同病毒唑浓度:5、10、20 mg·L-1, 不含病毒唑为对照。将0.3~0.7mm茎尖放置于添加不同浓度病毒唑的培养基(MS+0.4 mg·L-1 6-BA+0.04 mg·L-1 NAA)中, 每个处理接种茎尖15个。
1.5 脱毒苗脱毒效果检测及扩繁和生根当脱毒苗生长至3~4 cm后取2~3片叶放入液氮保存, ‘滁菊’总RNA的提取按照Trizol试剂盒说明书(TaKaRa)进行, cDNA的合成参照M-MLV RNase cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)的说明书进行; 参照上述巢式RT-PCR步骤检测脱毒效果, 经验证脱毒成功的脱毒苗进行组培扩繁和生根。
1.6 脱毒苗遗传稳定性分析在3种脱毒方法获得的脱毒苗及对照苗中分别随机抽取5株作为遗传稳定性试验材料, 参照张飞等[19]的方法进行SRAP遗传稳定性分析。
1.7 脱毒苗移栽及与非脱毒苗产量和品质比较当脱毒苗长至4~5 cm时炼苗, 其后将其转移到含有营养土、珍珠岩和蛭石混合物(质量比为2:1:1)的穴盘中生长。
将非脱毒苗与检测脱毒成功的脱毒苗分别定植于大田, 每个小区定植30株, 6次重复, 随机区组排列。于盛花期分批采收, 统计单株产量。称取非脱毒苗、脱毒苗花朵各0.1 g, 采用舒俊生等[20]建立的乙醇超声波提取总黄酮方法, 选用紫外分光光度计测定其含量; 参考《中华人民共和国药典》(2010年版)中测定绿原酸的方法测定绿原酸含量。
1.8 数据统计与分析采用齐军山等[21]的方法进行数据统计与分析。试验数据采用Excel 2013进行统计与整理, 检测数据满足正态分布及方差齐性后进行单因素ANOVA方差分析和差异性显著检测(P<0.05)。
2 结果与分析 2.1 ‘滁菊’病毒电镜观察和巢式PCR检测结果由图 1可见:在透射电子显微镜下可观察到杆状的病毒粒子。该病毒粒子形态与Hakkaart[22]报道的菊花B病毒的病毒粒子形态高度吻合, 均为略弯曲的线状, 大小为685 nm×12 nm, 样品中病毒含量较高, 并具有较高的纯度, 基本没有可见形态杂质。而在采集的健康无病症的‘滁菊’叶片中则未观察到类似颗粒。
由图 2和图 3可见:在各检测样品中CVB和CSVd引物对能够扩增出明显的目的条带而其他6种病毒或类病毒(TAV、PVX、PVY、TMV、CMV、CChMVd)均无目的条带, 健康植株也无扩增片段。CVB、CSVd测序结果:第1轮产物大小分别为621、211 bp, 第2轮产物大小分别为381、163 bp。
用BLAST软件进行序列同源性分析, 结果表明:样品中所测外壳蛋白扩增片段与GenBank中对应序列(EU499736.1)的核苷酸同源性为90%, 从而确定该扩增片段的病毒种类为CVB的外壳蛋白。同时也证明了CVB病毒的基因序列具有保守区, 根据其CP序列设计的引物也有广泛的适用性, 可以扩增出CVB病毒基因的特异性片段。另一扩增片段与GenBank中对应序列(KU535582.1)的核苷酸同源性为100%, 说明样品中含有菊花矮化类病毒。
2.2 ‘滁菊’茎尖分生组织培养适宜培养条件和病毒唑结合茎尖分生组织培养最适浓度的确定由表 1可知:不同质量浓度的6-BA和NAA对‘滁菊’茎尖的诱导存活率影响不同。当6-BA为1.0 mg·L-1、NAA为0.1 mg·L-1时‘滁菊’茎尖诱导存活率最高, 为53.30%;直接接种于MS培养基上的存活率最低为20.00%, 这可能是由于无生长调节剂提供必要的生长条件而导致; 当添加1.0 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA时, 存活率略有升高, 但有部分幼苗出现玻璃化现象; 当6-BA为2.0 mg·L-1时, 丛生芽形成增多, 但幼苗都较瘦弱, 细长, 叶片小, 长势明显弱于其他浓度处理。
生长调节剂/(mg·L-1)Growth regulator | 接种数 Inoculability number |
成活数 Live number |
诱导存活率/% Induced survival rate |
|
6-BA | NAA | |||
0 | 0 | 30 | 6 | 20.00±0.088c |
1.0 | 0.1 | 30 | 16 | 53.30±0.067a |
1.0 | 0.5 | 30 | 9 | 30.00±0.011bc |
2.0 | 0.1 | 30 | 11 | 36.67±0.012abc |
2.0 | 0.5 | 30 | 13 | 43.33±0.033ab |
注:同列中不同字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异。 Note:Values within a column followed by different letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level. The same as follows. |
由图 4可见:‘滁菊’茎尖分生组织接种到MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA一周后转绿, 形成膨大的叶原基(图 4-a); 茎尖生长12 d后, 叶原基生长形成黄绿色的愈伤组织, 后生长成为带有嫩叶的芽点(图 4-b); 20 d以后, 茎尖继续生长逐渐分化成苗(图 4-c、d)。
如表 2所示:当添加不同质量浓度的病毒唑时, 茎尖诱导存活率也有所不同。不添加病毒唑时茎尖诱导存活率最高, 为86.67%;当病毒唑质量浓度为10 mg·L-1时茎尖诱导存活率较高, 为80.00%, 植株表现出叶片浓绿, 茎杆粗壮; 当病毒唑质量浓度为20 mg·L-1时, 有部分茎尖出现了褐化、停止生长的现象, 愈伤组织形成率最低, 为53.30%。这可能是由于高质量浓度的病毒唑影响‘滁菊’的生长代谢, 出现生长受抑制的现象。
病毒唑质量浓度/(mg·L-1) Ribavirin concentration |
接种数 Incurability number |
成活数 Live number |
诱导存活率/% Induced survival rate |
0 | 15 | 13 | 86.67±0.088a |
5 | 15 | 9 | 60.00±0.100bc |
10 | 15 | 12 | 80.00±0.012ab |
20 | 15 | 8 | 53.30±0.012c |
由表 3可见:茎尖分生组织培养的存活率最高, 达到77.78%;热处理结合茎尖分生组织培养的诱导存活率较低, 为54.44%;病毒唑结合茎尖分生组织培养的诱导存活率为71.11%。说明无论是热处理还是病毒唑处理对茎尖的存活都具有一定的影响, 热处理过程中有部分茎尖出现褐化或者接种在培养基上处于停滞生长阶段, 叶片部分白化。这可能是由于茎尖无法抵抗高温而造成的死亡。
脱毒方法 Virus-elimination methods |
接种数 Incurability number |
成活数 Live number |
诱导存活率/% Induced survival rate |
茎尖分生组织培养Shoot-tip tissue culture | 90 | 70 | 77.78±0.011a |
热处理结合茎尖培养Thermotherapy combined with shoot-tip tissue culture | 90 | 49 | 54.44±0.618b |
病毒唑结合茎尖培养Ribavirin combined with shoot-tip tissue culture | 90 | 64 | 71.11±0.067ab |
采用巢式RT-PCR法对‘滁菊’脱毒苗进行病毒检测, 结果(图 5)显示:脱毒成功后电泳图上呈现阴性反应, 无特异性条带, 相反未脱毒成功则仍能扩增出特异目标条带, 感染CVB的第2轮反应产物大小为381 bp, 感染CSVd的第2轮产物大小为163 bp。
由表 4可知:3种不同的脱毒处理方法对‘滁菊’苗的脱毒率具有显著影响, 当CVB和CSVd都脱除时, 热处理结合茎尖分生组织培养和病毒唑结合茎尖分生组织培养的脱毒率之间无显著差异, 分别为35.21%、36.62%, 但与茎尖分生组织培养差异显著; 只脱除CSVd类病毒时, 病毒唑结合茎尖分生组织培养的脱毒率较高, 为46.48%;只脱除CVB病毒时, 热处理结合茎尖分生组织培养的脱毒率较高, 为63.38%。
脱毒方法 Virus-elimination methods |
样本数 Samples |
脱除CSVd CSVd-free | 脱除CVB CVB-free | 脱除CVB+CSVd CVB+CSVd-free | |||||
数量No. | 脱除率/% Elimination rate | 数量No. | 脱除率/% Elimination rate | 数量No. | 脱除率/% Elimination rate | ||||
茎尖分生组织培养 Shoot-tip tissue culture |
77 | 16 | 20.78±0.053b | 34 | 44.16±0.015b | 13 | 16.88±0.017b | ||
热处理结合茎尖培养 Thermotherapy combined with shoot-tip tissue culture |
71 | 26 | 36.62±0.071ab | 45 | 63.38±0.069a | 25 | 35.21±0.036a | ||
病毒唑结合茎尖培养 Ribavirin combined with shoot-tip tissue culture |
71 | 33 | 46.48±0.082a | 35 | 49.30±0.080ab | 26 | 36.62±0.059a |
将不同脱毒处理获得的‘滁菊’脱毒苗接种到MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培养基上进行增殖, 40 d左右增殖继代1次, 不同脱毒方法的幼苗均可以成功诱导茎段出芽(图 6)。
当脱毒苗长至3~4 cm, 具有2~3片叶时, 可切取‘滁菊’脱毒苗顶芽接种到MS生根培养基中进行培养, 培养7 d后, 茎基部出现小突起, 后长成根。培养28 d后, 发现3种脱毒处理的植株均能生根, 形成完整植株, 生根状况良好, 根系粗壮、发达、数量也较多, 叶色浓绿, 叶片较大, 茎段增粗(图 6)。
2.5 3种脱毒方法获得的‘滁菊’脱毒苗遗传稳定性分析前期从多对SRAP引物组合中初步筛选出了12对带型清清晰的引物组合, 利用初步筛选出的12对带型清晰的引物对3种脱毒方法获得的脱毒苗及对照进行SRAP扩增, 结果(图 7)显示:12对引物共扩增出了清晰条带164条, 遗传距离都在0.006 cM以下, 谱带的大小为100~2 000 bp, 未发现经脱毒处理再生的‘滁菊’苗与对照苗的扩增条代数及条带亮度上有明显差异。表明不同的脱毒方法在脱毒过程中DNA水平上没有检测到存在遗传变异, 未影响‘滁菊’的遗传稳定性。
2.6 ‘滁菊’脱毒苗与非脱毒苗产量和品质的比较根据质量浓度(C)与吸光值(A)的关系求得‘滁菊’总黄酮和绿原酸的回归方程分别为:Y=0.006 2X-0.002, R2=0.999 2;Y=24.475X+7.742 9, R2=0.998 5。
由表 5可见:‘滁菊’脱毒苗的花径、单株开花数、单株产量分别比非脱毒苗高4.5%、21.2%、24.0%, 单花质量与非脱毒苗相比没有显著差异。
‘滁菊’脱毒苗的总黄酮含量为21.53 mg·g-1, 与对照相比没有显著差异; 脱毒苗绿原酸含量与非脱毒苗相比差异显著, 比非脱毒苗高9.0%。这表明脱毒后‘滁菊’的品质得到了一定的提高。
处理 Treatment |
单花质量/g Weight of one flower |
花直径/mm Diameter of flower |
单株花数 No.of flowers |
单株产量/g Yield per plant |
总黄酮含量/(mg·g-1) Total flavone content |
绿原酸含量/(mg·g-1) Chlorogenic acid content |
脱毒苗 Virus-free seedling |
1.52±0.036a | 53.72±0.66a | 188.89±22.53a | 245.39±21.05a | 21.53±1.06a | 1.93±0.11a |
非脱毒苗 Non-virus-free seedling |
1.46±0.029a | 51.40±0.34b | 155.79±5.88b | 197.78±11.66b | 20.19±0.78a | 1.77±0.02b |
植物病毒对园艺植物的侵染造成产量下降和品质降低, 导致巨大的经济损失[23]。本研究确定了滁州大柳地区农户传统生产田‘滁菊’感染的主要(类)病毒为CVB和CSVd, 而其他6种可能感染‘滁菊’的病毒或类病毒未检出, 这可能是由于病毒系统间存有相互干涉现象, 当植物被一种病毒侵染, 则其同类或近缘病毒就不再侵染, 出现了交叉保护作用或干涉作用[24]。
Verma等[25]利用茎尖分生组织培养的方法进行菊花的黄瓜花叶病毒的脱毒, 获得了73%的脱毒效率; Tan等[26]通过比较不同温度对苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果茎痘病毒(ASPV)脱除的影响时发现梨在42 ℃(白天)/34 ℃(夜晚)处理55 d以上达到了较高的脱毒率。本试验在昼/夜温度为38 ℃/30 ℃下持续处理‘滁菊’苗40 d后, CVB和CSVd脱除的效率都达到35.21%, 明显提高了脱毒率; 抗病毒复合物病毒唑可有效抑制病毒复制, 已经广泛应用在苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)[27]和菊花矮化类病毒(CSVd)[28]等病毒中。本试验发现20 mg·L-1高浓度的病毒唑可能会导致部分茎尖分生组织的死亡, 导致茎尖生长缓慢, 部分褐化死亡并且出现幼苗黄化、玻璃化的现象, 这与Mahfouze等[29]的报道一致。
本试验所采用的3种脱毒方法各有优势, 茎尖分生组织培养的茎尖诱导存活率较高, 但脱毒率最低, 这与赵霜等[17]的研究一致。热处理结合茎尖分生组织培养和化学试剂病毒唑结合茎尖分生组织培养相比茎尖分生组织培养效果更好:病毒唑处理在脱去CSVd类病毒时效果较好, 但长时间的病毒唑培养容易使幼苗细长, 长势较弱; 热处理结合茎尖分生组织培养脱毒效率较高, 但前期处理时间较长, 且不同品种耐热性也有差异。建议在实践中根据实际染病程度、试验条件等选择不同的脱毒方法, 以达到理想的脱毒效果。
有研究证明当植株通过愈伤组织分化出不定芽等过程中变异率较高时, 容易产生无性系变异[30]。保持‘滁菊’优良种性是其脱毒种苗在产业推行的决定因素。利用SRAP分子标记技术能够快速对脱毒后的种苗的遗传背景进行高分辨率的鉴别比较[31]。本研究中对‘滁菊’脱毒苗和对照苗利用12对引物进行扩增, 未出现任何差异条带, 表明3种脱毒处理均未影响‘滁菊’的遗传稳定性。这与采用茎尖分生组织培养结合超低温处理百合脱毒苗的检测结果一致[32]。
由于脱除了体内所带的病毒, ‘滁菊’表现出强劲的生长势。脱毒种苗的单株产量、单株花数、花径均优于非脱毒苗; 脱毒的‘滁菊’花径更大, 单花更重, 脱毒‘滁菊’的总黄酮、绿原酸含量均有所提高, 达到或超过2010版《中华人民共和国药典》的规定标准, 这与代丽萍[33]在对脱毒亳菊有效成分测定的结果类似。高产量和品质的‘滁菊’脱毒苗的推广对产业发展将有极大的促进作用。
本研究在试验方案设计及试验设备上得到王广东副教授的无私帮助, 在此表示感谢。
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