南京农业大学学报  2017, Vol. 40 Issue (6): 977-982   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201702012
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文章信息

张勇, 侍婷, 吴欣欣, 高志红
ZHANG Yong, SHI Ting, WU Xinxin, GAO Zhihong
果梅CCoAOMT蛋白Western-blot体系建立与优化
Establishment and optimization of Western-blot system for CCoAOMT protein in Prunus mume
南京农业大学学报, 2017, 40(6): 977-982
Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(6): 977-982.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201702012

文章历史

收稿日期: 2017-02-13
果梅CCoAOMT蛋白Western-blot体系建立与优化
张勇, 侍婷, 吴欣欣, 高志红    
南京农业大学园艺学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在建立一套适合于果梅(Prunus mume)Western-blot的蛋白质提取和技术体系。[方法]以果梅品种‘小绿萼’花芽为试验材料,以咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)为目标蛋白,分别采用Tris-HCl法和SDS上样缓冲液直接提取法,比较2种提取方法的优劣,并通过设置不同的蛋白上样量(20、30、40、50及60 μg)、转膜时间(40、60及90 min)、一抗稀释比例(1:500、1:1 000、1:2 000及1:5 000)以及一抗孵育时间(室温1 h、室温2 h及4℃过夜)等组合,研究适合果梅花芽CCoAOMT蛋白Western-blot的最佳体系。[结果]成功建立了快速、灵敏、特异的Western-blot体系,确定了果梅花芽CCoAOMT蛋白的Western-blot试验条件。SDS上样缓冲液直接提取法提取蛋白快速、高效,最佳条件为以蛋白上样量30 μg、转膜1 h、一抗稀释比例1:1 000以及一抗孵育2 h。[结论]本试验建立了简单、快速和重复性好的SDS上样缓冲液直接提取法以及优化的上样量、转膜时间和抗体浓度等Western-blot体系,为梅等木本植物开展Western-blot研究提供依据。
关键词果梅   花芽   蛋白提取   咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)   Western-blot   
Establishment and optimization of Western-blot system for CCoAOMT protein in Prunus mume
ZHANG Yong, SHI Ting, WU Xinxin, GAO Zhihong    
College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The paper aims to establish the method which is appropriate for protein extraction and Western-blot analysis of Prunus mume. [Methods] We used flower buds of Prunus mume 'Xiaolüe' as the plant material and PmCCoAOMT as the target protein. Tris-HCl method and SDS loading buffer method were used to extract flower bud protein, respectively. Furthermore, we analyzed advantages and disadvantages of two methods by comparing Tris-HCl method with SDS loading buffer method. In order to study the optimum Western-blot system for CCoAOMT protein of Japanese apricot, different weights of protein samples (20, 30, 40, 50 and 60 μg), transmembrane time (40, 60 and 90 min), primary antibody concentration (1:500, 1:1 000, 1:2 000 and 1:5 000)and incubation time of primary antibody (at room temperature for 1 h, at room temperature 2 h and at 4℃ for overnight)were tested. [Results] The rapid, sensitive and specific Western-blot system has been established successfully, and the experimental Western-blot condition of CCoAOMT protein in the flower bud of Japanese apricot was determined. SDS loading buffer extraction method was more rapid and efficient. The optimal conditions were weight of protein samples (30 μg), transmembrane time (1 h), primary antibody concentration (1:1 000)and incubation time of primary antibody (2 h). [Conclusions] The SDS loading buffer direct extraction method is simple, rapid and reproducible, which provides the basis for the extraction of woody plant protein and the research of Western-blot.
Key words: Prunus mume    flower bud    protein extraction    caffeoyl-coA-O-methyl transferase(CCoAOMT)    Western-blot   

梅(Prunus mume)是原产于中国的蔷薇科植物, 根据用途一般分为花梅和果梅。梅果实含有丰富的有机酸, 健胃消食, 主要用于果脯、饮品加工等, 具有重要的经济价值, 远销日本、韩国等地, 是我国主要的出口创汇果品之一[1]。梅雌蕊的正常发育对果实的产量起着至关重要的作用, 然而果梅雌蕊败育的现象十分普遍。Shi等[2]利用双向电泳发现了果梅完全花与不完全花之间重要的差异蛋白咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(caffeoyl-coA-O-methyl transferase, CCoAOMT)。CCoAOMT是植物木质素合成中的一个关键酶, 负责木质素合成中芳香环上羟基的甲基化, 主要调控G型木质素合成[3]。木质素是一种复杂的芳香族复合物, 主要存在于次生加厚细胞的细胞壁中, 能够增加植物的硬度和抗压强度, 同时赋予植物抵抗伤害、病原体侵染、代谢胁迫及细胞内部紊乱等生物和非生物胁迫的能力[4-6]。此外, 木质素还在花序茎弯曲和断裂中起主要作用[3, 7]。研究发现, PmCCoAOMT基因的表达量在果梅雌蕊分化前期(9、10月份)高于雌蕊分化后期, 并且在完好雌蕊和雌蕊褐色情况下的花芽中表达量高于雌蕊畸形和无雌蕊花芽中的表达量, 根据这一结果推测其很可能在雌蕊中发挥作用[8]

植物组织蛋白提取是蛋白组学研究的关键。TCA/丙酮沉淀法(TCA/acetone)是一种经典的植物蛋白提取方法, 该方法常用于幼嫩组织中蛋白的提取[9]。酚抽提法也被广泛用于植物组织蛋白提取, 该方法对多糖含量较多的组织和顽拗植物组织效果表现较好[10]。Tris-HCl法对箭毒木种子[11]、苹果叶片[12]的提取效果非常好, 所得蛋白图谱效果明显比用TCA/丙酮法提取的效果好。此外, 目前提取植物蛋白的常用方法还有Tris-丙酮-酚法[13]、Trizol沉淀法[14]、尿素-硫脲提取法[15]和PEG分级沉淀法[16]等。研究者们根据不同的植物组织特点和蛋白种类, 往往选取适当的提取方法并进行改进以达到最佳提取效果[17-20]

Western印迹(Western-blot)是一种半定量分析生物组织蛋白质表达的比较常见的方法, 是蛋白质分析的常用分子生物学技术之一。目前, 鲜有关于梅Western-blot研究的报道, 从果梅花芽中提取高质量的总蛋白, 是开展果梅Western-blot研究的前提。关于果梅花芽总蛋白质的提取已有报道, 但是仅用于果梅双向电泳分析[21-22]。采用传统方法获得的结果背景较高、非特异性条带较多, 且试验操作较繁杂、耗时长、成本高。本试验从蛋白提取、转膜、抗体浓度、抗体孵育时间等方面进行了优化改良, 旨在建立一套快速、特异、灵敏地分析梅花芽蛋白质表达的Western-blot体系, 为CCoAOMT蛋白及其他蛋白的Western-blot试验奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试材料为果梅品种‘小绿萼’, 采自南京农业大学国家果梅种质资源圃。取休眠期花芽, 用干净的镊子将花芽的鳞片去除, 放入冻存管在液氮中经瞬时冷却后保存在-80 ℃备用。

1.2 仪器

主要仪器包括:冷冻离心机, 购于德国Eppendorf公司; BG-blotMINI迷你垂直转印电泳仪, 购于北京百晶生物科技有限公司; VersaDoc MP4000凝胶成像仪, 购于美国Bio-Rad公司; Spectra Max i3x酶标仪, 购于美国Molecular Devices公司。

1.3 蛋白质的提取及浓度测定 1.3.1 果梅花芽蛋白质的提取

SDS上样缓冲液直接提取法:准备25~30 mg样品加入2 mL离心管中, 液氮研磨至粉末; 加入100~150 μL SDS loading buffer(pH6.8, 1.0 mol·L-1 Tris-HCl 1.0 mL, SDS 0.4 g, 溴酚蓝2.0 mg, 甘油2.0 mL, β-巯基乙醇50 μL, 双蒸水定容至20 mL)研磨至匀浆, 短暂离心(8 000 g, 4 ℃), 煮沸5 min, 离心(12 000 g, 15 min, 4 ℃), 取上清液备用。

Tris-HCl法:参照谷瑞升等[23]的方法, 并稍作改进。取0.1 g花芽, 液氮研磨后置于2 mL离心管中, 加0.1 g交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和0.9 mL蛋白质提取缓冲液(pH6.8, 1.0 mol·L-1 Tris-HCl 0.625 mL, SDS 50 mg, β-巯基乙醇500 μL, 双蒸水定容至10 mL), 涡旋后4 ℃放置1 h, 12 000 g离心20 min。取上清液0.3 mL转移至2 mL离心管中, 加入0.9 mL预冷丙酮, 混匀后-20 ℃放置1 h以沉降蛋白质, 5 000 g离心10 min, 弃上清液, 待丙酮完全挥发后加入200 μL上样缓冲液(pH6.8, 1.0 mol·L-1 Tris-HCl 0.625 mL, SDS 50 mg, 甘油2.0 mL, β-巯基乙醇1.0 mL, 溴酚蓝2.0 mg, 双蒸水定容至10 mL)溶解蛋白质, 混匀。煮沸5 min, 离心(12 000 g, 15 min, 4 ℃), 取上清液备用。

1.3.2 蛋白质浓度的测定

用非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]测定蛋白质浓度, 测定480 nm波长下的吸光值, 绘制标准曲线, 计算样品中蛋白质总量。

1.4 果梅花芽蛋白的Western-blot

参照郑亚军等[24]的方法配制12%分离胶及5%浓缩胶。80 V电泳40 min, 待条带迁移至分离胶上缘时调整电压为120 V电泳直至条带迁移至底端1 cm。使用0.45 μm NC膜进行湿转法电转移, 120 mA恒流, 设置时间梯度为40、60、90 min。转膜结束后用丽春红染色液对硝酸纤维素膜染色, 观察条带。室温下在封闭液(pH7.4, 磷酸盐缓冲液100 mL, 50 μL吐温-20, 脱脂奶粉5.0 g)溶液中封闭1 h。室温下孵育盒中一抗(1:500、1:1 000、1:2 000、1:5 000稀释)摇动孵育1 h、2 h和4 ℃过夜。然后用PBST(pH7.4, 磷酸盐缓冲液100 mL, 50 μL吐温-20)漂洗3次, 每次5 min。二抗1:1 000稀释室温孵育1 h, PBST漂洗3次, 每次5 min。加ECL发光剂暗盒中显色3 min。用VersaDoc MP4000凝胶成像仪拍照。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2003计算试验数据标准曲线及平均值, 并用PDQuest 8.0和Adobe PhotoShop CS6制图。

2 结果与分析 2.1 不同蛋白提取方法的比较

表 1可以看出:2种方法提取的蛋白质效果差异较大, Tris-HCl法所需的样品量多、花费时间长, 而获得的蛋白质浓度、总量明显低于SDS上样缓冲液直接提取法。SDS上样缓冲液直接提取法所需时间短, 只需0.5 h左右完成, 所需样品量少, 仅为Tris-HCl法的1/3, 但获得的蛋白质浓度及蛋白质总量却明显高于Tris-HCl法, 并且完全满足后续电泳和Western-blot的需求。

表 1 2种提取果梅花芽总蛋白方法的比较 Table 1 Comparison of two methods of total protein extracted from buds in Prunus mume
提取方法
Extraction method
所需时间/h
Time
样品量/g
Sample weight
蛋白质质量浓度/(μg·μL-1)
Protein concentration
蛋白质总量/μg
Protein quality
过程
Process
SDS上样缓冲液直接提取法
SDS loading buffer method
0.5 0.03 6.08±0.05A 608.38±4.98a 简易
Easy
Tris-HCl法
Tris-HCl method
3.0 0.10 4.34±0.14B 520.82±16.84b 复杂
Complex
  注:不同大、小写字母表示在0.01和0.05水平上差异显著。
  Note:Different capital and lowercase letters indicate significant difference at 0.01 and 0.05 levels.

用CCoAOMT蛋白抗体检测2种果梅花芽蛋白提取效果, 结果表明, 均能检测到目标蛋白CCoAOMT的条带, 且2种方法条带亮而清楚, 并无明显差异(图 1)。因此, 从提取效率和Western-blot效果来看, SDS上样缓冲液直接提取法获得的花芽蛋白质适宜果梅Western-blot分析, 且提取过程优于传统的Tris-HCl法。

图 1 不同提取方法的蛋白Western-blot分析 Figure 1 Western-blot of protein extracted by different methods 1、2.Tris-HCl法; 3、4.SDS上样缓冲液直接提取法。 1, 2.The method of Tris-HCl; 3, 4.The method of SDS loading buffer method.
2.2 上样量的选择

图 2可见:随着上样量增加, 目的条带的信号强度逐渐增强。上样量过少, 会造成目的条带成像不足, 难以显现; 上样量过多会造成成像条带过粗, 掩盖其他分子质量接近的蛋白条带, 并且与相邻泳道条带连接, 无法进行分析。当上样量大于50 μg时, 条带过粗, 不利于结果分析; 当上样量在20~40 μg时, 目的条带信号强度差异不大, 故适宜的上样量在20 μg至40 μg之间。

图 2 不同上样量的Western-blot分析 Figure 2 Western-blot analysis of different volume of protein samples
2.3 最佳转膜时间的确定

从转膜后凝胶的染色是否残留有目的蛋白判断, 转膜40 min后凝胶上70×103蛋白Marker以下仍然可以看到蛋白带; 而转膜60 min和90 min后凝胶上70×103蛋白Marker以下无明显蛋白带。最后的检测结果(图 3)发现, 转膜40 min和转膜90 min的目的条带比转膜60 min的明显偏弱。说明40 min条件下目的蛋白转膜未完全, 而90 min条件下出现透膜, 60 min是最佳的转膜时间。

图 3 不同转膜时间的Western-blot分析 Figure 3 Western-blot analysis of different transmembrane time
2.4 一抗最佳稀释度与孵育时间

为了探索一抗的最佳稀释度及孵育时间, 设置了不同一抗浓度, 同时对比了室温孵育1 h、2 h和4 ℃孵育过夜对目的条带信号的影响。从图 4可以看出:随着一抗稀释比例的升高, 目的条带的信号强度也逐渐增强, 1:5 000时条带不易观察, 不能满足分析需要; 1:500时, 抗体浓度过大, 导致目的条带过粗; 以1:1 000表现最好, 目的条带清晰、明亮。

图 4 不同抗体浓度的蛋白Western-blot分析 Figure 4 Western-blot analysis of different primary antibody concentration

图 5可以看出:随一抗孵育时间延长, 目的条带信号强度逐渐增强, 一抗1 h条带较浅, 一抗4 ℃过夜条带过粗, 并且背景较深, 室温孵育2 h获得的结果最佳。

图 5 不同抗体孵育时间的蛋白Western-blot分析 Figure 5 Western-blot analysis of different incubation time of primary antibody 1.一抗孵育1 h; 2.一抗孵育2 h; 3.一抗4 ℃过夜。 1.Incubation time of primary antibody is 1 h; 2.Incubation time of primary antibody is 2 h; 3.Incubation time of primary antibody overnight at 4 ℃.
3 讨论与结论

植物细胞中通常富含大量蛋白酶和次生代谢物[25], 严重干扰蛋白提取, 研究者们根据不同植物种类一直在不断改进蛋白质提取方法。本试验中Tris-HCl法与SDS上样缓冲液直接提取法虽都可以获得清晰的Western-blot目的蛋白条带, 但采用SDS上样缓冲液直接提取法操作简单、耗时短, 所需样品量少, 获得的蛋白质浓度高, 可完全满足后续试验的需要。其中, SDS上样缓冲液直接提取法仅需20~30 μg样品, 是Tris-HCl法的1/3, 适合于花芽等体积小、不易获取的植物材料。因此, SDS上样缓冲液直接提取法可用于果梅花芽蛋白质的样品制备。

上样量是影响电泳结果好坏的重要因素之一, 最终影响转膜结果, 因此应对所提蛋白进行定量检测。蛋白上样量至少需要20 μg[26], 一般不超过100 μg[27]。本试验结果说明, 上样量过少, 电泳后目的条带颜色较淡; 上样量过多, 电泳后目的条带模糊不清, 影响后续步骤的操作分析。上样量在20~40 μg是果梅花芽Western-blot的合适范围。

转膜电流强度、转膜时间、蛋白相对分子质量是影响转膜效率的关键条件[28-30]。有文献[31]报道, 对于(36~130)×103的较小相对分子质量蛋白质, 100~500 mA恒流2 h可以全部转移, 凝胶上没有残留。本试验结果说明, 蛋白从PAGE胶上转出的量和转膜时间密切相关, 较小相对分子质量蛋白质(27×103左右)120 mA恒流转膜1 h即可全部转移, 转膜时间过长有可能发生透膜现象。

传统方法封闭及抗体孵育一般在塑封袋内或培养皿中进行, 一抗一般室温孵育2 h[32], 或是4 ℃孵育过夜[33]。本试验将封闭及抗体孵育改为在专门的抗体孵育盒中进行, 极大地方便了试验的进行, 节约了抗体, 降低了试验成本。本试验结果表明, 室温孵育2 h和4 ℃孵育过夜都能得到清晰明亮的目的条带, 随一抗孵育时间增加, 其背景也逐渐加深, 非特异性条带增加; 室温孵育2 h背景浅, 目的条带清晰明亮, 是合适的一抗孵育时间; 以一抗稀释1:1 000表现最佳。

综上所述, 与Tris-HCl提取法相比, SDS上样缓冲液直接提取法提取蛋白快速、简单、高效, 完全满足后续SDS-PAGE和Western-blot的需要。以蛋白上样量30 μg、转膜1 h、一抗稀释比例1:1 000以及一抗孵育2 h为最佳条件。这一体系的建立与优化, 为Western-blot在梅中的相关应用研究奠定基础。

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