南京农业大学学报  2017, Vol. 40 Issue (6): 971-976   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201701009
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周道云, 肖栋, 申浩冉, 高立伟, 侯喜林
ZHOU Daoyun, XIAO Dong, SHEN Haoran, GAO Liwei, HOU Xilin
白菜类作物开花时间相关基因BraA. FLM. a的CAPS标记开发与利用
The development and utilization of CAPS marker of BraA. FLM. a related to flowering time in Brassica rapa
南京农业大学学报, 2017, 40(6): 971-976
Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(6): 971-976.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201701009

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收稿日期: 2017-01-05
白菜类作物开花时间相关基因BraA. FLM. a的CAPS标记开发与利用
周道云, 肖栋, 申浩冉, 高立伟, 侯喜林    
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区 园艺作物生物学与种质创新重点实验室, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在研究白菜类作物开花时间候选基因BraA. FLM. a的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记开发与利用。[方法]PCR扩增2个亲本的BraA. FLM. a基因外显子2到内含子2区域的特异序列,开发CAPS标记BraA. FLM. a-Nla Ⅲ,用CAPS标记对F2分离群体的基因型进行检测,并进行Pearson相关性分析研究基因型与开花时间表现型的关系。[结果]通过调查亲本早开花油用型品种‘Yellow sarson’材料YS-143和晚开花芜菁品种‘Vegetable turnip’材料VT-044的开花时间和F2群体的开花时间,发现两亲本的开花时间存在显著性差异。通过PCR扩增克隆了两亲本的BraA. FLM. a基因的特异序列,并在突变位点T-A处开发出CAPS标记BraA. FLM. a-Nla Ⅲ。在136份F2分离群体上进行此CAPS标记的验证后,发现T基因型开花时间晚于A基因型的开花时间,并且差异显著(P < 0.05)。[结论]BraA. FLM. a基因的CAPS标记BraA. FLM. a-Nla Ⅲ与开花时间表型显著相关,该标记可以用作开花时间的分子选择辅助育种。
关键词白菜类作物   开花时间   BraA. FLM. a   CAPS标记   
The development and utilization of CAPS marker of BraA. FLM. a related to flowering time in Brassica rapa
ZHOU Daoyun, XIAO Dong, SHEN Haoran, GAO Liwei, HOU Xilin    
State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in Eastern China, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The aim of this study was to explore the development and utilization of cleaved amplified polymorphic sequences (CAPS)marker for flowering time gene BraA. FLM. a in Brassica rapa. [Methods] We cloned the sequence of exon 2 to intron 2 region of the BraA. FLM. a gene from the parents. It was confirmed by sequencing that there was a mutation A-T in LE2+13 in exon 2, and subsequently a CAPS marker for BraA. FLM. a was developed. We investigated the flowering time of the double haploid segregating populations and tested their genotypes using the CAPS marker. The correlation between genotypes and flowering time were studied by Pearson correlation analysis. [Results] By investigating the flowering time of early-flowering oil-type 'Yellow sarson' material YS-143, the late-flowering 'Vegetable turnip' material VT-044 and the late flowering vegetable turnip and the flowering time of the F2 population, it was found that there was a significant difference in the flowering time between two parents. We cloned the specific sequence of the BraA. FLM. a gene of two parents and developed the CAPS marker BraA. FLM. a-Nla Ⅲ at the mutation site T-A. The validation of this CAPS marker on 136 F2 isolates revealed that the flowering time of T genotype was later than that of A genotype, and there was significant difference (P < 0.05). [Conclusions] This CAPS marker BraA. FLM. a-Nla Ⅲ for the BraA. FLM. a gene was found to be significantly associated with flowering time. Thus, the marker BraA. FLM. a-Nla Ⅲ can be subjected to marker-assisted selection of flowering time in breeding.
Key words: Brassica rapa    flowering time    BraA. FLM. a    CAPS marker   

白菜类作物(Brassica rapa)是十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)中重要的蔬菜和油用型作物。基因组三倍化导致其结构和功能上发生了变化, 也是芸薹类物种的形态型多样化以及趋同驯化的原因。白菜类作物包括普通白菜、菜心、大白菜、芜菁、菜薹、乌塌菜等多种类型。芜菁是白菜作物中一个古老的亚种, 是一种二年生草本, 有着大的下胚轴和主根, 在形态上和颜色上有很大的差异。油用型蔬菜主要栽培在中国、印度、加拿大、美国、澳大利亚和欧洲等地, 其中属于早开花的‘黄籽沙逊’油菜(‘Yellow sarson’)起源于印度。开花时间是白菜类作物生产中的重要农艺性状[1-5], 先期抽薹开花往往成为我国春季及高寒地区的秋冬白菜类作物生产中的一道难题。耐抽薹、晚开花已经成为白菜类作物育种的重要目标之一, 有研究表明四倍体白菜更耐抽薹[6]。因此, 开发与开花时间相关的分子标记对于选育耐抽薹、晚开花的白菜作物新品种具有十分重要的意义。

抽薹、开花是由内源发育信号和多种环境因素共同调控的, 其中环境温度和光周期是影响植物开花时间的主要环境因素。在拟南芥上, 关于其抽薹、开花的机制已经有了详尽的报道[7]。开花调控途径中, 开花时间受春化途径, 光周期途径和生理钟反应, 自主途径, 赤霉素途径, 环境温度途径和年龄途径的调控, 其中春化需要10 ℃以下的低温处理数周, 一般直接是越冬春化[8-9]。春化途径中主要的调控基因是FLC, 它是开花抑制基因, 也是编码MADs-box的转录调控开花的因子, 是开花相关调控基因的主要因子[10]。在白菜类作物和甘蓝(B.oleracea)上已经克隆出了FLC的4个拷贝:BraA.FLC.aBraA.FLC.bBraA.FLC.cBraA.FLC.d[11-13]。在甘蓝型油菜(B.napus)上克隆出了5个FLC同源基因分别是BnaC.FLC.aBnaC.FLC.bBnaC.FLC.cBnaC.FLC.dBnaC.FLC.e[14]。通过开花时间数量性状位点(QTL)分析, 所定位到的BraA.FLC.b基因在调控开花时间上发挥着更为重要的功能。有研究报道BraA.FLC.a内含子6上的一个G-A的变异位点与开花时间显著相关, 并且在此位点开发了CAPS标记以用于标记抽薹开花[1, 15]。最近有研究表明, 深度测序所发现的BraA.FLC.e基因是白菜类作物开花时间调控的抑制因子, 且在内含子3上发现一个G-A的变异位点与开花时间相关, 并在此位点开发了dCAPS标记可用于分子辅助选择育种[16-17]

环境温度主要是通过在12~27 ℃的温度下处理数天调控开花时间[18]。在拟南芥中, FLM也是编码MADs-box转录调控开花的因子, 并与FLC的氨基酸序列高度相似, FLM过表达也同样抑制拟南芥开花[19-20]。目前关于白菜类作物的BraA.FLM.a基因的研究还未见报道。

在对不同白菜类作物进行重测序的基础上, 本研究发现BraA.FLM.a基因外显子2上的非同义突变位点, 并根据此突变位点通过PCR扩增并酶切扩增序列开发了BraA.FLM.a的CAPS标记BraA.FLM.a-Nla Ⅲ; 选用早开花的油用型品种‘Yellow sarson’与晚开花的芜菁品种‘Vegetable turnip’为亲本, 并利用136份F2分离群体验证此CAPS标记, 再通过皮尔森相关性分析, 分析该标记与开花时间的相关性, 从而判断该标记与开花时间的关系, 旨在为白菜类作物的分子标记辅助选择育种提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

选用的供试材料为纯合的早开花母本油用型品种‘Yellow sarson’材料YS-143, 晚开花的父本芜菁品种‘Vegetable turnip’材料VT-044, 及它们的F2分离群体。这2个亲本由本课题组从由荷兰瓦赫宁根大学引进, F2由两亲本配置的F1自交后获得。亲本和F2分离群体均用于验证BraA.FLM.a的CAPS标记。

1.2 开花时间的调查

选取亲本各20株以及F2分离群体200株, 于2015年9月至2016年2月播于南京农业大学江浦露天试验农场(32°05′N, 118°62′E)。种子在培养皿中催芽露白后播于穴盘中, 20 d后将幼苗播于试验基地, 采用随机区组设计, 进行常规管理。定植1个月后取幼嫩叶片, 用于DNA的提取。

开花时间的调查采用Okazaki等[12]的方法。开花时间调查标准为从催芽到第1朵花开放所需要的时间。两亲本的开花时间均为10株材料开花时间的平均值。

1.3 全基因组DNA的提取、特异性引物的设计、PCR反应及Nla Ⅲ酶切反应

全基因组的提取方法为CTAB法。提取了亲本YS-143、VT-044和F2分离群体的全基因组DNA, 具体方法参照试剂盒使用说明书。

BraA.FLM.a的序列参照白菜Chiifu的基因组序列[3], 并结合本课题组在122份白菜类作物上的重测序信息, 开发BraA.FLM.a的CAPS标记。BraA.FLM.a的命名根据∅stergaard等[21]的方法。利用诺唯赞公司CE-Design V1.03软件设计特异性引物, 在BraA.FLM.a Exon 2-Intron 2的DNA区域, 设计检测该位点的CAPS标记的特异性的引物。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用亲本和F2分离群体的DNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为50 μL, 其中包括4 μL DNA、正反引物各2 μL、TaKaRa Ex Taq 1 μL、10×Ex Taq Buffer(Mg2+)5 μL、dNTP Mixture 4 μL、灭菌蒸馏水32 μL, 所用的各种试剂均购自TaKaRa公司。PCR的反应程序为:95 ℃ 5min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环; 72 ℃ 10 min, 4 ℃保存。

将获得的PCR产物采用Axygen公司的AxyPrep PCR纯化试剂盒进行纯化, 具体方法参照试剂盒内使用明书。然后用Nla Ⅲ进行酶切, 其中的Nla Ⅲ酶购于NEB公司。酶切体系为25 μL:限制性内切酶0.5 μL、纯化产物10 μL、10×NEB Buffer 2.5 μL、灭菌水7 μL。酶切反应程序为:37 ℃温育1 h、65 ℃热失活20 min。用20 g·L-1的琼脂糖胶检测, 读取电泳条带。将亲本的另一部分PCR纯化产物送南京金斯瑞公司测序, 每个亲本送3个进行检测。

1.4 统计分析

采用t测验统计分析亲本的开花时间。采用单因素方差分析CAPS标记与开花时间表型的相关性, 以CAPS标记基因型作为自变量。基因型与开花时间的表型采用皮尔逊(Pearson)相关系数单侧检验。统计学分析过程中所用的软件是OriginPro 2016。

2 结果与分析 2.1 白菜类作物的开花时间统计

所选用的亲本材料YS-143的平均开花时间为(46±10)d, VT-044的平均开花时间为(200±11)d。通过t测验发现这2个亲本的开花时间差异极显著(P<0.01)。

2.2 CAPS标记的开发

图 1可见:BraA.FLM.a基因在Exon2上的非同义突变位点导致组氨酸变成了亮氨酸。进一步的酶切分析表明, 位于LE2+13的突变位点正好是限制性内切酶Nla Ⅲ(CATG/)的酶切位点, 在此酶切位点上游34 bp和下游79 bp处也有2个相同的酶切位点。为了使扩增片段长些且在电泳过程中更容易识别, 因此我们跨过此酶切位点设计引物, 并且引入错配碱基“a”。上游引物位于外显子2, 下游引物位于内含子2。以双亲的DNA为模板, PCR扩增得到1条含有154 bp的片段, 此PCR产物经过限制性内切酶Nla Ⅲ酶切后, 进行琼脂糖电泳呈现出2种带型组合:一种为仅含有154 bp的带型(A基因型); 另一种为包含53、101和154 bp的复合带型(T基因型)(图 2)。产生这2种带型的原因是当LE2+13位点突变为T时, 限制性内切酶Nla Ⅲ(CATG/)将无法识别此位点。因此, 只能呈现出1条带型。而当LE2+13位点为A时, 恰好是限制性内切酶Nla Ⅲ(CATG/)的酶切位点。Nla Ⅲ酶识别此位点并将其切开, 在没有实现完全酶切的情形下, 最终呈现出3条带型。据此, 可以判别BraA.FLM.a基因在LE2+13位点的A-T的突变, 并将该CAPS标记命名为BraA.FLM.a-NlaⅢ。

图 1 BraA.FLM.a-Nla Ⅲ CAPS标记的位置 Figure 1 The location of BraA.FLM.a-Nla Ⅲ CAPS YS:‘Yellow sarson’; VT:‘Vegetable turnip’.
E表示外显子, 粗黑线表示内含子, 加了方框的碱基表示用来开发CAPS标记。E is short for exon, black line indicates intron, the base in the black frame is a SNP locus for developing BraA.FLM.a-Nla Ⅲ CAPS marker.
图 2 亲本和F2分离群体的BraA.FLM.a基因Nla Ⅲ酶切后电泳图 Figure 2 Electrophoresis of BraA.FLM.a by Nla Ⅲ enzyme in parents and F2 populations M.Marker; P1和P2分别代表YS-143和VT-044, 1~136表示它们的F2分离群体。箭头表示T基因型, 其余的表示A基因型。 M. Marker; P1and P2are YS-143 and VT-044, respectively. 1-136 are the population of F2. The arrow is the T genotype and others are A genotype.

利用此CAPS标记BraA.FLM.a-Nla Ⅲ酶切两亲本材料, 经测序, 其结果与酶切电泳结果一致(图 2)。YS-143的BraA.FLM.a基因此位点为T, 电泳结果呈现1条带。VT-044此位点为A, 电泳结果呈现3条带。所以, 可以用此标记来判断BraA.FLM.a基因A-T的变异。

2.3 开花时间与CAPS标记的相关性分析

为验证该CAPS标记的可靠性, 对136份F2分离群体植株进行开花时间的分析, 并利用CAPS标记BraA.FLM.a-Nla Ⅲ对酶切位点进行相关性分析。检测结果表明, 在136份F2分离群体中, 标记检测为T基因型且与亲本P1具有相同的带型的有23份; 为A基因型且与亲本P2的带型相同的带型的有113份(图 2)。F2分离群体中T基因型的23份材料的开花时间为32~60 d, 平均开花时间为(44.7±6.7)d; A基因型的113份材料的开花时间为36~90 d, 平均开花时间为(48.0±7.2)d。且属于A基因标记的F2群体植株的开花时间晚于T基因标记的开花时间, 两者之间呈显著性差异(P<0.05)(图 3)。标记基因型和开花时间表型的Pearson相关性分析表明, 材料开花时间的早晚与基因型呈显著相关(r=0.933, P<0.01)。

图 3 不同基因型的开花时间箱型图 Figure 3 Box plot of the time of flowering for two genotypes ○表示最大值, △表示数据99%的位置, □表示平均值, ☆表示最小值。*P<0.05。 ○ presents the maximum, △ presents 99% of the data, □ presents mean of data, ☆ presents the minimum. *P < 0.05.
3 讨论与结论

分子标记辅助选择已成为芸薹属作物分子育种的关键技术。随着白菜基因组图谱不断地完善, 很多的分子标记被开发出来。应用广泛的分子标记应该建立在PCR扩增技术基础之上, 且具有高度重复性以在广泛基因背景下都能表达, 还能有效地跟踪目标基因的标记。CAPS标记就是通过结合PCR技术和限制性内切酶技术, 能够有效地区分单个碱基的突变。CAPS标记具有共显性、精确度高、DNA用量少、操作简单且有更多揭示多态性的机会等优点。CAPS标记技术已经在白菜类作物、水稻、大豆、番茄、小麦等植物中应用[1, 22-24]

本研究发现了BraA.FLM.a基因外显子2上的一个非同义突变位点。基于此位点A-T的变异, 开发了CAPS标记BraA.FLM.a-Nla Ⅲ。并且在早熟油用型材料与晚熟型芜菁材料的杂交后代的F2分离群体上, 进行验证CAPS标记BraA.FLM.a-Nla Ⅲ与开花时间的相关性检测。对136份F2分离群体CAPS标记与开花时间的Pearson相关性分析结果表明, 此标记与开花时间显著相关。目前, 已有关于抽薹开花的CAPS标记的报道, 主要是BraA.FLC.a基因CAPS标记G-MvA, 并在96份白菜类作物上进行了验证[1]BraA.FLC.e基因dCAPS标记在93份白菜类作物已验证[16]。在本研究中, 利用了2个开花时间差异较大的亲本, 且在F2分离群体进行验证。另外, 也有关于甘蓝耐寒基因CBF1CBF2的CAPS标记在耐寒性差异较大F2分离群体上验证的报道[25]。所以, 本研究在F2分离群体上验证CAPS标记是可行的。BraA.FLM.a-Nla Ⅲ标记和开花时间虽然有显著性相关, 但是F2的开花时间表型并不是所有的T基因型都早于A基因型。其主要原因可能是因为开花时间是一个数量性状, 受多个开花时间相关基因和多条路径相互协调、共同调控[26]

在现代育种中, 改良某个特定的优良性状, 最有效的途径就是选择携带某一性状的目的基因的供体亲本进行回交, 同时利用各种分子标记辅助选择, 迅速地将与分子标记连锁的基因转移到另外一个品种上, 将显著加速育种年限。目前, 关于白菜类作物CAPS标记的应用, 已经有开花时间调控基因BraA.FLC.aBraA.FLC.b和甘蓝耐寒基因(CBF1CBF2)被开发出来并用于分子育种[11, 25]。本研究关于该标记的开发与利用, 将对白菜类作物开花分子选择标记辅助育种有重要理论与现实意义。

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