南京农业大学学报  2017, Vol. 40 Issue (5): 874-880   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201604027
0

文章信息

赵富林, 徐明飞, 谢青云, 单衍可, 雷静, 施志玉, 孙海凤, 刘斐
ZHAO Fulin, XU Mingfei, XIE Qingyun, SHAN Yanke, LEI Jing, SHI Zhiyu, SUN Haifeng, LIU Fei
大肠杆菌表达的RNA解螺旋酶Ded1p的提纯与解螺旋机制
Purification and mechanism of RNA helicase Ded1p expressed in Escherichia coli
南京农业大学学报, 2017, 40(5): 874-880
Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(5): 874-880.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201604027

文章历史

收稿日期: 2016-04-10
大肠杆菌表达的RNA解螺旋酶Ded1p的提纯与解螺旋机制
赵富林, 徐明飞, 谢青云, 单衍可, 雷静, 施志玉, 孙海凤, 刘斐    
南京农业大学动物医学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]表达、提纯DExH/D-box家族蛋白Ded1p,并综合传统电泳以及单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术,探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[方法]原核表达、纯化出全长的Ded1p作为研究蛋白,并验证其解螺旋酶活性。以荧光对标记的带有3'末端单链RNA尾巴的13 bp双链RNA作为研究底物,基于全内反射的单分子荧光共振能量转移技术,在自制的样品通道内添加800 nmol·L-1 Ded1p、2 mmol·L-1 ATP/Mg2+以及研究底物进行解螺旋试验,再用自编的Matlab程序采集和分析数据,进而从单分子层面探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[结果]首次通过Ni-NTA凝胶亲和层析与Capto-DEAE凝胶阴离子交换层析两步纯化手段,得到了大量纯净的、并且具有双链RNA解螺旋酶活性的Ded1p。Ded1p的smFRET试验在单分子层面实现了对Ded1p打开13 bp双链RNA过程的实时观察。通过分析FRET的变化过程,首次提出Ded1p主要以一步解螺旋的方式打开双链RNA结构。[结论]原核表达、纯化的Ded1p具有RNA解螺旋酶活性;该Ded1p是以局部双链打开的模式解开RNA双链。
关键词单分子荧光共振能量转移   DExH/D-box家族   Ded1p蛋白   荧光标记RNA   局部双链打开   
Purification and mechanism of RNA helicase Ded1p expressed in Escherichia coli
ZHAO Fulin, XU Mingfei, XIE Qingyun, SHAN Yanke, LEI Jing, SHI Zhiyu, SUN Haifeng, LIU Fei    
College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] This study was to express and purify DExH/D-box protein Ded1p, and further investigate the RNA duplex unwinding mechanism of Ded1p based on both traditional electrophoresis method and the single-molecule fluorescence resonance energy transfer(smFRET)technique. [Methods] The full length Ded1p was expressed in prokaryotic cells, and purified as target protein. Its helicase activity was verified. The 13 bp RNA duplex with a 3' overhang was fluorescently labeled as the substrate. Based on the total internal reflection microscope, the smFRET experiments were started by adding 800 nmol·L-1 Ded1p, 2 mmol·L-1 ATP/Mg2+ and fluorescently labeled substrate into the homemade sample chamber. And then, This study explored the double-stranded RNA unwinding mechanism of Ded1p at the single molecule level according to the data which were taken and analyzed by customized Matlab routines. [Results] We got a large amount of pure Ded1p protein with helicase activity after two-step purification:the affinity chromatography with Ni-NTA agarose and anion exchange chromatography with Capto-DEAE agarose. Based on the smFRET experiments, we realized the real-time observation of the unwinding process that Ded1p unwound the 13 bp dsRNA at the single-molecule level. Further analysis of the FRET change revealed that Ded1p directly unwound dsRNA, and took one-step as the main unwinding way. [Conclusions] The Ded1p expressed and purified from Escherichia coli had RNA helicase activity. The smFRET results were in agreement with the reported biochemical experiment conclusion, which proposed that Ded1p unwound RNA duplexes in a local strand separation mode.
Key words: single-molecule fluorescence resonance energy transfer    DExH/D-box family    Ded1p protein    fluorescently labeled RNA    local strand separation   

DExH/D-box蛋白是RNA解螺旋酶中最大的家族, 属于超家族2(SF2) 解螺旋酶[1]。DExH/D-box蛋白参与几乎所有的RNA代谢过程, 包括转录、mRNA前体剪接、mRNA输出、核糖体生物合成、翻译起始、细胞器基因的表达, 以及RNA降解等[2-4]。此外, 最新研究表明, DExH/D-box家族蛋白还参与调控病毒的复制, 以及宿主的抗病毒反应[5], 如HIV病毒mRNA的出核需要DDX3蛋白协作[4], NS3蛋白可以促进丙型肝炎病毒的增殖[5]。DExH/D-box蛋白的这些生物学功能的发挥, 主要通过其对短双链RNA的局部扰动(解螺旋酶活性), 或对RNA上蛋白质的移除(RNP酶活性)来实现[6-7]。所以, 阐明DExH/D-box家族蛋白的双链RNA解螺旋机制, 对调控宿主基因表达和抵抗病毒入侵都具有重要意义。

体外研究表明, DExH/D-box蛋白以ATP依赖的方式催化RNA双链解螺旋[8-9]。DExH/D-box蛋白家族中的DEAD-box家族蛋白与传统的依靠在核酸链上移位来解开双链的解螺旋酶不同[10], 它是通过局部双链解开的方式进行解螺旋[11-12], 且只能解开较短的RNA-RNA或DNA-RNA双链[13]。此外, DExH/D-box蛋白解螺旋过程不需要消耗ATP[14-15], ATP水解是为了促进DEAD-box蛋白与RNA结合和蛋白的再循环[14]。对于大多数DEAD-box蛋白来说, 邻近的单链RNA会促进蛋白结合到双链区域[16], 而且对单链方向没有依赖性[17-19]。这种解螺旋机制被称为局部双链解开模式, 并且这种模式被认为是唯一适合DEAD-box蛋白在细胞内催化RNA和RNA-蛋白质复合物重组的方式[20-22]。Ded1p来自于酿酒酵母[23], 属于DExH/D-box蛋白家族中的DEAD-box家族蛋白, 它因作为染色体内编码HIS 3基因的一个重要结构域而首次获得分离, 故被命名为Ded1(defines essential domain1)[24]。Ded1p是DExH/D-box RNA解螺旋酶家族的典型代表[12]。研究表明, Ded1p主要以低聚体的形式发挥解螺旋活性[25], 但是Ded1p的解螺旋机制目前仍不明确。

单分子荧光共振能量转移(single molecule fluorescence resonant energy transfer, smFRET)技术通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移效率, 来研究分子的构象变化[26]。相对于传统探测分子综合平均效应技术来说, smFRET可以对体系中的单个分子进行研究, 得到某一分子特性的分步状况, 也可以研究生物分子的动力学反应[27-28]。Syed等[10]利用smFRET技术揭示了T7解螺旋酶的分步解螺旋机制。Karunatilaka等[29]利用smFRET技术揭示了Mss116解螺旋酶介导的二型内含子折叠机制。smFRET技术近年来在探究生物学机制方面发展迅猛, 包括DNA的复制和重组, RNA的转录、折叠和催化, 蛋白的翻译、折叠和构象变化等[30-32]

本研究以原核表达的全长Ded1p为研究对象, 以荧光标记的核酸为底物, 利用smFRET技术, 在单分子层面直观探究Ded1p对双链RNA的解螺旋机制。

1 材料与方法 1.1 试验材料

Ni-NTA琼脂糖从Invitrogen(美国)购买, Capto-DEAE琼脂糖从GE(美国)购买, DNA序列从Genewiz(苏州, 中国)购买, RNA序列是用TranscriptAid T7 High Yield Transcription试剂盒(Thermo Scientific)用模板DNA转录而来, 并用非变性PAGE纯化。荧光标记的DNA和RNA从TaKaRa(大连, 中国)购买, ATP、BSA、Trolox、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶等都是从Sigma购买, D-葡萄糖从Amresco购买。主要RNA和DNA序列如下:

A. 41 nt RNA:5′-AAA ACA GAA CAU AAC CAA ACA AAA UAG CAC CGU AAA GAC GC-3′;

B. 16 nt RNA-6-FAM:5′-GCG UCU UUA CGG UGC U-6-FAM-3′;

C. 13 nt RNA-6-FAM:5′-GCG UCU UUA CGG U-6-FAM-3′;

D. 13 bp 3′tail RNA:5′-ACC GUA AAG ACG CAG CCA GCA UCA AUG ACA UCA GCA UC-3′;

E. Cy5-RNA-DNA-biotin:5′-Cy5-GCG UCU UUA CGG UGC UdAdGdTdTdCdAdCdG dAdAdA-biotin-3′;

F. Cy3-DNA:5′-TTT CGT(Cy3) GAA CT-3′。

1.2 Ded1p原核表达与纯化

Ded1p-pET22b重组质粒源自美国Eckhard Jankowasky实验室的馈赠。将Ded1p-pET22b重组质粒转化至BL21(DE3) 大肠杆菌内, 通过菌液PCR与质粒测序, 确定质粒转化成功。然后于37 ℃培养细菌至D600达到0.6~0.8, 加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG, 于28 ℃诱导培养16 h后, 利用SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色验证目的蛋白表达情况。基于验证结果, 以同样的诱导温度和时间, 用0.5 mmol·L-1 IPTG在大量的BL21(DE3) 中诱导表达Ded1p[33]。表达完成后, 对Ded1p进行两步纯化。鉴于Ded1p上挂有6×His标签, 首先使用Ni-NTA凝胶介质进行亲和层析, 再采用Capto-DEAE凝胶阴离子交换剂进行离子交换层析, 最终得到纯净的Ded1p。

1.3 Ded1p解螺旋活性验证

建立解螺旋酶体外解螺旋反应体系, 再利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)验证体外表达纯化的Ded1p是否具有双链RNA解螺旋活性。本研究中涉及的所有解螺旋反应均在标准解螺旋缓冲液(helicase reaction buffer, HRB)中进行。HRB包括:40 mmol·L-1 Tris-HCl(pH8.0)、50 mmol·L-1 NaCl、0.5 mmol·L-1 MgCl2、2 mmol·L-1 DTT、1 U·μL-1RNasin、1 g·L-1 Nonidet P-40[12]。反应温度19 ℃。为了达到反应预平衡状态, 800 nmol·L-1 Ded1p先与2 nmol·L-1带有6-FAM标记的双链RNA在HRB中孵育5 min, 然后加入等浓度的MgCl2和ATP(终浓度为2 mmol·L-1)起始解螺旋反应。于19 ℃的金属浴中反应1 h后加入终止缓冲液终止反应。终止缓冲液包括:50 mmol·L-1 EDTA、10 g·L-1SDS、1 g·L-1二甲苯蓝、1 g·L-1溴酚蓝和20%甘油[12]。取反应液, 以10 V·cm-1的速度, 在1×TBE缓冲液中进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后, 利用激光扫描成像系统Typhoon(GE, 美国)对凝胶进行扫描成像。基于核酸底物上的6-FAM荧光标签, 可以观察到单链RNA和双链RNA的分布情况, 从而分析体外表达纯化的Ded1p是否具有解螺旋酶活性。

1.4 smFRET试验

于笔者所在实验室自行搭建的、基于全内反射荧光显微镜的光学平台上进行smFRET试验。该平台主要包括:奥林巴斯IX81显微镜、PHOTOMETRICS Evolve 512电子倍增电荷耦合器(EMCCD)和50 mW的COHERENT 532 nm固态激光器。首先制备Ded1p smFRET试验的核酸底物:将D、E、F 3条核酸链按5:3:2的比例进行退火, 形成一条3′末端带有25 nt单链RNA尾巴的13 bp双链RNA底物, 再使用PEG/biotin-PEG混合液包被自制样品流动通道, 经PEG/biotin-PEG包被处理后的样品通道既可以防止蛋白的非特异性吸附, 也可以特异性的固定双链RNA[26, 34]。然后将稀释在HRB缓冲液中的RNA样品(终浓度50 pmol·L-1, Cy3-Cy5荧光对标记和生物素标记的双链RNA)加入到预处理后的样品通道中, 基于核酸分子上的生物素与通道中链霉亲和素的亲和作用, 带有荧光对标记的双链RNA固定至通道中。值得注意的是, HRB中还需添加除氧试剂和三重态淬灭剂(包括:8 g·L-1D-葡萄糖、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和Trolox)以除去通道内的氧气, 延长荧光分子的寿命。最后加入等浓度的MgCl2和ATP(终浓度2 mmol·L-1)起始解螺旋反应。试验开始时开启532 nm的激光激发样品通道中的核酸样品, 通过奥林巴斯的油浸物镜(100×、1.49 N.A.)采集荧光信号。供体荧光分子(Cy3) 和受体荧光分子(Cy5) 的荧光被PHOTOMETRICS的DV2分开, 分别被投射到EMCCD的左右两边。通过Micro-Manager控制, 以100 ms每帧的速度, 采集100 s的时间轨迹。Ded1p的解螺旋反应在被ATP起始前, 由于构建的核酸底物上的Cy3和Cy5相对距离较远, 受激光激发后产生的荧光共振能量转移效率很低, 表现为低共振能量转移(FRET)值。当加入ATP后, 由于Ded1p以ATP依赖的方式打开了双链RNA, 解螺旋后的单链RNA较双链RNA更容易发生折叠和扭曲, 进而拉近了Cy3和Cy5的距离, 表现为高FRET值。本试验通过观测和分析ATP加入前后Cy3和Cy5荧光强度与FRET的变化, 来探讨Ded1p的解螺旋机制。

1.5 数据处理

首先采用Image J软件对所采集的数据进行去噪声处理, 然后采用IDL软件进行trace的提取, 接着采用Matlab软件进行smFRET直方图分布的提取和单个分子时间曲线的提取, 再采用vb-FRET进行步骤拟合, 最后用Excel 2013和Matlab进行数据的统计与拟合。

2 结果与分析 2.1 Ded1p原核表达与纯化 2.1.1 Ded1p的诱导表达及验证

以5 mL阳性BL21(DE3) 转化菌为基础, 37 ℃摇床培养至D600达0.6~0.8, 加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG, 于28 ℃摇床中诱导表达16 h后, 超声裂解菌体, 收集上清液, 通过SDS-PAGE验证诱导结果。如图 1所示, 诱导的菌体裂解上清液在相对分子质量70×103的位置有明显的条带, 该大小与带有6×His标签的Ded1p大小(约70.5×103)一致, 而未诱导的菌体裂解上清液在该位置则没有明显的条带, 说明Ded1p能够用0.5 mmol·L-1 IPTG诱导表达。

图 1 Ded1p诱导表达的验证 Figure 1 Expression of Ded1p M.蛋白标准品; 1. 0.5 mmol·L-1 IPTG诱导16 h; 2.无IPTG。 M. Protein marker; 1. 0.5 mmol·L-1 IPTG induced for 16 h; 2. No IPTG.
2.1.2 Ded1p的大量表达及纯化

以4 L阳性BL21(DE3) 转化菌为基础, 分装在4个1 L的锥形瓶中, 于37 ℃摇床培养至D600达0.6~0.8, 加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG, 于28 ℃摇床中诱导表达16 h后, 超声裂解菌体, 收集上清液。将上清液与平衡好的Ni-NTA凝胶在4 ℃过夜孵育后用不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白, 最后通过SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果。结果如图 2所示:Ni-NTA凝胶层析不足以得到1个单一的目的条带, 说明Ded1p仍含有部分杂蛋白。由于该Ded1p达不到单分子试验需要的蛋白纯度, 所以还需要进行进一步纯化。

图 2 Ni-NTA凝胶纯化Ded1p Figure 2 Ded1p purified by Ni-NTA agarose M.蛋白标准品; 1~20. 250 mmol·L-1咪唑洗脱液。 M. Protein maker; 1-20. Eluted by washing buffer with 250 mmol·L-1 imidazole.

将8~14泳道代表的蛋白液合并到一起, 用结合缓冲液稀释6倍, 使NaCl浓度降低至50 mmol·L-1, 然后与平衡好的Capto-DEAE凝胶介质在4 ℃进行孵育结合, 最后进行盐离子梯度洗脱。结果如图 3可见, 在300 mmol·L-1 NaCl条件下, 能够得到条带单一的Ded1p, 该Ded1p几乎没有杂蛋白, 可用于单分子试验。

图 3 Capto-DEAE agarose纯化Ded1p Figure 3 Ded1p purified by Capto-DEAE agarose M.蛋白标准品; 1.结合后流出液; 2~8、9~15、16~22、23~33分别为100、150、200和300 mmol·L-1 NaCl洗脱液。 M. Protein maker; 1. Flow-through after binding; 2-8, 9-15, 16-22, 23-33 were eluted by 100, 150, 200 and 300 mmol·L-1 NaCl washing buffer, respectively.
2.2 纯化的Ded1p具有双链RNA解螺旋活性

我们设计了2组底物进行Ded1p解螺旋酶活性验证, 一组为带有5′尾巴的16 bp dsRNA(1~5号反应), 一组为带有5′尾巴的13 bp dsRNA(6~10号反应)(图 4)。通过native-PAGE分析Ded1p是否具有双链RNA的解螺旋活性。PAGE是由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联形成的三维网状的结构物质, 具有分子筛效应。由于RNA所带电荷一致, native-PAGE对核酸的分离主要依赖于RNA分子的大小, 而双链RNA分子较单链RNA分子大, 所以在PAGE中移动较慢, 条带位于PAGE胶的上方; 如果双链RNA被Ded1p解开, 则2条单链RNA移动较快, 位于双链RNA的下方。为了更加明确Ded1p是否具有解螺旋活性, 我们对具有ATP和Ded1p的反应做了一次重复, 即1号和2号, 6号和7号。结果如图 4所示, 对于16 bp的双链RNA(图 4-A), 与对照组相比(4泳道), 有ATP存在时, Ded1p在1 h内几乎能够解开16 bp双链RNA(1、2泳道)。没有ATP时, Ded1p不能打开双链RNA, 并且表现出促进退火的能力, 能够将没有完全退火的单链RNA退火为双链(3泳道)。对于13 bp的双链RNA(图 4-B), 与对照组相比(9泳道), 有ATP存在时, Ded1p也能够实现双链RNA的解链(6、7泳道)。没有ATP时, Ded1p也具有退火活性, 能够将没有完全退火的单链RNA退火为双链(8泳道)。

图 4 Ded1p解螺旋活性验证的电泳图(120 g·L-1PAGE) Figure 4 Unwinding activity of Ded1p(120 g·L-1PAGE) 1~5.以16 bp dsRNA为底物; 6~10.以13 bp dsRNA为底物。RNA以黑色线条表示, 6-FAM荧光分子以红色五角星表示。 1-5. Use 16 bp dsRNA as substrate; 6-10. Use 13 bp dsRNA as substrate. RNA was shown with black line, 6-FAM fluorescence was shown with red pentagram.
2.3 Ded1p一步解开双链RNA

我们设计了一条3′末端带有25 nt单链RNA尾巴的13 bp双链RNA底物, 用于Ded1p解螺旋机制的smFRET探究(图 5-A)。没有加入Ded1p和ATP时, FRET值分布在0.37附近(0.37前的小峰为荧光淬灭形成的小峰)(图 5-B), 说明此时的荧光共振能量转移效率(E)低。当加入800 nmol·L-1 Ded1p和2 mmol·L-1 ATP/Mg2+起始解螺旋反应后, FRET值分别分布在0.37和0.85附近(图 5-C)。0.37代表的是解螺旋反应起始前底物的状态, 即双链RNA表现的FRET值。0.85较0.37有显著的提高, 说明发生了高效率的能量跃迁, 认为是双链RNA的解螺旋导致, 故将高FRET值定义为底物完全解离态。

图 5 smFRET试验揭示Ded1p一步解开双链RNA Figure 5 smFRET experiment revealed that Ded1p unwinds dsRNA by one step A:试验设计, Ded1p起始解螺旋反应前后, 双链RNA底物构象发生变化; B:双链RNA底物的FRET分布直方图; C:起始解螺旋反应后的FRET分布直方图; D:起始反应后, 底物被532 nm激光激发时, Cy3和Cy5荧光强度的时间轨迹和FRET时间轨迹的变化。 A:Design, conformation of dsRNA substrate changes before and after Ded1p unwinds the duplex; B:The FRET histogram of dsRNA substrate; C:The FRET histogram of substrate after Ded1p initiates the unwinding reaction; D:With substrate excited by 532 nm laser, representative Cy3 and Cy5 fluorescence intensity time-trace(top panel)and FRET efficiency trajectory(bottom panel)after the reaction starts.

进一步采集提取加入Ded1p和ATP后单个RNA分子上Cy3和Cy5荧光对的荧光强度时间轨迹与FRET时间轨迹, 结果(图 5-D)表明:Cy3的荧光强度在解螺旋反应起始后迅速降低, 而Cy5的荧光强度表现为相应的升高, 说明供体荧光分子与受体荧光分子之间产生了能量转移。对应的FRET时间轨迹也表现出同样的变化趋势, FRET由0.37跃迁至0.85。综上所述, 本试验结果表明:Ded1p以一步解螺旋的方式打开13 bp的dsRNA, 该结果在单分子层面上进一步佐证了之前的报道, 即根据生化实验结果提出的局部双链解螺旋模式[2]

3 讨论

本试验首次利用Capto-DEAE凝胶这种弱阴离子交换剂对Ded1p进行二次纯化, 得到纯度更高的Ded1p。而文献[12]报道过采用p-cellulose这种阳离子交换剂对Ded1p进行二次纯化。p-cellulose是带有磷酸基团的中等酸型阳离子交换剂, 本质是纤维素, 其活性基团位于表面, 能够分离蛋白等生物大分子。当pH值大于7时, 磷酸基团电离形成带负电的阴离子, 能够结合Ded1p上带正电的基团, 通过提高流动相中阳离子浓度, 吸附的蛋白就会被洗脱下来, 达到分离的效果, 然而p-cellulose已经停产, 这对Ded1p的提纯提出了新的挑战。我们曾尝试过多种提纯方法, 包括Q交换柱、分子筛等, 均未取得良好效果。而Capto-DEAE是带有二乙氨基乙基的弱碱型弱阴离子交换剂, 本质是琼脂糖, 能够分离大分子物质, 不会引起被分离蛋白的变性或失活, 而且其非特异性吸附很低, 交换容量比纤维素高3~4倍。当pH值稍微大于蛋白的等电点时, 蛋白带负电荷, 带正电荷的二乙氨基乙基能够将其吸附, 当提高流动相中的负离子, 被DEAE吸附的蛋白就会被洗脱下来, 达到分离纯化的效果。综合比较, 后者对Ded1p的活性保持以及分离效率都要高, 所以我们选择了Capto-DEAE进行二次纯化。

大量的晶体结构和生化试验研究表明, DExH/D-box家族的DEAD-box RNA解螺旋酶解开RNA双链的方式与传统通过移位的方式解螺旋的蛋白不同[1, 12, 14-15, 25, 35], 它是通过局部双链打开的模式进行解螺旋反应[2], 并且非共价相连但空间距离极近的一段单链DNA或RNA能够促进DEAD-box蛋白结合到双链区域, 进而发挥解螺旋酶活性[12]。DEAD-box蛋白打开双链RNA不需要水解ATP供能[14]。DEAD-box蛋白是以低聚体的形式合作发挥解螺旋作用[25]。虽然以前的研究已经揭示了很多DEAD-box蛋白的解螺旋特点, 但其解螺旋机制目前还存在很多疑点。本试验对Ded1p这个典型的DEAD-box蛋白展开研究, 从单分子水平上揭示了Ded1p对双链RNA的解螺旋机制。

研究结果表明, 一旦Ded1p结合到RNA双链区域, Ded1p的构象就会发生改变, 只紧密地结合一条RNA单链, 从而与RNA双链不相容[15], 此外该构象改变的过程需要ATP结合才能实现[36-37]。这个过程就会导致局部双链被打开[15], 这与本试验所看到的高FRET的存在相一致。对晶体结构的研究发现, 起始解螺旋反应后, DExH/D-box家族的DEAD-box蛋白只能直接打开5~6个碱基对[38-40], 其余的碱基对会很快自发的解开, 不需要蛋白和ATP水解的参与[15]。由此, 我们认为本试验所显示的高FRET分布代表dsRNA完全解开时的状态。时间轨迹曲线同样显示dsRNA被一步解开。以上结果与局部双链打开模式一致。

本研究通过原核表达并纯化出有活性的Ded1p, 利用基于全内反射的mFRET试验, 直接证明DExH/D-box家族的DEAD-box蛋白Ded1p是以局部双链打开的模式发挥其解螺旋酶活性。

参考文献(References)
[1] Linder P, Jankowsky E. From unwinding to clamping:the DEAD box RNA helicase family[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2011, 12(8): 505–516. DOI: 10.1038/nrm3154
[2] Yang Q, Campo M D, Lambowitz A M, et al. DEAD-box proteins unwind duplexes by local strand separation[J]. Molecular Cell, 2007, 28(2): 253–263. DOI: 10.1016/j.molcel.2007.08.016
[3] Tarn W Y, Chang T H. The current understanding of Ded1p/DDX3 homologs from yeast to human[J]. RNA Biol, 2009, 6: 17–20. DOI: 10.4161/rna.6.1.7440
[4] Sharma D, Jankowsky E. The Ded1/DDX3 subfamily of DEAD-box RNA helicases[J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2014, 49(4): 343–360. DOI: 10.3109/10409238.2014.931339
[5] Kwong A D, Rao B G, Jeang K T. Viral and cellular RNA helicases as antiviral targets[J]. Nat Rev Drug Discov, 2005, 4(10): 845–853. DOI: 10.1038/nrd1853
[6] Rossler O G, Straka A, Stahl H. Rearrangement of structured RNA via branch migration structures catalysed by the highly related DEAD-box proteins p68 and p72[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(10): 2088–2096. DOI: 10.1093/nar/29.10.2088
[7] Tsu C A, Kossen K, Uhlenbeck O C. The Escherichia coli DEAD protein DbpA recognizes a small RNA hairpin in 23S rRNA[J]. RNA, 2001, 7(5): 702–709. DOI: 10.1017/S1355838201010135
[8] Jankowsky E, Fairman M E. RNA helicases-one fold for many functions[J]. Current Opinion in Structural Biology, 2007, 17(3): 316–324. DOI: 10.1016/j.sbi.2007.05.007
[9] Theissen B, Karow A R, Gubaev A, et al. Cooperative binding of ATP and RNA induces a closed conformation in a DEAD box RNA helicase[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(2): 548–553. DOI: 10.1073/pnas.0705488105
[10] Syed S, Pandey M, Patel S S, et al. Single-molecule fluorescence reveals the unwinding stepping mechanism of replicative helicase[J]. Cell Rep, 2014, 6(6): 1037–1045. DOI: 10.1016/j.celrep.2014.02.022
[11] del Campo M, Mohr S, Jiang Y, et al. Unwinding by local strand separation is critical for the function of DEAD-box proteins as RNA chaperones[J]. J Mol Biol, 2009, 389(4): 674–693. DOI: 10.1016/j.jmb.2009.04.043
[12] Yang Q S, Jankowsky E. The DEAD-box protein Ded1 unwinds RNA duplexes by a mode distinct from translocating helicases[J]. Nature Structural and Molecular Biology, 2006, 13(11): 981–986. DOI: 10.1038/nsmb1165
[13] Mallam A L, Campo M D, Gilman B, et al. Structural basis for RNA-duplex recognition and unwinding by the DEAD-box helicase Mss116p[J]. Nature, 2012, 490(7418): 121–125. DOI: 10.1038/nature11402
[14] Liu F, Putnam A, Jankowsky E. ATP hydrolysis is required for DEAD-box protein recycling but not for duplex unwinding[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(51): 20209–20214. DOI: 10.1073/pnas.0811115106
[15] Chen Y F, Potratz J P, Tijerina P, et al. DEAD-box proteins can completely separate an RNA duplex using a single ATP[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(51): 20203–20208. DOI: 10.1073/pnas.0811075106
[16] Jankowsky E, Fairman M E, Yang Q S. RNA helicases:versatile ATP-driven nanomotors[J]. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2005, 5(12): 1983–1989. DOI: 10.1166/jnn.2005.508
[17] Rozen F, Edery I, Meerovitch K, et al. Bidirectional RNA helicase activity of eukaryotic translation initiation factor-4a and factor-4f[J]. Molecular and Cellular Biology, 1990, 10(3): 1134–1144. DOI: 10.1128/MCB.10.3.1134
[18] Huang Y, Liu Z R. The ATPase, RNA unwinding, and RNA binding activities of recombinant p68 RNA helicase[J]. J Biol Chem, 2002, 277(15): 12810–12815. DOI: 10.1074/jbc.M200182200
[19] Bizebard T, Ferlenghi I. Studies on three E.coli DEAD-box helicases point to an unwinding mechanism different from that of model DNA helicases[J]. Biochemistry, 2004, 43(24): 7857–7866. DOI: 10.1021/bi049852s
[20] Yang Q, Fairman M E, Jankowsky E. DEAD-box-protein-assisted RNA structure conversion towards and against thermodynamic equilibrium values[J]. J Mol Biol, 2007, 368(4): 1087–1100. DOI: 10.1016/j.jmb.2007.02.071
[21] Schutz P, Bumann M, Oberholzer A E, et al. Crystal structure of the yeast eIF4A-eIF4G complex:an RNA-helicase controlled by protein-protein interactions[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(28): 9564–9569. DOI: 10.1073/pnas.0800418105
[22] Putnam A A, Jankowsky E. DEAD-box helicases as integrators of RNA, nucleotide and protein binding[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1829(8): 884–893. DOI: 10.1016/j.bbagrm.2013.02.002
[23] Beckham C, Hilliker A, Cziko A M, et al. The DEAD-box RNA helicase Ded1p affects and accumulates in Saccharomyces cerevisiae P-bodies[J]. Mol Biol Cell, 2008, 19(3): 984–993.
[24] Struhl K. Nucleotide sequence and transcriptional mapping of the yeast Pet56-His3-Ded1 gene region[J]. Nucleic Acids Research, 1985, 13(23): 8587–8601. DOI: 10.1093/nar/13.23.8587
[25] Putnam A A, Gao Z F, Liu F, et al. Division of labor in an oligomer of the DEAD-Box RNA helicase Ded1p[J]. Mol Cell, 2015, 59(4): 541–552. DOI: 10.1016/j.molcel.2015.06.030
[26] Roy R, Hohng S, Ha T. A practical guide to single-molecule FRET[J]. Nat Methods, 2008, 5(6): 507–516. DOI: 10.1038/nmeth.1208
[27] Joo C, Ha T. Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2012. DOI: 10.1101/pbd.top072058
[28] Ha T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer[J]. Methods, 2001, 25(1): 78–86. DOI: 10.1006/meth.2001.1217
[29] Karunatilaka K S, Solem A, Pyle A M, et al. Single-molecule analysis of Mss116-mediated group Ⅱ intron folding[J]. Nature, 2010, 467(7318): 935–939. DOI: 10.1038/nature09422
[30] Ha T, Kozlov A G, Lohman T M. Single-molecule views of protein movement on single-stranded DNA[J]. Annu Rev Biophys, 2012, 41: 295–319. DOI: 10.1146/annurev-biophys-042910-155351
[31] Bhattacharyya B, George N P, Thurmes T M, et al. Structural mechanisms of PriA-mediated DNA replication restart[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(4): 1373–1378. DOI: 10.1073/pnas.1318001111
[32] Balci H, Arslan S, Myong S, et al. Single-molecule nanopositioning:structural transitions of a helicase-DNA complex during ATP hydrolysis[J]. Biophys J, 2011, 101(4): 976–984. DOI: 10.1016/j.bpj.2011.07.010
[33] Yang Q S, Jankowsky E. ATP-and ADP-dependent modulation of RNA unwinding and strand annealing activities by the DEAD-box protein DED1[J]. Biochemistry, 2005, 44(41): 13591–13601. DOI: 10.1021/bi0508946
[34] Liu F, Putnam A A, Jankowsky E. DEAD-box helicases form nucleotide-dependent, long-lived complexes with RNA[J]. Biochemistry, 2014, 53(2): 423–433. DOI: 10.1021/bi401540q
[35] Cordin O, Banroques J, Tanner N K, et al. The DEAD-box protein family of RNA helicases[J]. Gene, 2006, 367: 17–37. DOI: 10.1016/j.gene.2005.10.019
[36] Lorsch J R, Herschlag D. The DEAD box protein eIF4A. 1. A minimal kinetic and thermodynamic framework reveals coupled binding of RNA and nucleotide[J]. Biochemistry, 1998, 37(8): 2180–2193. DOI: 10.1021/bi972430g
[37] Polach K J, Uhlenbeck O C. Cooperative binding of ATP and RNA substrates to the DEAD/H protein DbpA[J]. Biochemistry, 2002, 41(11): 3693–3702. DOI: 10.1021/bi012062n
[38] Sengoku T, Nureki O, Nakamura A, et al. Structural basis for RNA unwinding by the DEAD-box protein Drosophila Vasa[J]. Cell, 2006, 125(2): 287–300. DOI: 10.1016/j.cell.2006.01.054
[39] Andersen C B, Ballut L, Johansen J S, et al. Structure of the exon junction core complex with a trapped DEAD-box ATPase bound to RNA[J]. Science, 2006, 313(5795): 1968–1972. DOI: 10.1126/science.1131981
[40] Bono F, Ebert J, Lorentzen E, et al. The crystal structure of the exon junction complex reveals how it maintains a stable grip on mRNA[J]. Cell, 2006, 126(4): 713–725. DOI: 10.1016/j.cell.2006.08.006