射精量和精液品质是衡量种公牛种用价值的关键因素, 而睾丸间质细胞分泌的睾酮(testosterone, T)是维持精子发生最关键的因素之一, 在雄性动物生殖系器官发育中起着重要作用^[1]。来曲唑(letrozole, LE)是人工合成用于口服的第三代非甾体芳香化酶抑制剂, 可与亚铁血红蛋白中的铁原子结合, 同内源性底物竞争芳香化酶的活性位点, 可逆性地抑制芳香化酶的活性, 有效地阻断T和雄烯二酮(androstenedione, AD)分别向雌二醇(estradiol, E₂)和雌酮(estrone, E₁)转化, 从而提高体内雄激素水平^[2-4]。白双勇等^[5]在给肥胖男性的少弱精症治疗中使用了2.5 mg·d^-1 LE, 3个月后血浆T水平显著升高。Kawakami等^[6]研究表明, 给少精症和无精症的狗经皮植入芳香化酶抑制剂胶囊, 可提高血浆中T浓度, 降低E₂浓度。本试验根据来曲唑的生物学特性, 给西门塔尔种公牛补喂不同水平的来曲唑, 探究来曲唑能否提高种公牛内源性雄激素含量, 进一步提高种公牛的采精量及改善精液品质。

试验于2015年7月至11月在新疆天山畜牧生物工程股份有限公司进行。选取体质量相近、健康状况良好的西门塔尔种公牛35头。采用单因子多水平试验设计方法, 将35头种公牛随机分为5组:对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组, 在饲喂基础日粮的同时, 分别饲喂0、50、100、150和200 mg·d^-1 LE。每日18:00将来曲唑与精料补充料混合一次性饲喂, 饲养试验期100 d。来曲唑原药购自山东华禧药业有限公司(批号:20150405), 含量为99.5%(质量分数)。

试验期间所有种公牛采用半封闭舍单栏饲养。试验期间种公牛采用定时定量饲喂法, 先补精料, 后喂粗料, 少量多次, 自由饮水的原则, 采精前、后0.5 h内均不能饮水。每日采食结束后, 赶至运动场自由活动; 每日11:00—12:00清理圈舍及对种公牛进行刷拭。日粮组成及精料营养水平见表 1。

表 1 饲粮组成及精料营养水平 Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet

表选项

于试验期0、20、40、60、80和100 d早晨饲喂后2 h, 用假阴道法采集公牛精液, 检测射精量、精子活力、精子密度和精子畸形率; 取试验0、60和100 d精液, 在30~32 ℃水浴锅中静置20 min后, 3 500 r·min^-1离心15 min, 取上清液-20 ℃保存, 用于精浆激素水平检测。

于试验期0、60和100 d早晨, 空腹用肝素钠抗凝管颈部静脉采集公牛血样, 每头10 mL, 3 500 r·min^-1离心15 min后取上清液于-20 ℃保存, 用于血浆激素水平检测。

射精量、精子活力、精子密度、精子畸形率的操作方法和评定参照《牛冷冻精液国家标准:GB/T 4143—2008》进行。

精浆、血浆样品委托北京华英生物技术公司进行E₁、E₂、雌三醇(estriol, E₃)、促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH, 人用试剂盒)、促黄体素(luteinizing hormone, LH, 人用试剂盒)、T、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、AD、性激素结合蛋白(sex hormone-binding globulin, SHBG)和褪黑素(melatonin, MT)的测定。各激素测定的试剂盒灵敏度见表 2。

表 2 种公牛血浆和精浆中各种激素测定试剂盒灵敏度水平 Table 2 Kit sensitivity on various hormones in blood plasma and seminal plasma of bulls

表选项

数据采用Excel 2003进行整理, 用SAS 9.2软件中Mixd混合模型统计有重复观测的数据, 固定效应包括试验处理(trt)、试验期(date)及二者之间的交互作用(Trt×Date)。方差结构采用复合对称结构(cs), 数据为最小二乘均数, 采用Pdiff法进行多重比较。

补喂LE对种公牛血浆激素水平的影响如表 3所示:与对照组相比, 各试验组AD水平均极显著提高(P < 0.01), 试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组T水平极显著提高(P < 0.01)。试验Ⅰ组E₂水平极显著下降(P < 0.01), 试验Ⅱ组和Ⅳ组E₂水平显著下降(P < 0.05)。各试验组SHBG水平均呈极显著降低(P < 0.01)。E₃水平无显著差异(P > 0.05), 各试验组FSH、LH水平与对照组相比差异不显著(P > 0.05)。MT水平主要受光照影响, 本试验血样采集分别在7、9和11月, 数据显示季节极显著影响MT水平, 但从处理水平看, 试验Ⅱ组MT水平极显著高于对照组(P < 0.01)。各组激素水平变化结果表明LE对种公牛并未显示剂量效应。

表 3 补喂LE对种公牛血浆激素水平的影响 Table 3 Effects of LE on hormone level in blood plasma of bulls

表选项

从表 3还可以看出, 季节显著影响种公牛血浆中AD、T、E₂、E₁、E₃、SHBG、MT等的水平, 而对FSH和LH的影响不显著。此外, 种公牛血浆中AD、T及E₃的水平受处理和季节的交互作用影响极显著(图 1)。

	图 1 血浆中AD、T和E3水平的变化 Figure 1 Change of the level of AD, T and E3 in plasma
图选项

如图 1所示:试验期内, 对照组血浆中AD和T水平变化不大, 各试验组血浆中AD和T水平均呈现先升高后降低的趋势, 与对照组中相比, 60和100 d时, 各试验组AD和T水平均高于对照组。血浆中, 对照组E₃水平呈下降趋势, 各试验组呈先下降后升高的趋势, 但与对照组相比, 试验期为60 d时, 各试验组E₃水平均低于对照组, 试验期为100 d时, 各试验组E₃水平均高于对照组。

补喂LE对种公牛精浆激素水平的影响如表 4所示:与对照组相比, 各试验组公牛精浆中T水平均极显著提高(P < 0.01)。试验Ⅰ组E₂水平极显著下降(P < 0.01), 各试验组E₁水平均极显著下降(P < 0.01)。各试验组T-AOC水平均极显著升高(P < 0.01)。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组MDA水平极显著降低(P < 0.01)。各试验组FSH和LH水平与对照组相比差异不显著(P > 0.05)。各组激素水平变化表明LE对种公牛并未显示剂量效应。

表 4 补喂LE对种公牛精浆激素水平的影响 Table 4 Effects of LE on hormone level in seminal plasma of bulls

表选项

从表 4还可以看出, 季节显著影响种公牛精浆中T、E₂、E₁、E₃、LH、MDA等激素水平, 而对FSH和T-AOC的影响不显著。此外, 种公牛血浆中T和E₃的水平受处理和季节的交互作用影响极显著(图 2)。

	图 2 精浆中T和E3水平的变化 Figure 2 Change of the level of T and E3 in seminal plasma
图选项

精浆中T水平变化如图 2所示:各试验组精浆中T水平呈先升高后下降趋势, 对照组呈下降趋势。对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅲ组精浆中E₃水平呈先下降后升高的趋势, 而试验Ⅱ组和试验Ⅳ组呈下降趋势。

补喂LE对种公牛精液品质的影响如表 5所示:试验Ⅰ~Ⅳ组种公牛射精量分别比对照组高27.65%(P < 0.01)、32.20%(P < 0.01)、28.60%(P < 0.01)、17.42%(P < 0.05)。试验Ⅱ组精子活力极显著高于对照组(P < 0.01), 试验Ⅲ组和试验Ⅳ组精子活力显著高于对照组(P < 0.05)。季节影响精子密度和精子畸形率(P=0.035 0;P=0.031 8), 但处理水平对精子密度和精子畸形率影响不大(P > 0.05)。

表 5 补喂LE对种公牛精液品质的影响 Table 5 Effects of LE on semen quality of bulls

表选项

从表 5还可以看出, 季节显著影响种公牛的射精量, 而对精子活力、精子密度、精子畸形率的影响不显著。此外, 种公牛的射精量、精子活力、精子密度和精子畸形率受处理和季节的交互作用影响不显著。

动物体内激素的调节是一个复杂的过程。在公牛体内的激素调节过程中, GnRH经垂体门脉系统到达垂体前叶, 促进FSH、LH分泌^[7]。LH、FSH则可刺激卵泡膜细胞和睾丸间质细胞分泌性激素, FSH能够促进粒层细胞芳香化酶的活化, 使AD和T向E₁和E₂转化^[8], 同时高水平的雄激素对LH、FSH和GnRH的分泌又有负反馈机制, 生成的T可转化成E₂使血液中雌激素水平升高^[9]。当体内E₂、T水平升高后又抑制GnRH释放从而减少LH、FSH分泌, 最终减少E₂、T的分泌量, 使机体内性激素水平达到一个平衡状态^[10]。生殖激素动态调节在精子发生调节中发挥中心作用^[11]。精子发生受垂体分泌的LH、FSH及睾丸间质细胞分泌的T调节。睾丸间质细胞分泌的T是维持精子发生最关键的因素之一^[12]。

LE可逆性地抑制芳香化酶活性, 有效抑制体内雄激素向雌激素转化, 并在体内短暂增加雄激素的水平^[13]。陶月红等^[14]在给青春期男童补喂2.5 mg·d^-1 LE, 发现试验组血浆中T水平变化率相对于服用之前增加61.6%, 且与对照组相比增长有显著性差异。

机体中, 雌激素由雄激素转化而来, AD和T在芳香化酶的作用下分别转化为E₁和E₂, 同时, AD在17-β羟脱氢酶催化下转化为T, E₂又可转化为E₁和E₃。性腺激素合成后立即释放进入血液循环, 以游离、与血清白蛋白结合及与性激素结合蛋白(SHBG)结合运输到靶细胞。LE作为芳香化酶抑制剂可抑制AD和T向E₁和E₂转化。本试验结果表明:补喂不同水平LE均可提高种公牛血浆及精浆中AD含量, 降低E含量。精浆中T水平均极显著提高。血浆中SHBG含量均极显著降低。各试验组血浆及精浆中FSH、LH水平变化不显著。精液品质数据结合激素水平的变化显示添加100 mg·d^-1 LE效果最佳, 其原因可能是添加100 mg·d^-1, 血浆及精浆中的雄激素和雌激素水平在提高精液品质的同时可维持激素间的稳态。At-Taras等^[15-16]研究表明, 给种公猪补喂0.1 mg·kg^-1 LE, 可降低机体中E含量, 增加睾丸质量, 提高总精子数, 不影响FSH及LH水平。这进一步证实来曲唑的作用发生在外周组织, 并没有干扰下丘脑-垂体轴。

性激素结合球蛋白(SHBG)是性激素转运蛋白, 由肝脏合成并分泌进入血浆, 血浆中的SHBG含量很低, 但与性激素结合的特异性非常高, 特别是与双氢睾酮(DHT)、T、E₂有较高的亲和力, 用于调节性激素的活性^[17-18]。当雄激素水平增加时, 血浆中SHBG浓度降低, 结合容量下降^[19]。同样, 在本试验中, 血浆T增加, 而SHBG浓度降低。

褪黑素(MT)分泌受光照的调节, 黑暗促进MT分泌, 光照抑制MT分泌。MT主要影响季节性发情动物的繁殖机能^[20]。对于非季节性繁殖的动物, MT分泌也存在季节性变化^[21]。García等^[22]研究报道, 赤鹿血浆中MT的含量显著受季节影响, 冬季MT含量显著高于其他3个季节。本试验血样采集集中在7、9、11月, 数据显示季节也极显著影响MT水平。

研究表明MT是有效的自由基清除剂^[23-24], 其可以通过清除自由基, 抗氧化及抑制脂质的过氧化反应来保护细胞结构、防止DNA损伤和降低机体过氧化物的含量^[25-27]。Russel等^[28]研究表明, MT对通过释放自由基而损伤DNA的致癌物黄樟素引起DNA损伤的保护作用可达到99%, 且呈剂量-效应关系。此外, MT对外源性毒物引起的过氧化以及产生的自由基所造成的组织损伤有明显的拮抗作用。本试验中, 试验Ⅱ组MT含量极显著高于对照组, 与精浆中T-AOC及MDA水平的结果一致。

研究证实活性氧(ROS)产生过多是导致精液品质下降的主要因素之一^[29-30]。过量的ROS会引起精子活力降低, 精子畸形率增加^[31], 损害精子质膜及导致精子DNA断裂。因此, 在饲养种公牛时, 提高机体的抗氧化能力, 可保护精子免受氧化损伤。研究证明, 雄激素对机体氧化应激的消除有一定的作用^[32]。马海田等^[33]研究发现给大鼠灌胃脱氢表雄酮能够降低血清和肝脏MDA的含量, 提高肝脏中SOD的活性。Keymel等^[34]研究发现接受雄激素去势治疗患者机体出现氧化应激失衡, 推测雄激素是抑制氧化应激的重要物质。在本试验中, 补喂不同水平LE均可提高西门塔尔种公牛精浆中的T-AOC, 降低精浆中MDA含量。LE是否直接对机体氧化应激有抑制作用, 目前尚未有明确的报道。但是从激素调节机体氧化应激来看, 补喂LE后, 机体雄激素的水平升高, 高雄激素水平能够改善机体氧化失衡, 提高抗氧化酶活力, 抑制脂质过氧化生成丙二醛, 从而促进机体抗氧化能力。因此, 补喂来曲唑能够在减少氧化应激的同时能提高西门塔尔种公牛的精液品质。

影响种公牛精液品质的因素很多, 包括遗传、营养、环境、年龄及自身激素水平等均会对精液品质造成影响。睾丸间质细胞分泌的T是体内重要的雄激素, 也是维持精子发生最关键的因素之一。李青旺等^[35]发现, 在8—12月, 当精液T水平较高时, 公绵羊的射精量、精子活力明显增加, 精子畸形率显著降低。李晓霞等^[36]发现, 添加MT可抑制ROS诱发的精子氧化损伤并提高精子活力。本试验中, 试验组采精量及精子活力与对照组相比均有所提高, 这可能与LE可调节种公牛睾丸中雄激素水平及精液的抗氧化能力有关。因此, 适当提高内源性雄激素水平及提高种公牛精液中的抗氧化水平对种公牛精子发生的一系列过程有良好的调节作用, 从而增加了种公牛采精量并提高了精液品质。

总之, 种公牛补喂来曲唑可显著提高内源性雄激素水平, 降低雌酮和雌二醇水平, 而不影响促卵泡素和促黄体素水平, 还可以提高精浆中总抗氧化能力, 降低丙二醛含量, 并可提高射精量及精子活力。补喂剂量以100 mg·d^-1效果最好。