南京农业大学学报  2017, Vol. 40 Issue (4): 725-731   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201612012
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朱春娟, 原现军, 董志浩, 李君风, 陈雷, 王思然, 白云峰, 邵涛
ZHU Chunjuan, YUAN Xianjun, DONG Zhihao, LI Junfeng, CHEN Lei, WANG Siran, BAI Yunfeng, SHAO Tao
添加剂对饲料型四倍体刺槐青贮发酵品质和体外消化率的影响
Effect of additives on fermentation quality and in vitro digestibility of tetraploid black locust(Robinia pseudoacacia L.)silage
南京农业大学学报, 2017, 40(4): 725-731
Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(4): 725-731.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201612012

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收稿日期: 2016-12-09
添加剂对饲料型四倍体刺槐青贮发酵品质和体外消化率的影响
朱春娟1, 原现军1, 董志浩1, 李君风1, 陈雷1, 王思然1, 白云峰2, 邵涛1    
1. 南京农业大学饲草调制加工与贮藏研究所, 江苏 南京 210095;
2. 江苏省农业科学院动物科学基地, 江苏 南京 210014
摘要[目的]探讨葡萄糖、糖蜜和乳酸菌对饲料型四倍体刺槐青贮发酵品质及体外消化率的改善效果。[方法]试验设对照组(C)、葡萄糖组(G)、糖蜜组(M)、乳酸菌组(L)、乳酸菌+葡萄糖组(L+G)、乳酸菌+糖蜜组(L+M),分别在青贮后7、14、30、60 d开窖取样,分析青贮饲料发酵品质和体外消化率。[结果]饲料型四倍体刺槐在整个青贮过程中乳酸产生和pH下降缓慢,致使青贮结束时,各组具有较低的乳酸(3.32~18.39 g·kg-1)与较高的pH值(4.88~5.66),但各组仅检测到极微量的丁酸(小于2 g·kg-1)及较低的氨态氮/总氮值(54.52~60.54 g·kg-1)。与对照组相比,G、M和L组未明显提高青贮饲料发酵品质和体外消化率,而L+G和L+M组有较明显的改善效果,其中L+M组在整个发酵过程中保持最高的乳酸含量和体外消化率。各处理组氨态氮/总氮值、粗蛋白含量与对照组相比无显著差异(P > 0.05);但各处理组中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均显著低于对照组(P < 0.05),其中L+M组中性和酸性洗涤纤维含量最低(P < 0.05)。[结论]添加葡萄糖、糖蜜和乳酸菌对青贮发酵品质和体外消化率有一定的改善效果,组合添加优于单独添加,其中L+M组改善效果最佳。
关键词饲料型四倍体刺槐   添加剂   发酵品质   体外消化率   
Effect of additives on fermentation quality and in vitro digestibility of tetraploid black locust(Robinia pseudoacacia L.)silage
ZHU Chunjuan1, YUAN Xianjun1, DONG Zhihao1, LI Junfeng1, CHEN Lei1, WANG Siran1, BAI Yunfeng2, SHAO Tao1    
1. Institute of Ensiling and Processing of Grass, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Jiangsu Animal Science Base, Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
Abstract: [Objectives] The objective of this study was to investigate the effect of additives on the fermentation quality and in vitro digestibility of tetraploid black locust(Robinia pseudoacacia L.). [Methods] The treatments were as follows:control group(no additives, C), glucose group(G), molasses group(M), inoculant(Lactobacillus plantarum) group(L), inoculant+glucose group(L+G), inoculant+molasses group(L+M). The silos were opened and sampled on 7, 14, 30 and 60 days after ensiling, respectively, and then the fermentation quality and in vitro digestibility of silages were analyzed. [Results] A slow accumulation of lactic acid and decline of pH were observed in tetraploid black locust silage, resulting in low lactic acid content(3.32-18.39 g·kg-1), high pH value(4.88-5.66), minor propionic acid and butyric acid( < 2 g·kg-1)and low ammonia nitrogen/total nitrogen value(54.52-60.54 g·kg-1)at the end of ensiling. Compared with the control, G, M and L showed no great improvement on fermentation quality and in vitro digestibility, while L+G and L+M silages did. And the lactic acid content and in vitro digestibility value of L+M silage maintained the highest value during the fermentation process. There were no significant differences(P > 0.05) in crude protein content among all treatments as compared with control. However, the neutral detergent fiber and acid detergent fiber contents were significantly lower than those of control(P < 0.05), and L+M silage had the lowest neutral detergent fiber and acid detergent fiber content(P < 0.05). [Conclusions] It was suggested that all additives improved the fermentation quality and in vitro digestibility of tetraploid black locust silage to some degree, and the combination treatment was superior to the single treatment. L+M silage performed best.
Key words: tetraploid black locust    additives    fermentation quality    in vitro digestibility   

随着我国畜牧业的发展, 牛羊等草食家畜数量剧增, 蛋白质饲料短缺问题日渐突出, 人畜争粮矛盾亟待解决。木本饲料植物营养价值丰富, 尤其是蛋白质含量较高, 被誉为“绿色蛋白”[1]。开发木本饲料资源可扩大蛋白质饲料来源, 促进传统耗粮型畜牧业向节粮型畜牧业的良性转型。

饲料型四倍体刺槐(Robinia pseudoacacia L.)是由普通刺槐经秋水仙素诱导产生的饲料刺槐新品种, 1997年从韩国引入我国, 具有耐寒、耐旱和根系发达以及生长迅速快速成林的特性, 是水土保持、防风固沙, 营造生态型灌木林的理想树种, 已在我国20多个省引种栽培[2]。饲料型四倍体刺槐营养价值高, 富含蛋白质、矿物质和多种维生素, 其中粗蛋白及必需氨基酸含量之和均高于苜蓿草粉和玉米蛋白饲料, 与白三叶草粉相当, 属优质植物性蛋白饲料[3]。饲料型四倍体刺槐幼嫩枝叶鲜嫩多汁, 产量高, 适口性好, 研究者通过饲喂试验肯定了其作为反刍动物优质植物性蛋白饲料的利用价值[4]。饲料型四倍体刺槐每年可刈割2~4次, 其枝叶可为家畜提供丰富的青绿饲料。但是, 作为一种季节性树种, 不能全年供应, 因此调制成青贮饲料可实现全年供应, 满足家畜全年的营养需求, 缓解蛋白质饲料资源的不足。

饲料型四倍体刺槐可溶性碳水化合物含量较低、缓冲能较高, 采用自然青贮方式难以成功[3]。葡萄糖、糖蜜和乳酸菌制剂作为青贮发酵促进剂已经广泛应用于难以青贮的豆科牧草中, 取得了理想的效果。葡萄糖和糖蜜可直接作为发酵底物, 补充青贮初期不良发酵引起的发酵底物损失, 确保乳酸发酵占主导地位[5]; 青贮过程中添加乳酸菌可以加速乳酸发酵, 使青贮饲料快速达到稳定状态, 有效抑制有害微生物对营养成分的降解, 减少干物质损失, 提高青贮饲料的发酵品质和体外消化率[6]

目前, 关于饲料型四倍体刺槐青贮饲料调制的研究报道较少, 本试验旨在探讨添加葡萄糖、糖蜜和乳酸菌对四倍体刺槐青贮发酵品质及体外消化率的改善效果, 为调制优质饲料型四倍体刺槐青贮饲料提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

青贮材料来自安徽省绿+硒农业生态科技发展有限公司, 多年生饲料型四倍体刺槐种植于安徽省石台县小河镇红石村基地, 于2014年11月8日采收, 植株新稍长至90~120 cm时进行整株刈割, 属当年第三茬刈割, 留茬高度为20 cm左右, 槐叶为去除枝条的叶柄和叶片部分。

葡萄糖为分析纯级, 购于国药集团化学试剂有限公司。糖蜜为制糖业副产品, 主要成分为蔗糖, 红褐色黏稠状液体。乳酸菌制剂由南京农业大学饲草调制加工与贮藏研究所研制, 主要成分为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

1.2 试验设计

实验室青贮窖采用容积为2 L, 有内、外两层盖的特制圆柱状聚乙烯塑料桶。试验采用完全随机区组设计, 设对照和5个添加剂处理组:无添加组(C)、葡萄糖组(G)、糖蜜组(M)、乳酸菌制剂组(L)、乳酸菌制剂+葡萄糖组(L+G)、乳酸菌制剂+糖蜜组(L+M), 其中糖蜜添加量为1%, 葡萄糖添加量为3%, 乳酸菌制剂添加水平为106 CFU·g-1, 均在鲜质量(fresh weight, FW)基础上添加。

1.3 试验方法 1.3.1 青贮饲料的调制

将新鲜采收的槐叶用铡刀切成长2 cm左右, 以鲜质量为基础按试验设计量将各添加剂添加到青贮原料中(水分含量为62.19%), 充分混合均匀后, 装填至2 L实验室青贮窖中压实, 盖上内外盖胶带密封, 置于室温下保存。分别在青贮7、14、30、60 d开窖取样分析, 每个处理各时间点5个重复, 共计120个实验室青贮窖。

1.3.2 样品处理

青贮窖打开后, 将全部青贮饲料取出混合均匀, 按四分法称取20 g样品, 放入100 mL的广口三角瓶中, 加入60 g去离子水, 置于4 ℃冰箱中浸提24 h, 然后通过双层纱布和定性滤纸过滤, 得到青贮饲料浸提液, -20 ℃冷冻冰箱保存待测。浸提液用于测定pH值和乳酸、氨态氮、挥发性脂肪酸以及乙醇含量。将剩余青贮饲料收集烘干, 用于测定干物质、粗蛋白、水溶性碳水化合物、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量和体外消化率。

1.3.3 测定指标及分析方法

将青贮原料和青贮饲料于105 ℃杀青2 h, 随后65 ℃烘箱中烘干60 h以上至恒质量, 测定干物质(dry matter, DM)含量; 缓冲能(buffer capacity, BC)测定用盐酸-氢氧化钠滴定法; pH值用pH211型精密pH计(HANNA公司)测定; 粗蛋白(crude protein, CP)采用KjeltecTM2300型全自动凯氏定氮仪测定; 中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)含量用范氏纤维分析法测定; 水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法测定; 氨态氮(ammonia nitrogen, AN)含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定; 乳酸、乙醇、挥发性脂肪酸含量(volatile fatty acids, VFAs)采用安捷伦1260高效液相色谱仪测定, 配备示差检测器, Carbomix® H-NP5色谱柱(测试条件:55 ℃、2.5 mmol·L-1 H2SO4、0.5 mL·min-1)[7]。乳酸菌、好氧性细菌、酵母菌数量采用平板计数法, 分别选用MRS(deMan-Rogosa-Sharpe)琼脂培养基、营养琼脂培养基(nutrient agar, NA)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA), 35 ℃恒温培养2~3 d, 对菌落数进行计数[8]

1.3.4 体外消化率测定方法

以装4只有永久性瘘管的健康成年去势波尔杂交山羊(体质量35 kg)为瘤胃液供体, 在晨饲前采集瘤胃内容物, 立即置入39 ℃的保温瓶中, 迅速带回实验室; 快速搅拌均匀后, 通入CO2的同时用4层纱布过滤至39 ℃的保温瓶中待用。向预热至39 ℃的发酵瓶(150 mL)中通入CO2, 同时加入40 mL新配制人工唾液和20 mL瘤胃液, 混匀并加入1 g待测样品(经65 ℃烘干后的青贮样品, 粉碎, 过1 mm筛)。人工唾液参照Moselhy等[9]的方法制备。分装结束后具塞、打盖, 并统一放气, 使内外气压相等, 39 ℃恒温发酵72 h后, 烘干发酵剩余残渣, 测定干物质、中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维含量, 并计算各样品体外干物质、中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维消化率。

1.4 数据处理与统计

采用SPSS 20.0软件对试验数据进行单因子方差分析(ANOVA), 并用Duncan′s方法对处理间和各青贮时间的数据进行多重比较(P < 0.05)。

2 结果与分析 2.1 饲料型四倍体刺槐化学成分、附着微生物组成和消化率

饲料型四倍体刺槐化学和微生物成分如表 1所示。干物质含量为378.14 g·kg-1, 粗蛋白含量为163.09 g·kg-1, 水溶性碳水化合物为73.91 g·kg-1, 缓冲能为478.43 m·kg-1。中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别为324.50和224.80 g·kg-1。附着的乳酸菌数小于1.0×105 CFU·g-1, 而好氧性细菌和酵母菌的数均大于1.0×106 CFU·g-1, 体外干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的消化率分别为51.39%、42.77%和40.50%。

表 1 饲料型四倍体刺槐化学成分含量、附着微生物组成和体外消化率 Table 1 Chemical and epiphytic microbial compositions and in vitro digestibility of fresh tetraploid black locust
2.2 添加剂对饲料型四倍体刺槐青贮过程中pH值、乳酸/乙酸值、干物质、乳酸和乙酸含量的影响

表 2所示:整个青贮过程中, 各组干物质含量总体上呈下降趋势, 其中C和L组14 d后显著下降(P < 0.05), G组30 d后显著下降(P < 0.05)。青贮60 d, M组干物质含量显著高于其他各组, 而L组干物质含量最低。

表 2 添加剂对饲料型四倍体刺槐青贮过程中pH值、乳酸/乙酸值及干物质、乳酸和乙酸含量的影响 Table 2 Effect of additives on pH, LA/AA value and contents of dry matter, lactic acid and acetic acid of tetraploid black locus during ensiling

随着青贮的进行, 各组pH值逐渐降低, 青贮30 d降至最低, 之后有所升高。青贮过程中各处理组pH值始终低于或显著低于对照组。青贮结束时, M、L+G和L+M组pH显著低于C、G和L组, L+M组pH值最低。青贮过程中各组乳酸含量逐渐增加, M组乳酸含量青贮14 d达到最高, 其他各组乳酸含量均在30 d达到最高。整个青贮过程中L+G和L+M组乳酸含量分别显著高于单独添加组L、G和M组, 其中, L+M组乳酸含量最高, 这与L+M组pH值最低相对应。

各组乙酸含量随着青贮时间延长显著增加, 青贮60 d后, 各组乙酸含量达16.78~28.81 g·kg-1。L+G组和L+M组乙酸含量分别为28.81和28.55 g·kg-1, 显著高于C和G组, 但与M和L组差异不显著(P > 0.05)。整个青贮过程中乳酸/乙酸(LA/AA)值呈先升高后下降的趋势, 其中L+G、M组分别在7和14 d达到最大值, 随后显著降低。C、G、L和L+M组LA/AA在30 d时达到最大值后下降, 各处理组LA/AA值高于对照组。青贮14 d后, L+M组LA/AA显著高于其他组。

2.3 添加剂对饲料型四倍体刺槐青贮过程中氨态氮/总氮值及挥发性有机酸、乙醇和水溶性碳水化合物含量的影响

表 3所示:各组仅在青贮60 d时检测到微量的丙酸和丁酸(小于2 g·kg-1)。青贮7 d, 各组乙醇含量已达到18.24~32.19 g·kg-1。随着青贮时间延长, G和L+G组乙醇含量不断增加, 其他各组乙醇含量虽有波动, 但变化不明显(P > 0.05)。青贮60 d时, M组乙醇含量显著高于L组(P < 0.05), 其他各组间差异不显著。

表 3 添加剂对饲料型四倍体刺槐青贮过程中氨态氮/总氮值及挥发性脂肪酸、乙醇和水溶性碳水化合物含量的影响 Table 3 Effect of additives on AN/TN and contents of volatile fatty acid, ethanol and WSC of tetraploid black locus during ensiling

随着青贮发酵时间的延长, 各组水溶性碳水化合物含量不断下降。青贮7 d时M组含量显著高于其他各组, 其他组间差异不显著。青贮60 d时, L组水溶性碳水化合物的含量显著低于G组。

整个青贮过程中各组氨态氮/总氮值不断提高。除了青贮14 d的L+M组外, 其他各处理组的氨态氮/总氮值始终低于对照组。青贮7 d时, L+G组氨态氮/总氮值显著低于C、G和L+M组, 青贮14~30 d期间, L+G组氨态氮/总氮值始终显著低于其他组, 其他组间差异不显著。至青贮60 d, 各组氨态氮/总氮值维持在54.52~60.54 g·kg-1范围, 无显著性差异。

2.4 添加剂对青贮饲料粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的影响

表 4可知:青贮60 d, 各处理组粗蛋白含量和对照组之间差异不显著, L+G组粗蛋白含量为148.54 g·kg-1, 显著高于G、L和L+M组。各处理组中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均显著低于对照组, L+M组中性洗涤纤维含量显著低于其他各组, G、L和L+G之间中性洗涤纤维含量差异不显著。L+M组酸性洗涤纤维含量显著低于各处理组, 但其他处理组间差异不显著。

表 4 添加剂对青贮饲料粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的影响 Table 4 Effect of additives on crude protein, neutural detergent fiber and acid detergent fiber contents of silages during 60 days ensiling
2.5 添加剂对饲料型四倍体刺槐青贮饲料体外消化率的影响

表 5可知:青贮60 d, 各处理组的体外干物质消化率均高于或显著高于对照组(P < 0.05), 其中L+G和L+M组显著高于其他各组。与对照组相比, G、M和L组的体外中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维消化率均无显著差异, 但L+G和L+M组的体外中性洗涤纤维消化率显著高于其他各组, 体外酸性洗涤纤维消化率仅显著高于对照组。各组的体外干物质和酸性洗涤纤维消化率均高于饲料型四倍体刺槐原料草。

表 5 添加剂对饲料型四倍体刺槐青贮饲料体外消化率的影响 Table 5 Effect of additives on in vitro digestibility of tetraploid black locust silages
3 讨论

本试验整个青贮过程中, 各组LA含量缓慢增加, pH值缓慢下降, 青贮60 d时, 各组LA含量(3.32~18.39 g·kg-1)均较低, pH值(4.88~5.61) 较高, 说明各组乳酸发酵的速度和程度均被抑制, 这可能是青贮原料饲料型四倍体刺槐具有较高的干物质含量(378.14 g·kg-1), 导致植物细胞壁破裂和细胞内汁液渗出缓慢, 造成青贮早期有效发酵底物的不足, 不能被乳酸菌高效利用; 同时, 干物质含量较高使乳酸菌活性降低所致[10]。植物细胞壁破裂和细胞内汁液的渗出是开启青贮早期乳酸发酵的关键条件。L+G和L+M组比G、M、L组具有较高的LA含量和较低pH值, 印证了有效发酵底物和乳酸菌活性不足是影响饲料型四倍体刺槐青贮发酵品质的主要因素, 因此组合添加组改善效果较好。水分含量较低的青贮原料, 微生物处于生理干燥环境中, 能有效抑制丁酸梭菌和大肠杆菌等有害微生物的繁殖, 减少其对发酵底物和蛋白质等营养物质的消耗[11]。本试验整个青贮过程中各组乙酸含量、氨态氮/总氮值保持较低水平, 各组青贮60 d时仅检测到极微量的丙酸和丁酸, 说明有害微生物的活性被抑制, 青贮饲料处于稳定状态, 可长期贮存。张晨辉等[12]研究表明饲料型四倍体刺槐添加3%蔗糖后青贮饲料感官评定为优良, 但pH值高达5.96。因此对于干物质含量较高的青贮原料, 不能单一的依据pH值和LA含量的高低评定青贮饲料发酵品质的优劣。

一般植物本身附着的乳酸菌主要以异型发酵乳酸菌为主[13]。本试验中对照组乙酸含量逐渐升高, LA/AA值始终小于2, 表明饲料型四倍体刺槐自然青贮过程中以异型发酵为主。单独添加发酵底物的G和M组中的LA、AA含量均高于对照组, 但LA/AA值始终小于2, 说明补充发酵底物一定程度上促进了乳酸发酵, 但仍以异型发酵为主。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是常用的发酵接种剂之一, 利用底物广泛、耐酸性强。L组AA含量显著高于对照组, LA/AA值小于对照组, 这可能与青贮原料本身附着的异型发酵乳酸菌数量较多, 造成外源添加的植物乳杆菌竞争力较弱, 也可能与接种的植物乳杆菌本身的生理特性有关。有研究指出植物乳杆菌可以根据青贮环境的变化调节自身的代谢途径, 在水溶性碳水化合物含量相对充足的厌氧条件下, 利用己糖进行同型发酵, 通过糖酵解途径产生乳酸; 而在水溶性碳水化合物含量相对短缺的情况下, 利用戊糖通过戊糖磷酸化途径生成CO2、乙醇或乙酸等终产物[14]。植物乳杆菌还可以利用丝氨酸作为底物, 通过脱氨基作用, 产生乙酸和游离氨[15]。青贮7 d时各组可利用水溶性碳水化合物含量仅为27.94~41.1 g·kg-1。低糖条件下不仅一些异型乳酸菌开始活跃, L组添加的植物乳杆菌也会进行异型发酵和乳酸异化作用, 导致较高的AA含量, 较低的LA含量及LA/AA值。与L组相比, L+G和L+M组发酵底物相对充足, LA含量和LA/AA值均高于L组, 这与植物乳杆菌随青贮环境调节代谢特性一致。

各组青贮早期有较多的乙醇产生, 青贮7 d时乙醇含量已达18.24~32.19 g·kg-1, 高于LA和AA的含量, 这归因于青贮原料干物质含量较高, 青贮时难以压实, 空气不易排尽, 而未能及时达到厌氧环境, 使酵母菌活性提高, 产生了较多的乙醇。C、M、L和L+M组乙醇含量7 d后基本无变化, 但G和L+G组乙醇含量在青贮60 d时显著增加, 这可能与青贮后期活跃的异型发酵有关。异型发酵乳酸菌可以通过戊糖磷酸化途径, 利用6-磷酸核酮糖产生乳酸和乙醇, 使乙醇含量升高[11]。整个青贮过程中, 各组乙醇含量始终高于LA和AA含量而占主导地位。这也与微生物对低水分的耐受程度有关, 酵母菌相对于乳酸菌在低水分条件下能保持更高的活性[16]

本试验中青贮原料的水溶性碳水化合物含量为73.91 g·kg-1, 而青贮7 d时各组水溶性碳水化合物含量已降至27.94~41.1 g·kg-1, 但乳酸含量仅为1.57~7.4 g·kg-1, 这表明青贮过程中有较多的水溶性碳水化合物损失。一部分是由于青贮早期仍在进行的植物自身呼吸作用, 另一部分是原材料附着的好氧性微生物所致。青贮60 d后各处理组粗蛋白含量和对照组相比无显著差异, 整个发酵过程中保持较低的氨态氮/总氮值水平, 说明青贮过程中梭菌等有害微生物活性被有效抑制, 蛋白损失较少[8]。各处理组中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量均显著降低, 说明有较多的细胞壁成分在青贮过程中被降解[17]

各处理组的体外干物质和酸性洗涤纤维消化率均有不同程度的提高, 可能是由于青贮过程中细胞壁结构被酸解或酶解, 转化为可消化的营养物质, 易被瘤胃微生物分解利用[18]。L+G和L+M组体外干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维消化率显著高于其他组, 这是由于L+G和L+M组显著提高了青贮饲料营养成分可溶性部分的含量, 降低了不良发酵引起的有机质损失, 提高了可消化利用的营养物质含量。

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