头孢喹肟是第一个动物专用的第四代头孢菌素类抗生素^[1], 具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点, 对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有很强的杀灭作用^[2-4], 安全且不易产生耐药性, 其药动学特点优良, 具有吸收快、达峰时间短、生物利用度高、毒性低等特点^[5-6]。到目前为止, 头孢喹肟在国内、外已广泛应用于猪、牛的呼吸系统感染、奶牛乳房炎的治疗^{[2, 7]}, 临床效果显著。也有将头孢喹肟通过注射给药用于鸭传染性浆膜炎和鸡、鹅的大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等病原菌以及支原体感染的报道, 且临床效果显著^[8]。因此, 随着头孢喹肟在治疗家畜、家禽的细菌感染性疾病中的应用, 其在动物源性食品中的残留也开始受到消费者越来越多的关注。相关研究表明, 硫酸头孢喹肟在动物体内代谢后, 在排泄物及组织中均未检测到除硫酸头孢喹肟药物原形以外的其他代谢产物^[9-10]。目前欧洲药物评价委员会已公布了头孢喹肟在牛和猪可食性组织中的最大残留限量(MRL), 如肌肉中为0.05 μg·mL^-1、肝脏中为0.10 μg·mL^-1、肾脏中为0.20 μg·mL^-1[11-12], 但其在鸡蛋中的残留检测则尚未见报道。为了降低抗生素残留对人体健康产生的潜在危害^[13], 以保证鸡蛋食品安全和保护消费者身体健康, 也为该产品应用于家禽治疗提供必要的试验支撑, 建立鸡蛋中硫酸头孢喹肟残留的高效液相色谱检测方法十分必要。

硫酸头孢喹肟对照品(批号:K0321406, 含量:82.6%)购自中国兽医药品监察所; 乙腈(色谱纯)为西陇化工股份有限公司产品; 甲醇(色谱纯)为天津市光复科技发展有限公司产品; 甲酸(分析纯)为天津市富宁精细化工有限公司产品; 正己烷(分析纯)为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。

高效液相色谱仪(VWD紫外检测器, 配备自动进样器)、紫外分光光度计(CARY 60型)为美国安捷伦公司产品; 旋涡混合仪(VORTEX-5型)为海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品; 高速离心机(H1851R台式高速冷冻离心机)为长沙湘仪离心机仪器有限公司产品; C₁₈SPE固相萃取柱为苏州麦可旺志生物技术有限公司产品; 水浴氮吹仪(CM-12型)为北京成萌伟业科技有限公司产品; 超声波清洗机(SB-4200 DTN型)为宁波新芝生物科技股份有限公司产品; 恒温培养振荡器(HNY-211C型)为天津市欧若仪器仪表有限公司产品; Milli-Q超纯水仪(A10型)为北京科誉兴业科技发展有限公司产品。

0.05%甲酸水-乙腈混合液(体积比12 : 1)。

量取90 mL超纯水, 加入10 mL乙腈, 定容至100 mL, 加入50 μL甲酸混匀。

50%(体积分数)乙腈洗脱液(吸取50 mL乙腈, 加入超纯水定容至100 mL); 90%乙腈洗脱液(吸取90 mL乙腈, 加入超纯水定容至100 mL)。

准确称取10 mg硫酸头孢喹肟对照品(以硫酸头孢喹肟计), 加入流动相, 定容至50 mL, 配制成200.00 μg·mL^-1储备液; 用流动相将储备液依次稀释成40.00、20.00、10.00、4.00、2.00、1.00、0.40、0.20和0.10 μg·mL^-1的标准工作液, 4 ℃冷藏保存。

配制20.00 μg·mL^-1硫酸头孢喹肟标准工作液, 进行紫外分光光度计全波长扫描, 检测硫酸头孢喹肟的最大紫外吸收波长。检测条件为:检测波长270 nm; 流速1 mL·min^-1; 柱温30 ℃; 进样量20 μL; 流动相为0.05%甲酸水-乙腈(体积比12 : 1);C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)。

准确称取2.5 g匀浆后鸡蛋样品于50 mL离心管中, 加入4 mL提取液, 漩涡1 min混匀, 超声10 min, 然后振荡10 min(300 r·min^-1), 再4 ℃、10 000 r·min^-1离心10 min; 将上清液转移至新的50 mL离心管中备用, 向残渣中加入4 mL提取液。重复提取2次, 合并3次上清液。向合并的上清液中加入6 mL正己烷, 旋涡1 min混匀, 再振荡30 min(300 r·min^-1), 4 ℃、10 000 r·min^-1离心10 min后取下层溶液(A)备用; 向上层溶液中加入3 mL 50%乙腈洗脱液, 旋涡1 min混匀, 4 ℃、10 000 r·min^-1离心5 min, 取下层溶液(B)备用。

依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL流动相活化固相萃取柱, 加入溶液(A)滤过萃取柱, 流速为1 mL·min^-1, 2 mL水淋洗; 加入溶液(B), 并开始收集洗脱液, 再用90%乙腈洗脱液洗脱2次, 每次2 mL。收集全部洗脱液于10 mL离心管中, 50 ℃水浴氮气吹干, 加入625 μL流动相复溶, 充分旋涡混匀后4 ℃、12 000 r·min^-1离心10 min。取上清液过0.22 μm微孔滤膜, HPLC进样检测。

取6枚未添加硫酸头孢喹肟的鸡蛋进行匀浆, 分别称取2.375 g匀浆, 与125 μL 2 μg·mL^-1的硫酸头孢喹肟标准工作液混匀(质量体积比1 : 19), 得到2.5 g、药物浓度为0.10 μg·mL^-1的样品; 同时以6枚不添加硫酸头孢喹肟的鸡蛋样品作为对照, 利用HPLC检测方法的特异性。

取空白鸡蛋样品进行匀浆, 称取2.375 g匀浆7份, 分别用40.00、20.00、10.00、4.00、2.00、1.00和0.40 μg·mL^-1的硫酸头孢喹肟标准工作液125 μL混匀(质量体积比为1 : 19), 得到质量浓度分别为2.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05和0.02 μg·mL^-1的药物样品, 进行HPLC检测, 得到各浓度样品响应值。按上述方法处理样品, 重复3个批次, 取3个重复的平均值, 以标准液浓度为横坐标, 各浓度峰面积为纵坐标, 绘制药物浓度的标准曲线, 得到线性回归方程和相关系数(R²)。

称取2.375 g空白鸡蛋样品匀浆3份, 分别与20.00、2.00和0.20 μg·mL^-1的硫酸头孢喹肟标准工作液125 μL混匀(质量体积比1 : 19), 得到1.00、0.10和0.01 μg·mL^-1高、中、低3个浓度的生物样品。按上述方法处理样品, 一个批次同浓度样品设置5个平行, 连续重复5个批次。同时分别配制1.00、0.10和0.01 μg·mL^-1的标准溶液作为对照, 进行HPLC检测, 计算各添加浓度峰面积与相应浓度的标准溶液峰面积之比, 得出样品回收率。

称取2.375 g空白鸡蛋样品匀浆3份, 分别与20.00、2.00和0.20 μg·mL^-1的硫酸头孢喹肟标准工作液125 μL混匀(质量体积比1 : 19), 得到1.00、0.10和0.01 μg·mL^-1高、中、低3个浓度的生物样品。按上述方法处理样品, 一个批次同浓度样品设置5个平行, 连续重复5个批次。同时配制1.00、0.10和0.01 μg·mL^-1的标准溶液作为对照, 进行HPLC检测, 计算各浓度生物样品的日内变异系数和日间变异系数。

称取2.375 g空白鸡蛋样品匀浆4份, 分别与1.00、0.40、0.20和0.10 μg·mL^-1的硫酸头孢喹肟标准工作液125 μL混匀(质量体积比1 : 19), 得到0.050、0.020、0.010和0.005 μg·mL^-1的生物样品, 按上述方法处理样品。同浓度样品设置5个平行, HPLC检测其峰面积, 测得各样品的峰高与噪音, 以信噪比(S/N)不小于3时的浓度为最低检测限; S/N不小于10时的浓度为定量限。

称取2.375 g空白鸡蛋样品匀浆, 与2.00 μg·mL^-1的硫酸头孢喹肟标准工作液125 μL混匀, 得到0.10 μg·mL^-1的生物样品。按上述方法处理样品, 设置3个平行, 分别放置在室温、4 ℃和-20 ℃ 3个条件下, 并分别在0、2、4、6、10、14、18和24 h, 利用HPLC检测其峰面积。用标准曲线回归方程计算各样品中的药物浓度, 考察添加硫酸头孢喹肟标准溶液的生物样品在不同条件下的样品稳定性。

选取几种与硫酸头孢喹肟功能、性质相近的药物或配伍使用的药物与其混合进行HPLC检测。在试验条件下, 分别配制2.00和20.00 μg·mL^-1的头孢噻呋、阿莫西林、氨苄西林、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、β-多西环素、盐酸多西环素、替米考星、恩诺沙星的标准工作液, 采用硫酸头孢喹肟的色谱检测条件进行筛选, 得到在270 nm处有紫外吸收的药物(阿莫西林、氨苄西林、磺胺嘧啶、甲氧苄啶), 将筛选出的4种药物与硫酸头孢喹肟配制成均为20.00 μg·mL^-1的混合标准工作液。取空白鸡蛋进行匀浆, 分别称取2.375 g匀浆, 与混合标准工作液125 μL混匀, 得到各药物浓度均为1.00 μg·mL^-1的生物样品。按上述方法处理样品, 设置3个重复, HPLC检测, 分析筛选药物对硫酸头孢喹肟检测的干扰情况。

在试验条件下, 对20.00 μg·mL^-1的硫酸头孢喹肟对照品进行全波长扫描, 检测得到硫酸头孢喹肟的最大吸收波长在270 nm处。

从图 1中可以看出, 硫酸头孢喹肟保留时间为18.5 min左右, 保留时间前、后无杂质干扰现象, 对称因子在0.95~1.05的最佳范围内, 且分离度大于1.5。该结果表明, 本试验所建立的检测硫酸头孢喹肟方法的特异性良好。

	图 1 鸡蛋中硫酸头孢喹肟检测的HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of the determination of cefquinome sulfate in eggs A:空白对照样品Control sample without cefquinome sulfate; B:硫酸头孢喹肟标准品(0.10 μg·mL-1)Standrad sample of cefquinome sulfate(0.10 μg·mL-1); C:空白鸡蛋添加硫酸头孢喹肟生物样品(0.10 μg·mL-1)The eggs added with cefquinome sulfate(0.10 μg·mL-1).
图选项

分别将2.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05和0.02 μg·mL^-1的药物样品进行HPLC检测, 重复3个批次。硫酸头孢喹肟浓度标准曲线如图 2所示。硫酸头孢喹肟平均浓度与其平均峰面积的回归方程为:y=164.95x+0.693(R²=0.999 8)。

	图 2 硫酸头孢喹肟浓度的标准曲线 Figure 2 The standard curve of cefquinome sulfate
图选项

利用HPLC测定不同批次高、中、低浓度的生物样品的响应值与相应浓度硫酸头孢喹肟标准溶液的响应值, 计算回收率。根据同浓度不同批次的回收率数值求其平均值及标准偏差(表 1)。结果显示:0.01、0.10和1.00 μg·mL^-13个浓度的平均回收率分别为86.2%、85.6%和90.4%, 回收率符合规范要求。

表 1 不同批次硫酸头孢喹肟的平均回收率(n=25) Table 1 The mean recovery rate of the tested cefquinome sulfate in different batches

表选项

HPLC测定不同批次高、中、低浓度的生物样品的响应值, 用标准曲线回归方程计算各样品中的药物浓度, 计算硫酸头孢喹肟的日内、日间变异系数。结果显示(数据表略):0.01、0.10和1.00 μg·mL^-13个浓度的日内变异系数分别为10.47%、6.59%和7.25%, 日间变异系数分别为7.9%、9.25%和7.15%, 均在最大允许值范围内。

如表 2所示:根据S/N值不小于3为方法的最低检测限(LOD), S/N值不小于10为方法的定量限(LOQ), 得到硫酸头孢喹肟在鸡蛋中的LOD为0.01 μg·mL^-1, LOQ为0.02 μg·mL^-1。

表 2 鸡蛋中硫酸头孢喹肟检测限(LOD)和定量限(LOQ)的信噪比值(n=5) Table 2 The S/N of the LOD and LOQ of cefquinome sulfate in the tested eggs

表选项

用HPLC分别测定室温(25 ℃)、4 ℃和-20 ℃条件下0.10 μg·mL^-1硫酸头孢喹肟生物样品的响应值, 用标准曲线回归方程计算各样品中硫酸头孢喹肟的药物浓度(表 3)。结果显示:3个温度条件下生物样品稳定性波动不大。对各组数值求相对标准偏差(RSD)的结果显示:硫酸头孢喹肟在-20 ℃冻融的变异系数最小, 说明在该条件下保存硫酸头孢喹肟的生物样品最稳定。

表 3 硫酸头孢喹肟(0.10 μg·mL^-1)的稳定性 Table 3 The stability of cefquinome sulfate(0.10 μg·mL^-1)in the tested samples

表选项

筛选出陈莫西林、甲氧苄啶、磺胺嘧啶、氨苄西林4种在270 nm处具有紫外吸收的药物, 将添加混合药物的生物样品进行检测。结果(图 3)显示:各药物的保留时间(阿莫西林保留时间为8.6 min, 甲氧苄啶保留时间为10.0 min, 磺胺嘧啶保留时间为11.9 min, 氨苄西林保留时间为14.2 min)与硫酸头孢喹肟的保留时间互不干扰。可见与硫酸头孢喹肟功能、性质相近的药物及常用的配伍用药均对其检测分离不存在干扰。

	图 3 混合生物样品(1.00 μg·mL-1)的色谱图 Figure 3 HPLC chromatograms of blank egg added with mix-standard sample(1.00 μg·mL-1) 1.阿莫西林Amoxicillin; 2.甲氧苄啶Methoxyl benzyl organism; 3.磺胺嘧啶Sulfadiazine; 4.氨苄西林Ampicillin; 5.硫酸头孢喹肟Cefquinome sulfate
图选项

硫酸头孢喹肟含量的检测方法主要有微生物法、酶联免疫法、HPLC法、HPLC-MS法等。其中, 微生物法准确度低且耗时^[14-15]; 酶联免疫法容易出现假阳性结果, 只可用于初始筛选而不能作为残留检测^[16]; HPLC法不能对已分离的组分进行直接定性, 有时还需用梯度洗脱或延长洗脱时间来达到分离目的^[17], 但其检测限低、灵敏度高^[18], 具有很高的分离效能, 且适用性相比于HPLC-MS法更为广泛。因此, 本试验选用HPLC法作为样品中硫酸头孢喹肟残留的检测方法。由于头孢喹肟结构中的胺基和羧基能在水中发生解离, 固定相表面的游离硅醇基可通过氢键或离子交换作用强烈吸附头孢喹肟, 出现色谱峰拖尾、保留值不稳定, 甚至被长期保留在色谱柱上, 从而导致峰形异常和分离度下降^[10]。本研究是建立从鸡蛋样品中检测硫酸头孢喹肟的方法, 所以必须考虑鸡蛋的物质组成、化学成分、基质脂溶性及干扰物质是不同于其他动物性食品的, 许多适用于动物组织的分析方法可能并不适用于鸡蛋样品的检测^[19]。为避免生物样品中的杂质对硫酸头孢喹肟检测的干扰, 本试验的流动相、提取和净化方法的选择都经过了多次优化^[20]。

为了提高目的峰的显示度, 本试验在确定流动相时, 依次筛选了1%、0.1%和0.01%甲酸水-乙腈和高氯酸钠溶液-乙腈等溶液。液相分析结果显示, 当选用高氯酸钠溶液-乙腈作为流动相时, 目的峰与杂质的分离效果不如添加了甲酸的流动相, 因为流动相加入甲酸后, 甲酸可通过抑制药物解离保持正常的硫酸头孢喹肟峰形和稳定的保留值。通过增减有机相和甲酸的比例, 可以达到目的峰出峰时间稳定且不受周围杂质干扰的目的, 当流动相的组成为0.05%甲酸水-乙腈(体积比12 : 1) 时(pH2.80), 以1.00 μg·mL^-1硫酸头孢喹肟标准工作液进行HPLC检测, 在270 nm的检测波长下, 目的峰分离效果最好, 可使硫酸头孢喹肟的保留时间稳定在18.5 min左右, 前后波动不超过1 min。

本试验提取液选择了不同浓度的乙腈、甲醇和1%三氟乙酸-乙腈溶液以及0.1%甲酸水-乙腈溶液等混合溶液。回收率比对结果显示, 当提取液选择甲醇或乙腈溶液时, 蛋白沉淀剧烈, 回收率不足20%;当提取液选择1%三氟乙酸-乙腈溶液时, 蛋白沉淀呈胶冻状, 回收率不足50%;尝试不同浓度的甲酸水-乙腈溶液时, 发现0.1%甲酸水-乙腈(体积比90 : 10) 时, 硫酸头孢喹肟的回收率最高, 达到80%以上, 显示该提取液去除杂质、药物保留效果较好。比对不同提取方法, 分别加入等量的0.1%甲酸水-乙腈(体积比90 : 10) 的提取液, 重复提取3次的生物样品回收率达到80%以上。因此我们将提取方法确定为以0.1%甲酸水:乙腈(体积比90 : 10) 为提取液, 且重复提取3次。

本研究在进行固相萃取柱的筛选时, 用1.00 μg·mL^-1硫酸头孢喹肟标准工作液样品滤过不同型号的固相萃取柱, 分别尝试Tri-Pak MAX、Welchrom SAX、Tri-Pak MCX、Welchrom C₁₈、Bond Elut SCX、Welchrom SCX、Speone C₁₈等色谱柱, 淋洗、洗脱方法保持不变, 进行HPLC检测。结果显示, 2种C₁₈固相萃取柱(Welchrom C₁₈和Speone C₁₈)对硫酸头孢喹肟的分离效果较好, 回收率分别在60%和75%以上。另外几种色谱柱中的样品回收率不足20%。综合考虑后认为色谱柱Speone C₁₈对硫酸头孢喹肟的分离效果最好。色谱柱在经过5 mL甲醇+5 mL水+5 mL流动相活化后, 对不同的洗脱方法也进行了比对, 分别用6 mL 50%乙腈和3 mL 50%乙腈+4 mL 90%乙腈对滤过同浓度硫酸头孢喹肟样品的色谱柱进行洗脱, 进行HPLC检测, 发现两者洗脱的样品回收率达分别为70%和90%以上。因此, 试验的洗脱方法最终确定为3 mL 50%乙腈+4 mL 90%乙腈洗脱。