南京农业大学学报  2017, Vol. 40 Issue (4): 697-702   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201608021
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徐达, 吴小卡, 荆雅玮, 左佳坤, 米荣升, 黄燕, 陈兆国, 王成明, 韩先干
XU Da, WU Xiaoka, JING Yawei, ZUO Jiakun, MI Rongsheng, HUANG Yan, CHEN Zhaoguo, WANG Chengming, HAN Xiangan
布鲁菌半胱氨酸水解酶在甲硫氨酸循环中的催化活性研究
Catalytic activity of Brucella abortus SahH in activated methionine cycle
南京农业大学学报, 2017, 40(4): 697-702
Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(4): 697-702.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201608021

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收稿日期: 2016-08-19
布鲁菌半胱氨酸水解酶在甲硫氨酸循环中的催化活性研究
徐达1,2, 吴小卡1, 荆雅玮1, 左佳坤1, 米荣升1, 黄燕1, 陈兆国1, 王成明2,3 , 韩先干1    
1. 中国农业科学院上海兽医研究所, 上海 200241;
2. 扬州大学兽医学院, 江苏 扬州 225009;
3. 奥本大学兽医学院, 美国 阿拉巴马州 36849-5519
摘要[目的]细菌的sahH基因编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SahH),该酶参与细菌的甲硫氨酸循环(AMC),调控细菌的多种生理功能。[方法]通过构建重组表达质粒pET28a-Bru-sahH和pET28a-Pse-sahH,分别表达布鲁菌(Brucella abortus)S2308株和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1株的SahH重组蛋白Bru-SahH和Pse-SahH。将纯化后的Bru-SahH、Pse-SahH以及我们前期表达纯化的禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的Pfs和LuxS蛋白,分别在体外催化S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),通过对产物同型半胱氨酸(HCY)的浓度测定,评价不同重组蛋白的催化活性,并对催化底物时产生的自诱导分子2(AI-2)活性进行检测。[结果]Bru-SahH和Pse-SahH分别催化1 mmol·L-1 SAH生成38和47 μmol·L-1 HCY,而APEC的Pfs和LuxS蛋白能催化相同浓度的SAH产生401 μmol·L-1 HCY。运用哈维弧菌BB170检测上述底物的AI-2活性,结果表明只有同时采用AEPC的Pfs和LuxS蛋白催化SAH,才能形成有活性的AI-2分子,而Bru-SahH和Pce-SahH均不能催化SAH形成活性AI-2分子。[结论]Bru-SahH能催化SAH生成HCY,为进一步研究sahH在布鲁菌感染过程中的作用提供依据。
关键词布鲁菌   甲硫氨酸循环   S-腺苷同型半胱氨酸水解酶   催化活性   信号分子AI-2   
Catalytic activity of Brucella abortus SahH in activated methionine cycle
XU Da1,2, WU Xiaoka1, JING Yawei1, ZUO Jiakun1, MI Rongsheng1, HUANG Yan1, CHEN Zhaoguo1, WANG Chengming2,3 , HAN Xiangan1    
1. Shanghai Veterinary Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China;
2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;
3. Auburn University, Auburn AL 36849-5519, USA
Abstract: [Objectives] The S-adenosylhomocysteine hydrolase(SahH)is encoded by sahH gene in Brucella abortus. SahH is a key enzyme in activated methionine cycle(AMC), which plays an important role in regulation of bacterial physiological functions. [Methods] In this study, the four recombinant proteins Bru-SahH(from B.abortus), Pse-SahH(from Pseudomonas aeruginosa), APEC-LuxS and APEC-Pfs(from avian pathogenic Escherichia coli)were purified respectively. The catalytic activity of the four recombinant proteins were evaluated by catalyzing substrate S-adenosylhomocysteine(SAH)to produce homocysteine(HCY)in vitro. [Results] The results showed that Bru-SahH or Pse-SahH could catalyze SAH(1 mmol·L-1)to produce 38 μmol·L-1 or 47 μmol·L-1 HCY, respectively, while APEC-LuxS and APEC-Pfs are 401 μmol·L-1. Furthermore, for confirming whether recombinant proteins could catalyze SAH to produce AI-2 or not, the detection of AI-2 bioassay by Vibrio harveyi strain BB170 was performed. The results demonstrated that APEC-LuxS and APEC-Pfs could catalyze SAH to produce AI-2, while Bru-SahH or Pse-SahH could not. [Conclusions] These findings will benefit for future studies on SahH regulation in Brucella abortus.
Key words: Brucella abortus    activated methionine cycle    S-adenosylhomocysteine hydrolase(SahH)    catalytic activity    autoinducer-2   

由布鲁菌感染引起的布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病, 该病严重影响畜牧业生产和人类健康[1]。甲硫氨酸作为生物体必需的氨基酸之一[2-3], 通过转甲基作用, 产生的一碳基团广泛参与蛋白质、嘌呤和嘧啶等的合成以及作为体内各种化合物甲基化的甲基来源。甲硫氨酸与ATP反应生成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM), SAM去甲基后生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine, SAH), SAH在S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase, SahH)作用下生成同型半胱氨酸(homocysteine, HCY), HCY重新生成甲硫氨酸, 该过程称为甲硫氨酸循环(activated methyl cycle, AMC)。Delahaba等[4]首次从大鼠的肝脏提取物内发现了SahH蛋白, 并发现作为AMC中重要的代谢酶, SahH具有重要的调控作用。Delahaba等[4]研究表明, SahH蛋白是SAM可逆水解成HCY反应中的功能性酶。Yang等[5]运用免疫蛋白组学鉴定出布鲁菌的SahH蛋白是一种免疫原性蛋白, 可用于布鲁菌亚单位疫苗的研制。Wu等[6]报道SahH的抑制酶是维持免疫细胞功能的关键性酶蛋白, 抑制其活性可致使免疫抑制。

此外, 在细菌中还存在另外一种AMC通路, 该通路涉及LuxS/AI-2型密度感应系统信号分子——自诱导物2(autoinducer-2, AI-2) 的产生[7]。AI-2由LuxS和Pfs催化底物SAH时产生。SAH在Pfs作用下, 产生S-核糖同型半胱氨酸(S-ribosyl-homocysteine, SRH), 而SRH在LuxS的作用下, 产生等量的HCY和AI-2, AI-2参与调控细菌耐药性以及毒力因子形成等众多生理功能[8]

本试验对布鲁菌S2308株的sahH基因进行克隆、表达以及纯化, 并验证其在AMC中的催化活性, 为进一步研究布鲁菌甲硫氨酸代谢通路的调控作用提供参考。

1 材料与方法 1.1 质粒、菌株及试剂

布鲁菌S2308株, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1株, 原核表达质粒pET28a, 禽致病性大肠杆菌DE17株pfsluxS原核基因表达载体pET28a-APEC-pfs和pET28a-APEC-luxS, 均由中国农业科学院上海兽医研究所动物源性病原生物学与食品安全创新团队实验室保存。

限制性内切酶SacⅠ、SalⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ及DNA Marker DL2000、Prime STAR Max DNA Mix均购自大连TaKaRa公司; 质粒小提取试剂盒、基因组提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司; 胶回收试剂盒购自Thermo公司; BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术公司。

1.2 重组蛋白SahH表达载体的构建及表达、纯化

参照GenBank上公布的布鲁菌S2308株(NC_007618.1) 和铜绿假单胞菌PAO1株sahH基因(NC_002516.2) 序列, 利用Primer Premier 5.0软件分别设计相应sahH基因的引物, 目的基因预期长度分别为1 401和1 671 bp, 并在上下游引物的两端分别导入SacⅠ和SalⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点(表 1)。

表 1 本研究所需引物 Table 1 Primers used for this research

将表达质粒pET28a和PCR扩增产物分别进行双酶切, 回收、连接并转化至DH5α感受态细胞中。将PCR、酶切鉴定及测序正确的重组质粒分别命名为pET28a-Bru-sahH和pET28a-Pse-sahH。将上述重组表达质粒转化BL21(DE3), 经IPTG诱导表达后, 对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。

取上述诱导表达的重组菌4 ℃离心后, 裂解菌体, 取上清液用等量的PBS缓冲液重悬, SDS-PAGE进行重组蛋白可溶性分析。

将韩先干等[9]构建的表达APEC的luxSpfs基因的重组表达质粒pET28a-APEC-luxS和pET28a-APEC-pfs转化至BL21(DE3), 经IPTG诱导表达的重组蛋白分别命名为APEC-luxS和APEC-pfs

采用美国Bio-Rad公司的高效亲和纯化层析仪纯化上述诱导表达重组蛋白, 并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯化蛋白浓度。

1.3 HCY浓度标准曲线的建立

通过测定重组蛋白APEC-LuxS、APEC-Pfs、Bru-SahH和Pse-SahH催化底物SAH后形成同型半胱氨酸(HCY)的量, 来评价其酶活性。参照文献[10]的方法并进行适当修改, 将200 μL不同浓度的同型半胱氨酸(用10 mmol ·L-1 pH7.5的PBS缓冲液稀释到1~200 μmol ·L-1)与100 μL 5 mmol ·L-1的Ellman′s试剂混匀后置于37 ℃培养箱孵育30 min, 用多功能酶标仪测量各浓度在412 nm处的吸光值(A412), 建立HCY浓度的标准曲线。

1.4 重组蛋白SahH对SAH的体外催化活性分析

将上述纯化蛋白超滤后, 在3管终浓度为1 mmol ·L-1 SAH的PBS(10 mmol ·L-1, pH 7.5) 缓冲液中, 分别加入终质量浓度为1.0 mg ·mL-1的Bru-SahH、Pse-SahH和APEC-LuxS+APEC-Pfs(阳性对照), 37 ℃培养箱孵育1 h。将反应液用拦阻相对分子质量为10×103的蛋白超滤管(Millipore公司)进行超滤, 去除反应液中的蛋白后, 取出200 μL滤液与100 μL 5 mmol ·L-1的Ellman′s试剂混匀后避光置于37 ℃培养箱孵育30 min。用酶标仪测量每组的吸光值, 参照1.3节建立的HCY浓度标准曲线, 测定每组生成同型半胱氨酸的浓度。

1.5 不同浓度的Bru-SahH体外催化SAH活性分析

在终浓度为1 mmol ·L-1 SAH的PBS(10 mmol ·L-1, pH7.5) 缓冲液中, 分别加入终质量浓度为1.0、2.0和3.0 mg ·mL-1的Bru-SahH, 37 ℃培养箱孵育30 min。参照1.4节的方法, 测定不同浓度的Bru-SahH催化SAH生成同型半胱氨酸的量, 评价不同浓度SahH对SAH催化活性的影响。

1.6 AI-2活性检测

将哈维弧菌(Vibrio harveyi)BB170于28 ℃培养至D600为3.0时, 用新配制的AB培养基以1 : 5 000稀释BB170培养物。将1.5节中反应产物超滤液在无菌条件下用0.22 μm滤器过滤后, 用于检测其AI-2活性。具体方法参照文献[11], 并适当修改。具体方法如下:900 μL的AB培养基, 加入上述无菌的各蛋白滤液100 μL, 28 ℃培养3 h后, 用多功能酶标仪的生物发光模式测定其生物发光。同时以哈维弧菌BB170培养上清液为阳性对照、大肠杆菌DH5α培养上清液为阴性对照。每组重复3次。

2 结果与分析 2.1 表达载体的构建

分别以布鲁菌S2308株和铜绿假单胞菌PAO1株基因组为模板, PCR扩增后, 分别获得大小分别约为1 401 bp和1 671 bp的产物, 测序结果表明其分别与NCBI公布的布鲁菌和铜绿假单胞菌的sahH基因序列100%同源。对构建的重组质粒pET28a-Bru-sahH和pET28a-Pse-sahH进行酶切、测序鉴定, 结果表明已成功构建上述表达载体。

2.2 重组蛋白的诱导表达和纯化及可溶性分析

将重组表达质粒pET28a-Bru-sahH和pET28a-Pse-sahH转化至BL21, 经IPTG诱导, SDS-PAGE检测结果表明, 分别获得了相对分子质量约为48×103和52×103的蛋白, 大小与预期相符(图 1)。可溶性分析表明, 重组蛋白SahH均为可溶性表达(图 1)。将表达的布鲁菌和铜绿假单胞菌的SahH蛋白分别命名为Bru-SahH和Pse-SahH。

图 1 重组蛋白Bru-SahH和Pse-SahH的表达、纯化 Figure 1 SDS-PAGE analysis of the purification of recombinant protein Bru-SahH and Pse-SahH M.蛋白标准品Protein marker; 1.表达的重组蛋白Bru-SahH Bru-SahH expression in BL21 with the plasmid of pET28a-Bru-sahH; 2.在上清液中表达的重组蛋白Bru-SahH Expression products of Bru-SahH in supernatant; 3.纯化的重组蛋白Bru-SahH Purified expression product of Bru-SahH; 4.阴性对照Negative control; 5.在上清液中表达的重组蛋白Pse-SahH Expression products of Pse-SahH in supernatant; 6.表达的重组蛋白Pse-SahH Pse-SahH expression in BL21 with the plasmid of pET28a-Pse-sahH; 7.纯化的重组蛋白Pse-SahH Purified expression product of Pse-SahH

经高效亲和纯化层析纯化后, 分别获得纯化的Bru-SahH和Pse-SahH(图 1)。BCA浓度测定结果显示:Bru-SahH和Pse-SahH蛋白质量浓度分别为4.5和3.0 mg ·mL-1

APEC-LuxS和APEC-Pfs的表达、纯化参照本实验室前期建立的方法进行。经亲和层析柱纯化后, BCA法测得蛋白质量浓度分别为1.3和2.3 mg ·mL-1

2.3 HCY浓度标准曲线的建立

通过测定不同浓度HCY与Ellman′s试剂作用后吸光值(A412), 建立了HCY的浓度标准曲线(图 2), 反应曲线方程为:y=0.027x+0.266(R2=0.999)(图 2)。

图 2 HCY的浓度标准曲线 Figure 2 Standard curve of HCY concentration
2.4 SahH对底物SAH的催化活性

100 μL 1 mg ·mL-1的Bru-SahH酶蛋白单独作用于1 mL 1 mmol ·L-1的底物SAH时, 其反应产物同型半胱氨酸(HCY)的浓度约为47 μmol ·L-1; 而当1 mg·mL-1的APEC-LuxS和APEC-Pfs酶蛋白各100 μL共同作用于底物SAH时, 反应产物中HCY的浓度约为401 μmol ·L-1, 而Pse-SahH只能催化生成38 μmol·L-1的HCY(表 2)。

表 2 重组蛋白Bru-SahH、Pse-SahH和APEC-LuxS、APEC-Pfs的生物学功能分析 Table 2 Functional analyses of recombinant Bru-SahH, Pse-SahH and APEC-LuxS, APEC-Pfs

1、2和3 mg ·mL-1 3种浓度的重组酶蛋白Pse-SahH各取100 μL分别作用于1 mL 1 mmol ·L-1的底物SAH时, 其反应产物HCY的浓度分别为38.5、84.9和183.1 μmol ·L-1(图 3)。

图 3 不同质量浓度重组酶蛋白Pse-SahH的催化活性 Figure 3 Activity analyses of recombinant Pse-SahH in different concentrations
2.5 AI-2活性检测

AI-2活性检测结果(图 4)表明:当APEC-LuxS和APEC-Pfs共同作用于SAH时, 能产生有活性的AI-2分子(以BB170培养上清液为阳性对照, DH5α培养上清液为阴性对照), 而用2种SahH作用于SAH时, 均不能产生AI-2活性分子。

图 4 自诱导物2(AI-2) 活性 Figure 4 The activity of autoinducer-2(AI-2)
3 讨论

SahH广泛存在于大多数真核和原核细胞中[4], 但在大肠杆菌等菌株中却未发现sahH基因[12-13]。通过基因敲除或者利用腺苷类似物(3-deazaneplanocin A)抑制sahH基因的表达, 可引起SAH和SAM的蓄积。此外, SahH酶的抑制剂可以激活急性髓性白细胞病的胞内发育基因, 从而阻止细胞增殖[14-15]。鉴于SahH可调控多种基因的表达, 因此可作为抗寄生虫[16]、抗关节炎[17]和抗病毒药物[18-19]的潜在药物靶点, 但迄今为止, 对SahH酶的胞内调控作用的研究依然较少[20]

本试验通过体外活性试验验证实了布鲁菌S2308株的sahH基因编码的SahH可以在体外催化SAH生成HCY, 其生物催化活性与铜绿假单胞菌SahH相当, 且呈浓度依赖性。此外, 对布鲁菌基因组的分析表明, 该菌虽然有pfs基因, 但没有luxS基因, 因此不能利用Pfs和LuxS途径进行甲硫氨酸代谢, 推测布鲁菌的甲硫氨酸代谢可能采用了sahH型甲硫氨酸代谢通路。

在大肠杆菌等细菌中, 其甲硫氨酸通路为Pfs和LuxS蛋白催化底物SAH生成AI-2。而在铜绿假单胞菌等细菌中, 由于其基因组缺少编码Pfs或LuxS蛋白的基因, 因而利用SahH催化底物SAH直接生成HCY, 该过程不产生AI-2[4, 21-23]。本试验结果表明, 布鲁菌的AMC和铜绿假单胞菌类似。推测可能是由于缺乏luxS基因, 导致Pfs的代谢产物SRH不能被LuxS降解, 而SRH蓄积具有细胞毒性, 因此布鲁菌选择SahH型代谢通路进行甲硫氨酸循环, 具体机制仍有待于进一步深入研究。

本试验通过对布鲁菌中SahH蛋白在甲硫氨酸循环中对SAH的催化活性体外验证, 证明了在布鲁菌中存在sahH型甲硫氨酸代谢通路。本试验为通过阻断布鲁菌甲硫氨酸代谢通路来对布鲁菌病进行防控和开展布鲁菌致病机制的研究提供新思路。

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