南京农业大学学报  2017, Vol. 40 Issue (4): 690-696   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201703023
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文章信息

高志参, 李照耀, 周静, 陈婧, 周斌
GAO Zhican, LI Zhaoyao, ZHOU Jing, CHEN Jing, ZHOU Bin
4个种属Mx蛋白抑制水疱性口炎病毒的研究
Research of Mx proteins from four species against vesicular stomatitis virus
南京农业大学学报, 2017, 40(4): 690-696
Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(4): 690-696.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201703023

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收稿日期: 2017-03-27
4个种属Mx蛋白抑制水疱性口炎病毒的研究
高志参, 李照耀, 周静, 陈婧, 周斌    
南京农业大学动物医学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本试验旨在研究4个种属(猪、人、小鼠、牛)Mx蛋白抗水疱性口炎病毒(VSV)的活性,以揭示胞质定位Mx蛋白抗VSV活性的保守性。[方法]设计特异性引物,PCR扩增4个种属Mx蛋白的全长基因,构建真核表达质粒;PK-15细胞过表达重组质粒,Western blot或间接免疫荧光试验(IFA)检测4个种属Mx蛋白在PK-15细胞内的表达及分布;过表达Mx蛋白的PK-15细胞感染VSV,8或16 h后收样,分别用RT-qPCR、Western blot、IFA和噬斑减少试验来分析VSV的复制。[结果]成功克隆并表达了4个种属Mx蛋白的全长基因,且Mx蛋白大小正确;虽然猪Mx1蛋白和小鼠Mx2蛋白以棒状形式分布于细胞质中,而猪Mx2蛋白、人MxA蛋白和牛Mx1蛋白以颗粒形式弥散分布于细胞质中,但4个种属Mx蛋白均能通过抑制VSV-G mRNA的转录、减少VSV-G蛋白的合成及降低子代病毒的滴度来显著抑制VSV的增殖。[结论]4个种属Mx蛋白都能显著抑制VSV在PK-15细胞中的增殖。
关键词Mx蛋白   不同种属   水疱性口炎病毒(VSV)   抗病毒   
Research of Mx proteins from four species against vesicular stomatitis virus
GAO Zhican, LI Zhaoyao, ZHOU Jing, CHEN Jing, ZHOU Bin    
College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The purpose of this research was to investigate the antiviral activity of Mx proteins from four species(porcine, human, mouse and bovine)against vesicular stomatitis virus(VSV), and to reveal the conservatism of antiviral activities of cytoplasmic Mx proteins. [Methods] Specific primers were designed to amplify full-length genes of Mx proteins from four species by PCR and then eukaryotic expressing plasmids were constructed. After PK-15 cells overexpressing the recombinant plasmids, Western blot and indirect immunofluorescence assay(IFA)was used to detect the expressing activity and distribution of Mx proteins from four species in PK-15 cells. PK-15 cells overexpressing Mx proteins were infected with VSV for 8 or 16 h and harvested. The replication of VSV was analyzed using RT-qPCR, Western blot, IFA and plaque reduction experiment respectively. [Results] The full-length genes of Mx proteins from four species were successfully cloned and expressed, furthermore, the size of Mx proteins was correct. Although porcine Mx1 protein and mouse Mx2 protein were distributed in the cytoplasm in the form of rods, the porcine Mx2 protein, human MxA protein and bovine Mx1 protein were dispersed in the cytoplasm in the form of granules, all Mx proteins from four species can significantly inhibit the proliferation of VSV by inhibiting the transcription of VSV-G mRNA, reducing the synthesis of VSV-G protein and reducing the titer of progeny virus. [Conclusions] All Mx proteins from four species can significantly inhibit the proliferation of VSV in PK-15 cells.
Key words: Mx protein    different species    vesicular stomatitis virus(VSV)    antivirus   

Lindenmann等[1-2]于1962年首次研究发现一近交小鼠品系A2G小鼠能高度抵制流感病毒的感染, 而这种抗性由16号常染色体上的单基因Mx 1控制[3]。之后, 研究人员一直探索Mx蛋白抗病毒的分子机制[4]。如同发动蛋白(dynamin)一样, Mx蛋白也是进化保守的GTP酶家族成员之一, 因此, 其也同样具有N端GTP酶结构域(G)、中央结构域(MD)和C端GTP酶效应结构域(GED), 但其缺乏参与膜定位的PH结构域和参与蛋白间互作的PR结构域[5-6]。Mx蛋白的寡聚与GTP酶水解活性都是其抗病毒活性所必需的条件。MxA蛋白晶体结构[7]显示:MxA蛋白的MD和GED共同组成了一个茎结构, 茎结构通过束信号元件(BSE)与G相联; 茎结构C端附近的Loop L4环(532~572位氨基酸)和2C12表位是MxA蛋白靶标识别病毒的重要结构, 将Loop L4环缺失掉将会损害其抗病毒活性。

Mx蛋白不但能抑制RNA病毒, 也能抑制DNA病毒。例如, 人MxA蛋白能抑制丙型肝炎病毒(HBV)[8]及非洲猪瘟病毒(ASFV)[9]的复制。另外, 不同种属Mx蛋白具有特定的抗病毒活性, 且Mx蛋白的亚细胞定位会影响其抗病毒特异性。通常胞核Mx蛋白(如小鼠Mx1蛋白)能抑制在胞核中复制的病毒(如流感病毒[10]和托高土病毒[11]等), 而胞质Mx蛋白(如小鼠Mx2蛋白)能抑制在胞质中复制的病毒(如水疱性口炎病毒[12]和汉坦病毒[13]等)。

水疱性口炎病毒(VSV)是一种线性、不分节段的单股负链RNA病毒, 属于弹状病毒科、水疱病毒属, 病毒粒子呈子弹状或圆柱状, 有囊膜。G蛋白是VSV的囊膜糖蛋白, 它在病毒识别、结合宿主细胞受体与成熟病毒粒子的出芽过程中都发挥着重要作用; G蛋白决定着VSV的毒力, 其被敲除后能降低VSV的感染性, 而G蛋白抗体能有效中和VSV; G蛋白是VSV的保护性抗原, 能诱导机体产生中和抗体, 呈型、亚型、甚至株的特异性。牛、马、猪是VSV的主要易感宿主, 患病动物多表现为口腔黏膜、舌、唇、乳头和蹄冠部上皮发生水疱[14]。人与患病动物接触也易感本病, 患者无临床症状或仅表现为轻微的流感样症状, 因此, 防控本病有一定的公共卫生意义。然而, 目前还没有较成功的商品化疫苗来防控本病。因此探索新的抗VSV途径, 研制新型抗病毒蛋白制剂显得尤为重要。

本研究拟探讨4个种属Mx蛋白(猪、人、小鼠、牛)的抗VSV活性, 这对于揭示Mx蛋白的保守性结构赋予其自身特定抗病毒特性机制具有一定的意义, 也为探索抗VSV制剂等新的抗病毒方法奠定基础。

1 材料与方法 1.1 细胞系和病毒

PK-15细胞、Vero细胞和水疱性口炎病毒(VSV, Indiana serotype)均为南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室保存。

1.2 主要试剂

RPMI-1640、DMEM、Opti-MEM营养液(Gibco公司); 胎牛血清(Gibco公司); 青链霉素(Hyclone公司); Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity、LipofectamineTM 3000 Reagent(Invitrogen公司); 核酸电泳琼脂糖、低熔点琼脂糖(Sigma公司); DNA marker(DL5000)、Hand Ⅲ、Xho Ⅰ、T4 DNA ligase、DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、Trizol试剂、PrimeScriptTM RT Master Mix、SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司); RIPA裂解液、4%多聚甲醛、结晶紫(碧云天公司); 聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、ECL化学发光检测试剂盒(Bio-Rad公司); α-Mx1单克隆抗体(能交叉识别不同种属的Mx蛋白, 有良好的保守性)、荧光二抗羊抗鼠IgG(488)、荧光二抗羊抗兔IgG(568)(Abcam公司); 羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP(Santa Cruz公司); VSV-G兔源多克隆抗体(南京金斯瑞公司); 4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、β-actin单克隆抗体(碧云天公司)。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 PCR扩增与载体构建

根据GenBank已发表的猪Mx基因(poMx 1, M65087;poMx 2, AB854078.1)、牛Mx基因(boMx 1, JQ766265) 序列及Uniprot收录的人Mx基因(HuMxA, P20591)、小鼠Mx基因(mmMx, 2Q9WVP9) 序列, 通过Primer Premier 5.0软件设计5对特异性引物(表 1), 并在上、下游引物中分别引入Hand Ⅲ与Xho Ⅰ酶切位点。以原有质粒pMD19-poMx 1、pMD19-poMx 2、pMD19-boMx 1 (本实验室保存)与pMD19-HuMxA、pMD19-mmMx 2 (中山大学肿瘤预防与控制中心高嵩教授馈赠)为模板, 利用高保真Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL:质粒300 ng, 10×Buffer 5 μL, 10 mmol·L-1 dNTPs 1 μL, 50 mmol·L-1 MgSO4 1 μL, 上、下游引物各20 pmol, 高保真Taq DNA聚合酶(1 U·μL-1)1 μL, ddH2O补至50 μL, 混匀。PCR反应条件:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 68 ℃ 2 min 30 s, 30个循环; 68 ℃ 5 min。

表 1 本文所用引物对序列 Table 1 The primer pairs sequence used in this paper

PCR扩增片段经10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳分析, 胶回收目的片段, 回收片段与空载体pcDNA3.0经Hand Ⅲ/Xho Ⅰ双酶切, 经T4 DNA连接酶连接后, 转化DH5α, 次日挑取单克隆进行菌液PCR验证, 阳性质粒经双酶切、测序鉴定, 鉴定正确的质粒命名为pcDNA3.0-poMx 1、pcDNA3.0-poMx 2、pcDNA3.0-HuMxA、pcDNA3.0-mmMx 2、pcDNA3.0-boMx 1

1.4 4个种属Mx蛋白表达活性的Western blot验证

将生长状态良好的PK-15细胞铺设6孔细胞板, 待细胞汇合至70%~90%时, 利用lipofectamine 3000转染试剂瞬时转染上述构建好的重组质粒, 转染程序按照说明书进行。37 ℃过表达24 h, 收获细胞样本进行Western blot以验证Mx蛋白的表达活性。Western blot操作步骤:4 ℃预冷的PBS洗涤细胞3次, RIPA裂解液冰上裂解细胞15 min, 收集细胞裂解液, 12 000 g 4 ℃离心10 min, 取160 μL上清液并加40 μL 5×SDS Loading Buffer, 混匀后煮沸10 min, 制得蛋白样本; 蛋白样本进行SDS-PAGF电泳, 转印PVDF膜, 10%脱脂乳室温封闭2 h; PBS洗涤后加入α-Mx1单克隆抗体, 4 ℃过夜; PBS洗涤后再加入羊抗鼠IgG-HRP, 室温1 h。最后, 用ECL发光试剂盒检测Mx蛋白的表达活性。

1.5 4个种属Mx蛋白在细胞内的分布

将生长状态良好的PK-15细胞铺设在细胞培养皿, 待细胞汇合至70%~90%时, 瞬时转染上述重组质粒, 37 ℃过表达24 h, 收获细胞样本, 进行间接免疫荧光试验(IFA)。IFA操作步骤:细胞样本先用4 ℃预冷的PBS洗涤, 再用4%多聚甲醛固定20 min; PBS洗涤, 0.1% Triton X-100透膜处理10 min; PBS洗涤, 加入10%羊血清封闭30 min; PBS洗涤, 加入α-Mx1单克隆抗体, 4 ℃孵育过夜; PBS洗涤, 再加入荧光二抗羊抗鼠IgG(488), 37 ℃避光孵育1 h; PBS洗涤, DAPI室温避光染核10 min; PBS洗涤, 60%的PBS甘油封边。最后, 用激光共聚焦显微镜观察。

1.6 4个种属Mx蛋白的抗VSV活性分析

将生长状态良好的PK-15细胞铺设在12孔细胞板, 待细胞汇合至70%~90%时, 瞬时转染上述重组质粒, 37 ℃过表达24 h, 以病毒感染复数(MOI)为0.1的量接种VSV, 分别于接毒8或16 h后收获细胞培养上清液和细胞样本, 用于以下试验。

1.6.1 RT-qPCR分析

用细胞培养上清液抽提总RNA进行RT-qPCR[15]分析。参照GenBank收录的VSV(AM690337.2) 基因全长序列, 设计1对荧光定量引物(表 1), 用于定量分析VSV-G mRNA的转录水平。用Trizol试剂抽提细胞培养上清液中的病毒总RNA, 反转录为cDNA, 进行荧光定量PCR, 具体操作步骤参照文献[16]。最后, 运用相对定量2-ΔΔCT法分析试验组相对于对照组VSV-G mRNA转录水平的变化。

1.6.2 噬斑减少试验分析

用胞培养上清液进行噬斑减少试验, 分析子代病毒滴度的变化。将细胞培养上清液10倍梯度稀释, 每个稀释度分别感染6孔细胞板中已90%汇合的Vero细胞, 37 ℃吸附1.5 h。双无营养液洗3次, 每孔添加2 mL融化的DMEM/低熔点琼脂糖预混液(含体积分数为2%的胎牛血清(FBS)及10 g·L-1低熔点琼脂糖), 4 ℃凝固5 min, 37 ℃温箱培养24~48 h。待单层细胞长出噬斑后, 用1%结晶紫染液染色2 h。轻甩掉表面的琼脂糖, 灯光下计数每孔的噬斑数并计算出病毒滴度。作图并分析试验组相对于对照组子代病毒滴度的变化。

1.6.3 Western blot分析

用细胞样本抽提总蛋白以进行Western blot分析[17]。一抗为VSV-G兔源多克隆抗体、α-Mx1单克隆抗体及β-actin单克隆抗体, 以分别鉴定VSV-G蛋白、Mx蛋白及β-actin的含量, 从而分析Mx蛋白的表达对VSV-G蛋白合成的抑制效果。

1.6.4 间接免疫荧光试验分析

取细胞样本用4%多聚甲醛固定后进行IFA观察[17]。一抗为VSV-G兔源多克隆抗体及α-Mx1单克隆抗体, 荧光二抗为羊抗兔IgG(568)、羊抗鼠IgG(488), 用以捕获细胞中的VSV-G蛋白及Mx蛋白, 从而分析Mx蛋白抑制VSV复制的活性。

2 结果与分析 2.1 PCR扩增与双酶切鉴定

PCR产物电泳结果(图 1)显示:克隆了4个种属的5个Mx基因, 分别为poMx 1 (1 992 bp)、poMx 2 (2 136 bp)、HuMxA(1 986 bp)、mmMx 2 (1 965 bp)、boMx 1 (1 947 bp)。

图 1 PCR扩增结果 Figure 1 Results of PCR amplification M.DNA marker(DL5000);1.poMx 1; 2.poMx 2; 3.HuMxA; 4.mmMx 2; 5.boMx 1

胶回收目的片段, 经酶切后连接pcDNA3.0, 构建重组表达质粒。双酶切鉴定阳性克隆结果(图 2)显示:标准序列均成功切出2条大小正确的目的条带。将酶切结果正确的重组质粒进行测序鉴定, 测序结果与目的基因进行序列比对, 结果完全正确。这说明成功构建了真核表达质粒:pcDNA3.0-poMx 1、pcDNA3.0-poMx 2、pcDNA3.0-HuMxA、pcDNA3.0-mmMx 2、pcDNA3.0-boMx 1

图 2 重组质粒的双酶切鉴定 Figure 2 Double digestion identification of the recombinant plasmids M.DNA marker(DL5000);1.pcDNA3.0-poMx 1; 2.pcDNA3.0-poMx 2; 3.pcDNA3.0-HuMxA; 4.pcDNA3.0-mmMx 2; 5.pcDNA3.0-boMx 1; 6.pcDNA3.0
2.2 4个种属Mx蛋白在PK-15细胞中的表达活性

4个种属Mx蛋白在PK-15细胞中过表达24 h后进行Western blot分析, 结果(图 3)显示:在PK-15细胞中, 4个种属Mx蛋白均成功过表达, 经鉴定, poMx1、poMx2、HuMxA、mmMx2、boMx1的相对分子质量分别为76×103、82×103、75.8×103、75×103、74.3×103

图 3 4个种属Mx蛋白在PK-15细胞中的表达分析 Figure 3 Analysis of expression of Mx proteins from four species in PK-15 cells CK:空白细胞对照Blank control
2.3 4个种属Mx蛋白在PK-15细胞中的分布

IFA结果(图 4)显示:在PK-15细胞中, poMx1蛋白及mmMx2蛋白均以棒状形式分布于细胞质中; poMx2、HuMxA及boMx1蛋白均以颗粒形式弥散分布于细胞质中。

图 4 4个种属Mx蛋白在PK-15细胞中表达分布的IFA观察 Figure 4 IFA observation of expression and distribution of Mx proteins from four species in PK-15 cells
2.4 4个种属Mx蛋白的抗VSV活性分析 2.4.1 RT-qPCR分析

结果(图 5)显示:在感染病毒8或16 h后, 相对于pcDNA3.0空载体组或阳性病毒对照组, 4个种属Mx蛋白的过表达均能极显著抑制VSV-G mRNA的转录。

图 5 4个种属Mx蛋白抑制VSV-G mRNA转录的RT-qPCR分析 Figure 5 RT-qPCR analysis of Mx proteins from four species inhibit the transcription of VSV-G mRNA pcDNA3.0:空载体阴性对照Negative control; VSV:病毒阳性对照Positive control. * * P < 0.01. The same as follows.
2.4.2 病毒噬斑分析

结果(图 6)显示:在感染病毒8或16 h后, 相对于pcDNA3.0空载体组或阳性病毒对照组, 4个种属Mx蛋白的过表达均能极显著降低子代病毒的滴度。

图 6 4个种属Mx蛋白抑制VSV复制的病毒噬斑分析 Figure 6 Virus plaque analysis of Mx proteins from four species inhibit the replication of VSV
2.4.3 Western blot分析

结果(图 7)显示:在感染病毒8或16 h后, 相对于pcDNA3.0空载体组或阳性病毒对照组, 4个种属Mx蛋白均能极显著减少VSV-G蛋白的合成, 抑制VSV的复制。

图 7 4个种属Mx蛋白抑制VSV-G蛋白合成的Western blot分析 Figure 7 Western blot analysis of Mx proteins from four species inhibit the synthesis of VSV-G protein
2.4.4 IFA分析

结果(图 8)显示:在pcDNA3.0空载体组或阳性病毒对照组, VSV感染率几乎为100%, 且病毒在胞质中复制; 而在过表达Mx蛋白组, VSV感染率极低。这说明4个种属Mx蛋白均能极显著抑制VSV的扩增, 降低其子代病毒的产量。

图 8 4个种属Mx蛋白抑制VSV增殖的IFA观察 Figure 8 IFA observation of Mx proteins from four species inhibit the proliferation of VSV
3 讨论

Mx蛋白是由Ⅰ型干扰素(IFN)(α/β)或Ⅲ型IFN(λ)诱导合成的抗病毒蛋白[18], 几乎存在于所有的脊椎动物中。如妊娠母牛Mx蛋白不仅能被Ⅰ型IFN(α/β)诱导合成, 还能被Ⅰ型IFN(t)(母牛妊娠期间产生的一种Ⅰ型IFN)诱导合成[19]; 同样, 鱼Mx蛋白能被Ⅰ型IFN但不能被Ⅱ型IFN或脂多糖诱导合成[20-21]。根据现有Mx基因序列, 除去GTP酶结构域前高度变异的N端区域, 用ClustalX 2软件构建系统进化树。系统进化树分析结果揭示不同亚科动物的Mx蛋白可以分成3个族群[22]:鱼类; 两栖动物、爬行动物和鸟类; 哺乳动物类。鱼类有1~9个Mx基因, 这种多重Mx基因可能由基因复制产生, 因为其编码蛋白更密切相关于鱼类的旁系Mx蛋白而不是鱼类的直系Mx蛋白; 两栖动物、爬行动物和鸟类为Mx单基因, 该基因可能类似于哺乳动物Mx基因的祖先; 哺乳动物出现后, 原先的Mx单基因复制成2个旁系Mx基因, 即Mx 1Mx 2 (人的又称为MxAMxB)。值得注意的是, 在系统进化树中2个啮齿类动物Mx基因属于同一个分支, 且这2个基因均与其他哺乳动物的Mx基因更密切相关。

Mx蛋白抑制病毒复制的方式迥异, 但大部分胞质Mx蛋白都能抑制VSV的复制。例如, 本课题组Zhang等[15]研究发现:原核表达的含蛋白转导域(PTD)的猪Mx1蛋白(PTD-poMx1) 经亲和纯化后, 能成功转导进Vero细胞并使其获得强烈的抗VSV活性; Maarifi等[17]研究发现:SUMO1蛋白或MxA蛋白都能通过阻断VSV的初级转录来抑制VSV的复制, 且SUMO1蛋白是通过增强MxA蛋白的寡聚和稳定性来抑制VSV增殖的, 而将MxA基因沉默后, SUMO1蛋白便不具有抗VSV活性; Sasaki等[23]研究发现:猪Mx2蛋白514位氨基酸和鸡Mx1蛋白631位氨基酸的单核苷酸多态性在抗VSV复制中发挥关键作用; Garigliany等[24]研究发现:牛Mx1蛋白转基因小鼠在感染VSV后, 其发病率和死亡率都明显降低, 而且用高表达牛Mx1蛋白转基因小鼠制备的胚胎成纤维细胞对VSV不敏感, 这都表明牛Mx1蛋白在体内(外)都能显著抑制VSV的复制; Stertz等[25]发现棉鼠Mx2蛋白而不是Mx1蛋白具有抗VSV活性; Zurcher等[26]研究发现:稳定过表达小鼠Mx2蛋白的3T3细胞系获得了强烈的抗VSV特性, 但不具有抗流感病毒活性, 而小鼠Mx2蛋白的这种抗病毒特性类似于大鼠Mx2蛋白。本文首次证明:在PK-15细胞中, 4个种属(猪、人、小鼠、牛)Mx蛋白都能通过降低VSV-G mRNA的转录来减少VSV-G蛋白的合成, 最终显著抑制VSV的增殖。

此外, 本课题组He等[27]的研究结果表明:在稳定过表达猪Mx1蛋白的PK-15细胞中, 猪瘟病毒(CSFV)的增殖受到显著抑制; 原核表达的PTD-poMx1融合蛋白转导进PK-15细胞后, PTD-poMx1融合蛋白能以剂量依赖性方式抑制CSFV的复制, 且子代病毒滴度明显降低。另外, 本课题组Zhou等[28]发现:IFN-α能以剂量依赖性方式抑制乙型脑炎病毒(JEV)的复制, 但在敲除掉Mx 1Mx2基因的PK-15细胞与BHK-21细胞中, IFN-α对乙型脑炎病毒的抑制效果并没有受到影响; 相应地, Mx1或Mx2蛋白的过表达也不会影响IFN-α抑制JEV复制的活性; 此外, 尽管布雷霉素(BFA)破坏了JEV诱导合成的运输囊泡, 但过表达Mx1或Mx2蛋白依然不能抑制JEV的增殖; 总之, IFN-α抵抗JEV感染的活性并不依赖于Mx蛋白路径。这些数据丰富完善了现有Mx蛋白抗病毒谱, 对进一步理解Mx蛋白抗病毒的作用机制有重要意义。

无论是根据Mx蛋白系统进化树分析结果, 还是根据现有研究Mx蛋白抗病毒结果, 我们可知4个种属(猪、人、小鼠、牛)Mx蛋白的保守性结构赋予自身广泛的抗病毒活性, 本文结果也证明了这一点, 这对于进一步揭示Mx蛋白抗病毒活性的分子机制具有一定的意义。同时, 以VSV为模式病毒所探索的Mx蛋白抗病毒条件, 也为进一步探索4个种属Mx蛋白抗其他病毒活性积累了一定的理论依据。

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